Vorremmo ringraziare Donald Pronto e Kevin Mosè per l&#39;insegnamento JPK la procedura di dissezione disco immaginale originale. Ringraziamo anche Bonnie Weasner per il disco genitale in Figura 1B e il disco occhio in Figura 2A, Brandon Weasner per la figura 3, il Bloomington Drosophila Stock Center per le macchie Fly e la Developmental Studies Ibridoma Banca per gli anticorpi. CMS è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), il Frank W. Putnam Research Fellowship, e Robert Briggs Research Fellowship. JPK è supportata da una sovvenzione da parte del National Eye Institute (R01 EY014863)

1 Preparazione di larve <ol><li> Riempire una capsula di Petri 35 millimetri con tampone dissezione. </li><li> Porre larve in piastra di Petri e permettere loro di nuotare in giro per alcuni minuti (step-autopulente). </li><li> Trasferimento larve ad un pool di buffer di dissezione su un piatto dissezione a base di silicone. Questa piscina deve essere di un bordo della piastra. La piastra dissezione costituita da una soluzione di silicone che è stato versato e indurito in una piastra di Petri di vetro. </li><li> Usando una pipetta pasteur-, posizionare un grande pool di buffer di dissezione nel centro del piatto dissezione. </li><li> Utilizzando # 5 pinze, trasferire un singolo larva pulita dalla piccola piscina al più grande pool di buffer di dissezione. </li></ol> 2 Coarse Dissezione di larve <ol><li> Mentre la larva è ancora all&#39;interno della grande piscina di buffer di dissezione stringere la larva con le pinze. Un paio di pinze deve essere usato per afferrare i ganci bocca, mentre l&#39;altra coppia di pinze è utilizzato per contenere la animaltri ancora (afferrare la larva dolcemente terzo lunghezza del corpo). </li><li> Hold Steady la coppia di pinze contenenti la cuticola vicino i ganci bocca mentre rapidamente tirando il resto del corpo via con la seconda coppia di pinze. </li><li> Quando la larva comincia a lacerare vi sentirete un leggero rilascio di tensione. Rilasciare la larva dalle pinze e consentire il &quot;coraggio&quot; della larva di fuoriuscire. Questo permette per i dischi immaginali a rimanere nella loro conformazione normale e impedisce loro di deformarsi. </li><li> Con una coppia di pinze afferrare nuovamente i ganci bocca per tenere l&#39;estremità anteriore della larva in posizione. Usando l&#39;altra coppia di pinze rimuovere minore due terzi delle larve comprese le viscere interne. Nota: un complesso contenente i ganci bocca, i dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, gangliari ventrale, le ghiandole salivari, alcuni dischi gamba, e la cuticola sovrastante rimarranno. </li><li> Con un paio di pinze rimuovere delicatamente la cuticola sovrastante, ghiandole salivari, dischi gamba ealtri tessuti. Nota: solo tessuto che deve rimanere è i ganci bocca, dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, e ganglio ventrale (Figura 3). </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,5 con larve supplementare per 15-20 minuti. Nota: i dischi immaginali che rimangono nel buffer di dissezione per lunghi periodi di tempo tendono a degradare e infine appariranno come meno di esemplari ideali per essere fotografati. Così, dopo un massimo di 20 minuti tutti i tessuti sezionati devono essere trasferiti al fissativo PLP (vedi sotto). </li></ol> 3 Fissazione e colorazione di tessuti con anticorpi <ol><li> Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti sezionati per un vetro da orologio contenente freddo paraformaldeide-lisina-periodato (PLP) fissativo. Limite volume di tampone dissezione trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione di PLP. Assicuratevi di tagliare la punta con una lama di rasoio in modo che l&#39;apertura punta è grande abbastanza per ospitare i tessuti sezionati. Usando un paio di pinze oun ago di tungsteno assicura che i tessuti sezionati sono completamente immersi in ordine per il fissaggio adeguato a verificarsi. Incubare tessuti sezionati a freddo PLP fissativo per 45 min. Questo incubazione può avvenire a temperatura ambiente, senza agitazione. </li><li> Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti dissezionati di tampone di lavaggio (RT) utilizzando un altro punta gialla tagliata per 45 min. Il volume Limite di PLP trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione del tampone di lavaggio. Nota: tutti i tessuti sezionati devono essere completamente sommerse. </li><li> Trasferire 20-30 insiemi di tessuto sezionato a 1,5 ml provetta da microcentrifuga. Nota: se un numero maggiore di complessi dischi occhio-antenne vengono combinati all&#39;interno del tubo, vi è la possibilità che il tessuto nella parte inferiore del tubo non sarà esposto correttamente agli anticorpi. Per ottenere risultati ottimali, non più di 20-30 complessi disco occhio-antenne dovrebbero essere presenti all&#39;interno di un singolo tubo. Il tessuto sezionato si depositerà sul fondo della provetta per microcentrifuga. Pertanto, in successive fasi di uSE una Pipetman per rimuovere e sostituire il tampone di lavaggio, soluzione bloccante, e gli anticorpi. </li><li> Rimuovere il tampone di lavaggio e sostituirlo con 100 ml di soluzione bloccante: il 10% di siero normale di capra in tampone di lavaggio. Incubare a RT con rotazione delicata su un rotatore tavolo per 10 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di blocco e sostituirlo con 100 ml di anticorpi primari che sono stati opportunamente diluito in siero normale di capra al 10%. Incubare a RT con rotazione dolce per 16 ore. </li><li> Rimuovere gli anticorpi primari e sostituirlo con 750 ml di tampone di lavaggio. Inserire provette su un nutator e lasciare nutate a temperatura ambiente per 10 min. Nota: L&#39;anticorpo primario può essere salvato (conservare a 4 ° C) e riutilizzato in seguito. Riutilizzo anticorpi più volte può aiutare a ridurre legame non specifico. </li><li> Consenti teste di depositarsi sul fondo della provetta, quindi rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 ml di anticorpi secondari che sono stati opportunamente diluiti in siero normale del 10%. Incubare a RT con rotazione delicato per 2̵1; 4 ore. </li><li> Rimuovere soluzioni anticorpo secondario da tessuto e sostituirlo con 500 ml di tampone di lavaggio. Lasciare tessuto di depositarsi sul fondo della provetta. </li><li> Uso di un P-200 e una punta di giallo taglio, trasferire tutti i tessuti sezionati a un pool di tampone di lavaggio che è stato messo sul piatto dissezione. Mentre procedere con la fase successiva di dissezione bene, il tessuto sarà incubare al tampone di lavaggio. Questo aiuta a rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso. </li></ol> 4. fine dissezione di Eye-antenne Disc Complessi e Montaggio su diapositive <ol><li> Utilizzare un paio di pinze per stringere la cuticola dai ganci bocca con il lato ventrale del complesso rivolta verso il basso. Con una seconda coppia di pinze togliere le due lobi cerebrali chiudendo la seconda pinza nello spazio tra i dischi del cervello e degli occhi (Figura 3, freccia rossa) e rapidamente tirando il cervello lontano dai ganci bocca. </li><li> Continuando a tenere su i ganci bocca, un pizzico fuoriil tessuto più vicino possibile al collegamento tra la sezione antenne del disco oculare antenne ed i ganci bocca (Figura 3, blu freccia). Nota: i complessi del disco occhio-antenne dovrebbero essere liberi di tutti i tessuti (Figura 1A). Continuare fino a quando tutto il tessuto desiderato desiderato che può essere posizionato su vetrini è stato sezionato. Questo protocollo può essere adattato per isolare ala, haltere, gamba e dischi immaginali genitali (Figura 1B-E). </li><li> Aggiungere due piccoli pezzi di carta velina (dimensione del coprioggetto) circa 3. Parte sul piatto dissezione. Posizionare un vetrino sul piatto - i due pezzi di carta velina dovrebbero essere sotto le estremità del vetrino. Questo consentirà di evitare la diapositiva da attaccare alla base di silicone del piatto dissezione. </li><li> Uso di un P-20 con una punta tagliata, aggiungere 9 ml di un agente anti-sbiancante al centro del vetrino per microscopio. Questo impedisce sbiancamento del tessuto se visto con fluorescenteluce. </li><li> Utilizzando la stessa punta tagliata, raccogliere tutti i dischi degli occhi-antenne e aggiungerli alla goccia di reagente anti-imbianchimento. Ridurre al minimo la quantità di tampone di lavaggio che viene riportato. Cercare di limitare la quantità di tampone di lavaggio a 10 ml o meno. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per separare e diffondere i dischi occhio-antenne all&#39;interno della goccia di reagente anti-imbianchimento. Lasciare i dischi di incubare in reagente anti-imbianchimento per alcuni minuti. Nota: i dischi girare chiaramente come il tessuto assorbe il reagente anti-imbianchimento. </li><li> Utilizzando un pennello fine abbassare delicatamente un coprioggetto sul campione. Ciò impedisce la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Conservare scivola a -20 ° C fino al momento di visualizzare i dischi immaginali eye-antennali o altri che utilizzano la luce o la microscopia a fluorescenza. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Anche se questa procedura è in gran parte concentrata sulla isolamento e successivo trattamento di dischi occhio-antenne, è suscettibile di essere utilizzato per isolare e analizzare l&#39;ala, haltere, gamba e dischi genitali (Figura 4). L&#39;unica modifica necessaria del protocollo per isolare questi dischi (in contrasto con il disco occhio-antenne) è il metodo della dissezione grossolana (sezione 2 del protocollo). La prima tappa (T1) coppia toracica si trova alla anteriore della larva e può ess...

Per più di un secolo il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato un sistema di premier per studiare lo sviluppo, il comportamento e la fisiologia. Sviluppo in volo può essere diviso in due grandi fasi: embrionali e post-embrionali con gran parte quest&#39;ultimo che si svolgono all&#39;interno monostrato epiteli chiamati dischi immaginali 1-3. Disegni di dischi immaginali sono stati pubblicati nel 1864 da August Weismann, come parte della sua vasta monografia sullo sviluppo degli insetti 1. Questi dischi iniziano il loro sviluppo durante l&#39;embriogenesi, vengono modellato durante gli stadi larvali, sopravvivere alla massiccia histolysis delle fasi pupa primi, e, infine, dare origine ad una elevata percentuale di strutture per adulti che si trovano dentro l&#39;adulto volare 1-14. Durante lo sviluppo larvale ogni disco rende diverse decisioni critiche per quanto riguarda il destino, forma e dimensione. Entro i primi e secondi stadi larvali, i dischi hanno il compito di adozione di un destino primario, establishing confini vano, adottando la forma corretta e generando il numero richiesto di cellule 15-16. Durante il terzo stadio larvale e precoce fase di pre-pupa, i dischi immaginali continuano a dividersi e sono modellati come le cellule adottano i loro destini morsetto 16. Durante la prima storia della Drosophila biologia dello sviluppo, dischi immaginali sono stati studiati quasi esclusivamente nel contesto dello sviluppo normale e nei casi limitati in cui una perdita o un mutante di guadagno-di-funzione era praticabile. L&#39;uso di raggi X per indurre ricombinazione mitotica permesso di mutazioni letali da analizzare in cloni di cellule all&#39;interno dei tessuti larvali e adulti. Questo metodo è stato migliorato con l&#39;introduzione di metodi transgenici per analizzare perdita e guadagno-di-funzione mutazioni in entrambi i tessuti larvali e adulti. Il numero di anticorpi, giornalisti trascrizionali e trappole di proteine ​​per descrivere il paesaggio molecolare di tipo selvatico e tessuti mutanti è anche constantly crescente. L&#39;utilizzo di questi marcatori molecolari per analizzare perdita e guadagno-di-funzione di cloni di cellule mutanti ha reso sempre più possibile per ottenere in tempo reale comprensione di come le cellule mutanti deviano dalle loro tipo cugini selvatici durante lo sviluppo. Per sfruttare adeguatamente questi strumenti e reagenti è fondamentale disporre di preparazioni di alta qualità di dischi immaginali che possono essere visualizzati, fotografati e analizzati. L&#39;obiettivo di questo manoscritto è fornire un protocollo ottimizzato per l&#39;isolamento e la preparazione del complesso disco-occhio antenne (Figura 1A). Può anche essere utilizzato con successo per isolare un&#39;ampia varietà di dischi aggiuntivi compresi quelli che danno origine alle ali, bilancieri, gambe T1-T3 e genitali (Figura 1B-E). Questa procedura, con piccole modifiche, è stato utilizzato per isolare i dischi immaginali da Drosophila per quasi 80 anni. Come descritto in precedenza, poiché la maggior parte dei geni sono espressi durante il multiple fasi di sviluppo e in una moltitudine di tessuti, è spesso impossibile studiare gli effetti che hanno sulla mutanti nulli l&#39;intero occhio, come l&#39;animale muore ben prima della fase larvale al terzo stadio. Quattro metodi hanno reso possibile lo studio dei tessuti più sviluppate, come la retina significativamente più trattabile. Il primo è il metodo flippase (FLP) / flippase Ricombinazione Target (FRT) di generare cloni di cellule mutanti all&#39;interno di un tipo di tessuto altrimenti selvaggio 17-19. In questo caso il tessuto mutante è identificato dall&#39;assenza di un marcatore visivo come proteina fluorescente verde (GFP) e può essere confrontato con il tipo selvatico tessuto circostante in cui GFP è presente (Figura 2D). Il secondo è il metodo &quot;flp-out&quot;, in cui un transgene viene espresso in una popolazione di cellule 20. In questo caso i cloni cellulari sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvatico tessuto circostante che manca il reporter GFP (Figura2E). Il terzo è l&#39;analisi Mosaico con un marcatore cellulare reprimibile (MARCM) tecnica, che combina elementi del clone mutante FLP / FRT e sistemi di espressione FLP-out 21. Con questo metodo un transgene può essere espressa all&#39;interno di una popolazione di cellule che sono simultaneamente mutante per un locus genetico individuale. Come cloni FLP-out, cloni marcm sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvaggio circostante tessuto che manca il marcatore GFP (Figura 2F). E, infine, i geni ei costrutti RNAi possono essere espressi nei tessuti immaginari sotto il controllo di specifici costrutti promotore-GAL4. Questi quattro metodi hanno aumentato l&#39;interesse per lo studio dei dischi immaginali dal cloni o modelli mutanti o over-espressione può essere direttamente confrontati con il tessuto adiacente wild type. Il metodo descritto in questa procedura è stata sviluppata in modo che i ricercatori che studiano lo sviluppo post-embrionale dei tessuti adulti in Drosophila,particolare di quelli derivati ​​dal disco occhio-antenne, sarà in grado di ottenere tessuti di alta qualità per l&#39;analisi. Anche se i singoli ricercatori hanno fatto lievi modifiche, il nucleo di questa procedura (che descriviamo qui) è rimasto sostanzialmente inalterato. Dal momento che l&#39;ottenimento di tessuti di alta qualità è fondamentale per lo studio dei dischi immaginali Ci auguriamo che questo protocollo scritto e video che accompagna serviranno come risorsa didattica preziosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:360px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Used to create base for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pryex Glass Petri Dish 150x20mm</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3160-152CO</td>
			<td>Use the cover for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Dissecting Forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>525</td>
			<td>Forceps must be kept very sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">9 well watch glass</td>
			<td>Vairous Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Stir Bar</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Conical Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml Microfuge Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clear or Dark depending upon application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge Rack</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Rotator</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>100ul volume should not splatter at low setting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Macron Chemicals</td>
			<td>2-26555-1</td>
			<td>Serves as fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-3139</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>71636</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125221000</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MTX1568-1</td>
			<td>Used to perforate imaginal discs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>SX0593-3</td>
			<td>Used to dissolve paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Normal Goat Serum`</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Serves as a blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seondary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Prevents bleaching of samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>48312-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Cover Slips 18x18mm</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe Tissue</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Panit Brush 000</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use to gently lower coverslip on to samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

Una parte significativa di sviluppo post-embrionale nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, si svolge all&#39;interno di un insieme di strutture sac-come chiamate dischi immaginali. Questi dischi danno luogo ad una elevata percentuale di strutture adulti che si trovano all&#39;interno della mosca adulta. Qui si descrive un protocollo che è stato ottimizzato per recuperare questi dischi e li prepara per l&#39;analisi con anticorpi, i giornalisti trascrizionali e trappole di proteine. Questa procedura è più adatto per tessuti sottili come dischi imaginali, ma può essere facilmente modificato per l&#39;utilizzo con i tessuti più spessi come il cervello adulto e dell&#39;ovaio larvale. Il protocollo scritto e video che accompagna guideranno il lettore / spettatore attraverso la dissezione di terza larve instar, la fissazione dei tessuti, e il trattamento di dischi immaginali con anticorpi. Il protocollo può essere utilizzato per analizzare i dischi immaginali dal più giovane primo e secondo instar larve pure. Il vantaggio di questo protocollo è che è relativamente breve e deve essereen ottimizzato per la conservazione di alta qualità del tessuto sezionato. Un altro vantaggio è che la procedura di fissazione che è impiegato funziona bene con il numero enorme di anticorpi che riconoscono le proteine ​​di Drosophila. Nella nostra esperienza, vi è un numero molto piccolo di anticorpi sensibili che non funzionano bene con questa procedura. In queste situazioni, il rimedio sembra essere quello di utilizzare una fissazione cocktail alternativo, pur continuando a seguire le linee guida che ci siamo stabiliti per le fasi di dissezione ed incubazioni anticorpi.

Il metodo descritto in precedenza in modo affidabile produce materiale di alta qualità per l&#39;analisi con sonde in situ, giornalisti trascrizionali, trappole di proteine ​​e anticorpi. In figura 1 mostriamo dischi eye-antenna, genitali, ala, haltere e gambe che vengono regolarmente recuperati con questo metodo. Questi dischi sono stati trattati con un fluoroforo falloidina coniugato, che si lega alla F-actina e quindi delinea ogni cella. Se il tessuto è stato fissato correttamente allo...

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Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.3K Views.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Video: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissezione di dischi immaginale da larve 3 Instar Drosophila

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larvali NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissezione e Montaggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; pupa Dischi Eye

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...