Vorremmo ringraziare Amsale Assicuratori per la sua assistenza in riprese di questo articolo video. Questo lavoro è stato finanziato dalla CIHR, NSERC e sovvenzioni CRC JDL.

Parte 1. Preparazione Filetto dell&#39;addome adulti Drosophila. La procedura descritta immediato sotto l&#39;addome si prepara per la successiva eliminazione del oenocytes (vedi Part2 di protocollo). La stessa procedura può essere utilizzata anche per la preparazione di altri tessuti attaccati alla superficie interna della cuticola, tra cui il vaso dorsale (cioè il cuore) e del grasso corporeo. Da notare che nell&#39;articolo il video della tecnica dissezione oenocyte è dimostrata su un adulto wild-type (Canton-S) moscerino maschio, sei giorni di età. Tecniche identici possono essere utilizzati per rimuovere il oenocytes dalle mosche di sesso femminile. La preparazione filetto addome dura circa 5 minuti per eseguire. Prima di iniziare è importante avere pronto pin diversi dissezione fine (vedi sotto e Parte 2) e un ago da dissezione (vedi parte 2). Pin dissezione disponibili in commercio e gli aghi sono spesso troppo grandi per questo protocollo, così abbiamo preso a fabbricare la nostra in laboratorio. Per creare l&#39;ago dissezione, filo di tungsteno (0,005 &quot;) è il primo threaded attraverso l&#39;albero di ago ipodermico (27G, mozzo in alluminio). Infilare il filo attraverso la punta di un ago ipodermico in modo che emerge dal mozzo. Fissare il filo sporgente dal mozzo;. questo impedisce al filo di essere tirato fuori l&#39;ago ipodermico Successivamente, tagliare il filo dalla parte opposta del crimpare tale che parecchi millimetri (~ 3-4mm) di filo sporgono dalla punta dell&#39;ago ipodermico Passing. la punta di tungsteno esposte attraverso una fiamma sarà affinare il filo ad un punto molto fine. Una pipetta di plastica usa e getta da 5 ml when incuneato nel mozzo dell&#39;ago ipodermico agisce come comoda maniglia per questo strumento di dissezione. I perni dissezione belle sono fatte in un simile modo. Dopo la fase di affinamento, afferrare la punta del filo saldamente con una pinza per impedire che si sposti e fare un taglio di circa 3 mm dalla punta per liberare il perno piccolo dissezione. Fare attenzione per evitare che pin di essere gettata dalla presa di le pinze. Per preparare il filetto addome adulto Drosophila: <ol><li> Fissare il volo alla piastra dissezione (Sylgard;-Dow Corning) inserendo un pin multa dissezione se il torace. </li><li> Rimuovere le gambe e le ali della mosca. Durante la rimozione del set più posteriore delle gambe, creare un&#39;apertura nella cuticola al punto giusto anteriore del torace, dove incontra l&#39;addome. Questa apertura è utilizzato in seguito come punto di accesso per fare un&#39;incisione lungo la superficie ventrale dell&#39;addome (vedi punto 5) </li><li> Fissare l&#39;addome della mosca sul posto mettendo un secondo perno dissezione attraverso il segmento genitale. </li><li> Coprire il volo con Shields refrigerati e Sang M3 insetti medio (Sigma). Rimuovere l&#39;aria intrappolata disegnandolo con una pipetta Pasteur. </li><li> Utilizzando pinze aperto l&#39;addome facendo un&#39;incisione lungo la linea mediana ventrale dall&#39;apertura nella cuticola creato rimuovendo le gambe al segmento genitale. Togliere il fegato e gonadi dall&#39;addome. </li><li> Sever la cuticola e trachee collega l&#39;addome al torace. L&#39;unico tessuto rimanente collega l&#39;addome al torace dovrebbe essere il cuore. Questo fornisce la cuticola addominale con una certa stabilità, e ne impedisce la rotazione o torsione durante il passo successivo. </li><li> Perno del piatto anteriore più angoli della cuticola addominale. Rimuovere il torace. Tirare la cuticola teso, pin piatti gli angoli posteriori della cuticola. Il perno del segmento genitale può avere bisogno di essere riposizionati per rendere la cuticola distesi. </li></ol> Parte 2. Dissezione Oenocyte La preparazione filetto addome espone la superficie interna della cuticola addominale e dei tessuti attaccati compreso il cuore, grasso corporeo, trachee, muscoli della parete del corpo, l&#39;epidermide, e il oenocytes. Il cuore si trova lungo la linea mediana dorsale. Grasso corporeo (tessuto opaco) copre la maggior parte della superficie interna cuticolare. Trachee (bianco strutture tubolari) si estendono dalle aperture spiraglio laterale, e fare i rami ampio che si infiltrano questi tessuti. Giacciono sotto questi tessuti, l&#39;oenocytes pigmentate (di colore ambrato cellule) irradiano dalla linea mediana verso il bordo laterale della cuticola nella regione posteriore di ogni segmento. Il oenocytes trovano direttamente sotto le regioni rese scure dal sole di ogni tergite (dorsale piastre cuticolare) e possono essere difficili da identificare senza una preventiva conoscenza della loro posizione. Un&#39;altra popolazione di oenocytes ventralmente trova è associato con il sterniti (ventrale piastre cuticolare), anche se è possibile isolare queste cellule, questo protocollo video solo dimostrare la dissezione del oenocytes dorsale. In ogni segmento addominale, una foglia di spicco del tessuto grasso corporeo si trova anteriormente al oenocytes; una foglia più piccola meno evidente di grasso corporeo è posteriore al oenocytes. La foglia di spicco del tessuto grasso corporeo spesso copre il oenocytes del segmento che lo precede. Il vaso dorsale e il corpo grasso deve essere rimosso in primo luogo per esporre il oenocytes. E &#39;importante notare che la pigmentazione ambra del oenocytes, da cui il loro nome deriva (eno - dal greco Oinos,&#39; vino &#39;) 1, distingue chiaramente queste cellule dai tessuti circostanti, l&#39;intensità della pigmentazione aumenta con l&#39;età della mosca. Inoltre, una lamina basale ensheathes il oenocytes 2,3, fornendo supporto per i cluster di cellule e impedendo alle cellule di diventare dissociata durante la dissezione. La lamina basale aiuta anche nella rimozione di tessuti extraneously aderito, come il tessuto grasso corporeo, creando un punto debole in cui tali adesioni possono essere facilmente perturbato. La procedura descritta di seguito fornisce istruzioni dettagliate per la rimozione del oenocytes dal tegumento addominale. Il oenocytes può essere facilmente rimosso dalla segmenti addominali 2-5 (maschio), e 2-6 (femmina). Il oenocytes dai segmenti addominali prima e l&#39;ultima (segmenti 1, e 6 nei maschi o 7 nelle femmine) sono spesso interrotta da i pin dissezione tenendo gli angoli della cuticola e sono quindi evitati. La rimozione del oenocytes dura circa 10 minuti per eseguire. Per isolare il oenocytes adulti: <ol><li> Tagliare i tronchi tracheali provenienti dal spiracoli usando un ago dissezione. </li><li> Togliere il grasso corporeo e il cuore da recidere le connessioni con la superficie interna della cuticola con un ago da dissezione. Per farlo, posizionare il punto dell&#39;ago dissezione tra il corpo grasso e il oenocytes, e trascinarlo dal bordo laterale della cuticola, fino alla linea mediana, in movimento sotto il cuore, e continuando a lato opposto. Progredendo dal anteriore a posteriore, rimuovere il tessuto grasso corporeo e il cuore dalla cuticola di ogni segmento successivo. Se eseguita correttamente il oenocytes rimangono attaccati alla cuticola, e il grasso corporeo e il cuore può essere rimosso tutto. </li><li> Parete del corpo i muscoli della cinghia oenocytes alla superficie interna della cuticola. Utilizzando l&#39;ago dissezione rompere il muro longitudinale muscoli del corpo di ogni segmento. Per fare ciò, trascinare l&#39;ago dissezione lungo il lato posteriore del filamento oenocyte, sollevando delicatamente dalla superficie della cuticola. I fili oenocyte nastro come dovrebbe venire via dalla cuticola e può essere posato su un fianco mentre i restanti oenocytes vengono rimossi. </li><li> Una volta tolto dal cuticola, che giace sul piatto dissezione può essere necessario per pulire ogni aderito al tessuto di grasso corporeo dal oenocytes. Questo viene fatto semplicemente posizionando l&#39;ago dissezione tra il tessuto grasso corporeo e la oenocytes, e recidendo la connessione premendo l&#39;ago verso il basso e contro la piastra dissezione. </li><li> Raccogliere i fili oenocyte semplicemente li frugando con la fine dell&#39;ago dissezione. Una volta attaccato alla fine l&#39;ago della dissezione oenocytes può essere tirato lentamente sulla superficie del terreno di coltura. Il oenocytes sezionato può essere posizionato direttamente nel buffer di lisi cellulare appropriato sia per estrazione RNA o proteine. Si noti che il oenocytes (segmenti addominali 2-5) da una mosca singolo maschio produce tipicamente 15-20ng di RNA totale. </li></ol> Figura Legenda: <img src="/files/ftp_upload/2242/2242fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Espressione dei geni desaturasi, desat1 e desatF, in oenocytes maschili e femminili di D. melanogaster. trascrizione inversa-PCR amplificazione di desat1 e desatF da cDNA derivati ​​da adulti oenocytes maschile e femminile. Il gene è espresso in desat1 oenocytes sia maschili che femminili; espressione desatF è dimorfismo sessuale, espressi esclusivamente in oenocytes femminile. Corrispondenti a queste differenze di espressione genica, desat1 è necessario per la produzione di composti di idrocarburi comune a maschi e femmine 9 e desatF è coinvolta nella produzione di femmina-specifici composti di idrocarburi 10,11. DesatF ha dimostrato di essere specificatamente espresso in oenocytes femminile in 12 ibridazione in situ. Si noti che, in media 15-20ng di RNA totale si ottiene dalla oenocytes sezionato da un singolo volo. RNA è stato isolato utilizzando il RNeasy micro kit (Qiagen); cDNA è stata prodotta utilizzando il qScript cDND sintesi kit (Quanta BioSciences)

<ol>
	<li>Wielowiejski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ueber+das+blutgewebe+der+insekten.">Ueber das blutgewebe der insekten.</a> Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 .</li><li>Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+experience+modifies+pheromone+expression+and+mating+behavior+in+male+Drosophila+melanogaster.">Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster.</a> Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).</li><li>Locke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+membranes,+Golgi+complexes,+and+vacuolar+systems.">Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems.</a> Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).</li><li>Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+cells+tag+sexual+and+species+identity+in+Drosophila+melanogaster.">Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 461, 987-991 (2009).</li><li>Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+oenocytes:+a+model+system+for+studying+cell-fate+specification+by+Hox+genes.">Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes.</a> J. Anat. 199, 25-33 (2001).</li><li>Lawrence, P. A., Johnston, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+the+Drosophila+abdomen:+the+epidermis,+oenocytes+and+ventral+muscles.">Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).</li><li>Johnson, M. B., Butterworth, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+aging+of+adult+fat+body+and+oenocytes+in+Drosophila+as+revealed+by+light+microscopic+morphometry.">Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry.</a> J. Morphol. 184, 51-59 (1985).</li><li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism.">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445, 275-280 (2007).</li><li>Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+with+major+effects+on+Drosophila+melanogaster+sex+pheromones.">A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones.</a> Genetics. 171, 1617-1628 (2005).</li><li>Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+female-specific+desaturase+gene+responsible+for+diene+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behaviour+in+Drosophila+melanogaster.">A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster.</a> Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).</li><li>Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+desaturase+involved+in+female+pheromonal+cuticular+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behavior+in+Drosophila.">Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila.</a> Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).</li><li>Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+sex+pheromone-producing+enzyme+expression+in+Drosophila.">Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo vi presentiamo il video di un protocollo dettagliato dissezione per la preparazione della oenocytes da adulto D. melanogaster, in modo idoneo per l&#39;analisi molecolare. Un testo basato su abbreviato conto del metodo di dissezione è stata descritta in altri 2, e la preparazione risultante oenocyte ha dimostrato di essere adatto per l&#39;estrazione di RNA e proteine ​​sia 2. Utilizzando questa preparazione può anche essere possibile sviluppare metodi per la coltu...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>27-11</td>
<td>0.005&#x201D;/20&#x2019;</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>11252-30</td>
<td>#5</td>
</tr>
<tr>
<td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3652</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>qScript cDNA Synthesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quanta Biosciences</td>
<td>95047-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoject Hypodermic Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>722289</td>
<td>20G1 with aluminum hub</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of oenocytes from adult drosophila melanogaster

In<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Come in altri insetti, uno strato di cera sulla superficie esterna della cuticola, composta principalmente da composti di idrocarburi, fornisce una protezione contro l&#39;essiccamento e altre sfide ambientali. Molti di questi composti di idrocarburi cuticolare (CHC) funzionano anche come segnali semiochemical, e come tale feromonali mediare la comunicazione tra i membri della stessa specie, o in alcuni casi tra le diverse specie, e modificare i comportamenti. Cellule specializzate denominate oenocytes sono considerati come il sito primario per la sintesi CHC. Tuttavia, relativamente poco è conosciuto riguardo il coinvolgimento del oenocytes nella regolazione della biosintesi, trasporto e deposizione di percorsi che contribuiscono alla produzione CHC. Considerato il ruolo significativo che CHC giocare in diversi aspetti della biologia degli insetti, compresa la comunicazione chimica, resistenza essiccazione, e l&#39;immunità, è importante per ottenere una maggiore comprensione del regolamento molecolare e genetica della produzione CHC all&#39;interno di queste cellule specializzate. Il oenocytes adulti<em&gt; D. melanogaster</em&gt; Si trovano all&#39;interno del tegumento addominale, e sono disposte in metamerically nastro come grappoli irradia lungo la superficie interna cuticolare di ogni segmento addominale. In questo articolo il video si dimostra una tecnica di dissezione utilizzati per la preparazione di oenocytes da adulti<em&gt; D. melanogaster</em&gt;. In particolare, forniamo un dettagliato passo-passo di dimostrazione (1) come preparare Filetto di un adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Addome, (2) come identificare le oenocytes e discernere loro di altri tessuti, e (3) come rimuovere intatta cluster oenocyte dal tegumento addominale. Una breve illustrazione sperimentale di come questa preparazione può essere utilizzato per esaminare l&#39;espressione di geni coinvolti nella sintesi di idrocarburi è incluso. La preparazione sezionato dimostrato nel presente documento consentirà l&#39;analisi dettagliata molecolare e genetica della funzione oenocyte nel moscerino della frutta adulti.

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Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Negli insetti, la oenocytes produrre composti di idrocarburi cuticolare. Questi composti proteggono essiccazione e facilitare la comunicazione chimica. Qui mostriamo una tecnica di dissezione utilizzati per isolare il oenocytes da adulti<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Ed illustrare come questa preparazione può essere utilizzata per studiare i geni coinvolti nella sintesi di idrocarburi.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

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JoVE Journal

Biology

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

20.3K Views.  University of Toronto. Negli insetti, la oenocytes produrre composti di idrocarburi cuticolare. Questi composti proteggono essiccazione e facilitare la comunicazione chimica. Qui mostriamo una tecnica di dissezione utilizzati per isolare il oenocytes da adulti Drosophila melanogaster, Ed illustrare come questa preparazione può essere utilizzata per studiare i geni coinvolti nella sintesi di idrocarburi.

Video: Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

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Ricerca

Biologia

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissezione di dischi immaginale da larve 3 Instar Drosophila

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Registrazioni cella intero cervello di adulti Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

L&#39;insulina per iniezione ed estrazione emolinfa per misurare la sensibilità all&#39;insulina nei adulti Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...