Ringraziamo i membri del laboratorio Wobus per i commenti critici e suggerimenti. Il lavoro nel laboratorio di CEW è stato finanziato da fondi di start-up presso la University of Michigan, una borsa di sviluppo di carriera dal NIH / NIAID Centro Regionale di Eccellenza per la Bio-difesa e di ricerca emergenti Malattie Infettive (RCE) Programma, Regione V &#39;Grande Laghi &#39;RCE (NIH aggiudicazione 1-U54-AI-057153) e NIH R01 AI080611. MBG-H. è stato finanziato dalla Immunologia Sperimentale (NIH T32 A1007413-16) e dei meccanismi molecolari nella patogenesi microbica (NIH T32 A1007528) borse di formazione per l&#39;Università del Michigan. JBC è stato finanziato dalla coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brasile.

1. Coltura della linea cellulare di macrofago RAW 264,7 <ol><li> Mantenere cellule RAW 264,7 (ATCC, catalogo # TIB-71) in DMEM-10 media, che consiste di glucosio DMEM alto con 10% (v / v) a bassa endotossina siero fetale bovino (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1 mM aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina. Cellule sono tipicamente mantenuti in fiasche tessuto 175 cm 2 coltura contenenti 35 ml di mezzo per pallone e incubate a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore di coltura tissutale. Tuttavia, qualsiasi dimensione pallone può essere utilizzato con un volume di mezzi appropriati per la dimensione del pallone. </li><li> Per dividere le celle: aspirare fuori vecchi media, aggiungere 10 ml di DMEM fresco-10 supporto alle cellule, e poi raschiare le cellule dal fondo del pallone utilizzando un raschietto cellula. Avanti, risospendere le cellule in una soluzione omogenea mediante l&#39;elaborazione di celle in una pipetta da 10 ml e con forza spremitura delle cellule attraverso la punta della pipetta pressed contro il fondo del pallone. Ripetere questa operazione almeno 3 volte in modo che le cellule non sono più ammassarsi. Verificare mediante microscopia ottica che una sospensione singola cella è stato generato. Poi trasferire 1 ml (diluizione 1:10 o ~ 1x10 7 cellule) - 2 ml (diluizione 1:5 o ~ 2x10 7 cellule) della sospensione cellulare a un nuovo pallone da 2 175 centimetri, e portare il volume finale di supporti fino a 35 ml. </li><li> Le celle divise quando sono quasi confluenti (~ 1x10 8 celle total/175 cm 2 flaconi): ogni tre giorni se a partire da una diluizione 1:10, o ogni due giorni se a partire da una diluizione 1:5. Utilizzare microscopia ottica per controllare la morfologia cellulare prima divisione delle celle. La maggior parte delle cellule dovrebbe essere rotonda e non attivata. Cellule attivate hanno granuli e / o estese, esile morfologia con appendici. Non lasciate proliferare cellule come quelle cellule in genere non formare placche. Tenere traccia del numero di passaggio e spesso ricominciare da scongelare un&#39;aliquota passaggio inferiore di cellule. (Usiamo passaggio 30 come un cut-off). </li></ol> 2. Infect RAW 264,7 cellule con MNV inoculo <ol><li> Seed RAW 264,7 cellule in piastre da 6 pozzetti (diametro 3,5 cm) ad una densità di 1x10 6 cellule vitali / ml in DMEM-10 media, e aggiungere 2 ml di questa sospensione in ciascun pozzetto. È importante distribuire uniformemente cellule in pozzetti mediante piastre oscillare manualmente almeno 10 volte o utilizzando un apparecchio a dondolo per ~ 10 min. Non agitare il piastre come questo farà sì che le cellule a raggrupparsi al centro del pozzo. Piastre luogo in un incubatore di coltura tissutale (a 37 ° C e 5% CO 2). Permettere alle cellule di allegare notte o per almeno 4 ore a 37 ° C. Cellule dovrebbe essere di 60 - 80% confluenti per il saggio di placca e distribuiti uniformemente in tutto il pozzetto. </li><li> Il giorno successivo, preparare l&#39;inoculo del virus, che può essere da MNV cellule infettate in coltura o da tessuti omogeneizzati o campioni fecali di MNV topi infettati. Quando si utilizzano campioni di tessuto, pisello piECEs di tessuti vengono omogeneizzati in 2 ml con tappo a vite provette sterili contenenti sfere di silice in 1 ml di DMEM-10 usando un omogeneizzatore tessuto (MagnaLyser eg; Roche). Per i campioni di feci, non più di 3 palline fecali devono essere omogeneizzati in 1 dei media ml. Tutti i campioni vengono poi congelati (a -80 ° C) e una volta scongelati prima di effettuare il saggio di placca. </li><li> 10 Preparare diluizioni del virus inoculo in DMEM completo-5 medie, che consiste di DMEM / glucosio Alto, 5% (v / v) a bassa endotossina siero bovino fetale (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1 mM aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina. </li><li> Diluizioni seriali di dieci volte vengono preparati in piastre da 24 pozzetti: Una pipetta ripetitore viene usato per erogare supporto 1,35 ml per pozzetti multipli, la diluizione 10 -1 è ottenuto miscelando 1,35 ml di media e 0,15 ml di campione contenente virus, e poi 0,15 ml della diluizione 10 -1 è aggiunto 1,35 ml di mezzi per rendere il 10 -2 dilution e così via. E &#39;importante cambiare gli aghi ogni volta che si effettua una nuova diluizione. Una pipetta multicanale può essere usato per fare le diluizioni di campioni multipli contemporaneamente con due punte raccordo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti trasferire un volume totale di 0,15 ml per pozzetto (vedi Figura 3A). </li><li> Una gamma di diluizione tipico per omogenati di tessuto e contenuti fecali è 10 -1 a 10 -3. Tuttavia, placche da questi campioni tendono ad essere più piccoli rispetto a quelli da campioni di coltura tissutale. Inoltre, in alcuni casi una diluizione 1:100 di campioni di feci è necessaria per diluire sufficientemente eventuali componenti tossici delle feci che possono disturbare il monostrato di cellule, impedendo la capacità di contare placche. La gamma di diluizione di lisato di coltura tissutale dipende dal punto di tempo di interesse durante il ciclo vitale del virus. Le diluizioni che vanno fino a 10 -9 possono essere necessarie al picco di infezione. </li><li> Dopo le diluizioni seriali vengono preparati, etichettare la piastra da 6 pozzettis contenente RAW 264,7 monostrati (a partire da sezione 2.1) con il nome del campione e diluizioni di essere placcato. Una piastra alla volta, rimuovere tutti i supporti muovendo fuori o aspirazione esso. Subito dopo aggiungere 0,5 ml di un campione diluito a un bene, poi ripetere con un duplicato bene, prima di procedere alla diluizione successiva. Una volta che tutti e 3 diluizioni vengono aggiunti a una piastra, piastra inclinazione in avanti e indietro con le mani per assicurare tutte le cellule sono state coperte. Gestire una piastra alla volta per assicurarsi che le cellule non si secchino. </li><li> Dopo aggiunta di 0,5 ml delle diluizioni in ogni pozzetto, impilare piastre eretta e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Poiché il volume aggiunto a ciascun pozzetto non è sufficiente a coprire completamente il monostrato, le piastre devono essere leggermente inclinato in avanti e indietro manualmente ogni 10-15 minuti o posto su un apparecchio a dondolo (~ 18 oscillazioni al minuto). Questo impedisce alle cellule di essiccazione. </li></ol> 3. Basso punto di fusione agarosio (SeaPlaque) Preparazione Overlay <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nota: è consigliabile avere diverse bottiglie con autoclavato SeaPlaque agarosio preparato in anticipo. Agarosio può essere rifuso in un forno a microonde prima dell&#39;uso. <ol><li> Calcolare la quantità di sovrapposizione necessaria per il volume totale di piastre prima incubazione 1 ora è completa. Il volume necessario è di 2 ml / pozzetto o 12 piastra ml/6-well. Preparare agarosio (vedi paragrafo 3.2) e dei media (vedi sezione 3.3) a parte. </li><li> Per preparare l&#39;agarosio, 3 g di sospendere SeaPlaque agarosio in un volume totale di 100 ml di acqua distillata (3% w / v) in una bottiglia di vetro. Autoclave per 20-30 min. (Se agarosio è stato già preparato prima mano, re-melt agarosio in microonde.) È importante equilibrare SeaPlaque agarosio a 42 ° C in un bagno di acqua prima dell&#39;uso perché se l&#39;agarosio è troppo caldo, ucciderà le cellule. Assicurarsi che il livello dell&#39;acqua è uguale o superiore al livello di agarosio per evitare la solidificazione indesiderato. </li><li> Preparare il dispositivo: fare 100 ml di MEM 2x supporti, che consiste2x MEM, 10% (v / v) a bassa endotossina siero bovino fetale (&lt;10 EU / ml), 10 mM di HEPES, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 4 mM di L-glutammina. Equilibrare supporti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Mescolare sia il SeaPlaque agarosio ei media MEM 2x insieme in una bottiglia sterile con un rapporto 1:1 immediatamente prima sovrapponendo i monostrati di cellule infette. Se più di 200 ml di sovrapposizione è necessaria, volume diviso in più bottiglie e tenere a 37 ° C in bagno di acqua fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Al termine della incubazione 1 ora (vedi sezione 2.7), aspirare l&#39;inoculo off di ciascun pozzetto. Lentamente aggiungere 2 ml di sovrapposizione al bordo di ciascun pozzetto posizionando la punta della pipetta contro la parete di ogni pozzetto. Fino a 5 piastre può essere trattato simultaneamente senza cellule essiccazione. </li><li> Consentire la sovrapposizione solidificare per circa 10 min a temperatura ambiente prima di piastre montante nel tessuto incubatore. Incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Dopoil periodo di incubazione, le placche sono debolmente visibili ad occhio nudo, in modo da controllare le piastre non marcate per presenza di placche. Se non placche sono visibili, incubare per ulteriori 4 ore e controllare di nuovo. Tuttavia, il tempo di incubazione massimo non dovrebbe superare 72 ore. </li></ol> 4. Visualizzazione di placche da Neutral colorazione Red <ol><li> Per visualizzare placche, la soluzione neutra colorazione rossa viene preparato aggiungendo 3 ml di rosso neutro (0,33% w / v in DPBS, Sigma, catalogo # N2889) per ogni 97 ml di PBS 1x (coltura tissutale grade, Mg 2 + -, Ca 2 + - gratuito; Gibco, catalogo # 10010). Calcolare il volume di soluzione colorante rosso neutro necessario per l&#39;esperimento: 12 ml di soluzione neutra colorazione rossa sono obbligatori per ogni piastra da 6 pozzetti. Quindi, aggiungere 2 ml a ciascun pozzetto. Sebbene alcuni protocolli placca test richiedono il plug agarosio essere rimosso dai pozzetti, in questo protocollo soluzione neutra colorazione rossa viene aggiunto direttamente sulla sovrapposizione. </li><li> Dopo un hr uno incubation a 37 ° C, controllare se le placche sono visibili con neutro soluzione colorante rosso ancora in pozzi. Se placche non sono immediatamente evidenti, permettono la colorazione di continuare per un&#39;altra ora. Continuare l&#39;incubazione fino a placche sono visibili. (Nota:. Colorazione per più di 3 ore non è ottimale e se non placche sono visibili nel campione di controllo positivo dopo 3 h di colorazione, il saggio di placca non funzionava correttamente) Dopo la colorazione è completa, aspirare la soluzione di colorazione rosso neutro , garantendo la spina agarosio non è disturbato, e poi procedere a contare le placche. </li><li> Contare placche mettendo piatto a testa in giù su una scatola di luce e segna un punto su placche contati per evitare la conta duplicati. Scegliere la diluizione di contare placche nei pozzi in cui placche sono chiaramente separati (vale a dire senza la prova visiva di fusione placche insieme). Se possibile, contano placche a due diluizioni. È importante notare che la dimensione di placca può variare tra ceppi MNV, inoculo del virus, e dipende dallacondizione delle RAW 264,7 cellule durante il saggio di placca. </li><li> Se non sono visibili placche in un pozzo, o non c&#39;era virus presente nel campione o la quantità di virus è sotto il limite di rilevazione del saggio di placca. In questo caso, i pozzetti macchia rossa con un colore simile a placche contenenti altri pozzetti. In alternativa, l&#39;assenza di placche si osserva anche quando ci sono troppe particelle virali presenti in una data diluizione. Questo porta alla lisi del monostrato intero e pozzi appaiono arancione / colore giallo. </li><li> Calcolare i titoli virali. Aggiungere il numero di placche sia in pozzi a una singola diluizione e moltiplicare per il fattore di diluizione (cioè 1 ml se 2 pozzi sono infettate con 0,5 ml). Ciò produrrà la quantità di unità formanti placche (PFU) nel volume di inoculo di 1 ml. Ad esempio, in figura 4 alla diluizione 10 -2, un pozzetto (marcato &quot;II&quot;) ha 14 placche e ben altra (contrassegnata &quot;V&quot;) ha 17 placche. Così, il titolo virale sarà 14x10 17x10 2 + 2 = 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Infettive MNV-1 particelle può essere quantificato utilizzando un saggio di placca come illustrato schematicamente nella figura 1. Figura 2A mostra un pozzo con un monostrato di cellule RAW 264,7 poco prima dell&#39;infezione, mentre la figura 2B mostra tre placche visibili indicati dai numeri romani I, II e III in un pozzo. Singole fasi del saggio sono rappresentati nelle figure 3A a F. La Figura 3A mostra la preparazione di 10-fold serie di diluizioni di un campione contenente virus. Figura 3B mostra il trasferimento di diluizioni per duplicare i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. Figura 3C mostra l&#39;apparato dondolo usato per incubare le cellule RAW 264,7 con l&#39;inoculo a temperatura ambiente per 1 ora la figura 3D mostra celle essendo sovrapposto al SeaPlaque:. MEMmiscela. Figura 3E mostra una piastra a temperatura ambiente per permettere la sovrapposizione di solidificare, mentre la figura 3F mostra cellule di essere trattata con un 0,01% soluzione rosso neutro 48 ore più tardi. Dopo colorazione delle cellule per 1-3 ore e aspirando la soluzione neutra colorazione rossa, placche sono visibili e possono essere contati (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del protocollo di saggio di placca MNV. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figura 2. Immagini rappresentative di un pozzo di un monostrato prima infezione e dopo la formazione di placche. A) RAW 264,7 cellule sono state coltivate durante la notte e con immagini al microscopio ottico a 20x. B) Le cellule sono state colorate con una soluzione allo 0,01% di rosso neutro dopo 48 hr di infezione e visualizzati sotto un microscopio ottico con ingrandimento 4x. Numeri romani I, II, e III indicano tre placche visibili. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini rappresentative delle varie fasi saggio di placca. A) MNV-1 &#39;inoculo va preparato in 10 diluizioni. B) si aggiunge inoculo monostrati di cellule in pozzetti in duplicato. C) Cellule e inoculo incubate agitando per 1 ora a temperatura ambiente. D) Le cellule sono sovrapposti con una miscela 1:1 di SeaPlaque agarosio e 2x MEM media. E) Le piastre vengono incubate per 10 min a temperatura ambiente per permettere la sovrapposizione di solidificare. F) La colorazione delle cellule con la soluzione di colorazione rosso neutro 48 ore post-infezione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figura 4. Targhe MNV-1 forme in cella monoLayers. Qui è un rappresentante piatto saggio di placca a 48 ore dopo l&#39;infezione, che mostra placche colorate con neutro soluzione colorante rosso dopo 1 ora di incubazione. La tavola mostra i pozzetti in duplicato di tre 10-diluizioni. Wells etichettati con numeri romani I e IV corrispondenti alla diluizione 10-1, II e V corrispondono alla diluizione 10-2, III e VI corrispondono alla diluizione 10-3. Il titolo virale del campione è indicato di seguito (si veda la Sezione 4.5 per i dettagli del calcolo).

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di analisi per la targa MNV-1 qui presentato è un modo di quantificare particelle infettive MNV. Seguendo la procedura del saggio illustrato in figura 3, si possono ottenere i titoli virali riproducibili. Il limite di rilevazione del test dipende dalla diluizione di partenza utilizzato. Quando si inizia con una diluizione 1:10 del campione come descritto sopra, il limite di rilevazione del saggio di placca è 10 pfu (cioè, 1 placca visibile a -1 10 diluizione). Poiché ogni placca rappresenta un singolo virus, il saggio di placca può anche essere usato per purificare popolazioni clonali di MNV sollevando placche isolate e moltiplicazione come descritto in precedenza 1. Inoltre, purificazioni placca può anche essere utilizzato per separare una singola popolazione virus da popolazioni miste virus. Una limitazione di utilizzo di un saggio di placca per la rivelazione di infezione MNV è che non tutti i ceppi MNV formare placche 4. Tuttavia, può essere possibile superare la inabilità di alcuni ceppi MNV, isolati da animali, per formare placche in modo seriale passaging questi virus in coltura 7. In alternativa al saggio di placca è misurare particelle infettive tramite TCID 50 tecnica 3, 4. Questo test quantifica la quantità di virus necessaria per produrre CPE nel 50% delle cellule del tessuto inoculate colture seguenti diluizioni endpoint e prende 1 settimana a completare per MNV 4. Oltre ad essere più lenta di un saggio di placca, la TCID 50 saggio è così sensibile (limite di rilevazione = 200 TCID 50 / ml) a causa della tossicità dei campioni di tessuto di cellule RAW 264,7 4. Anche se i passaggi critici nell&#39;ambito del protocollo sono stati descritti in tutto il protocollo, la sezione seguente fornisce una sintesi per facilitare la risoluzione dei problemi. La fase più critica del protocollo è quello di garantire che RAW 264,7 cellule rimangono vitali durante tutta la seduta di sostenere la replicazione del virus. Questo puòessere monitorato in ogni fase del test tramite microscopia ottica. La vitalità cellulare è assicurata in due modi. In primo luogo, si deve prestare attenzione a non far asciugare le cellule durante la manipolazione di lamiere. Così, le piastre vengono inoculati uno alla volta, scosso durante il periodo di infezione, e deve rimanere chiuso quando non sono stati trattati. In secondo luogo, le soluzioni aggiunto su cellule devono essere equilibrati a ~ 37 ° C. Inoltre, è essenziale per la salute generale delle cellule RAW 264,7 mantenerle in terreni contenenti siero partire endotossina (&lt;10 EU / ml), che limita l&#39;attivazione delle cellule. Inoltre, abbiamo osservato un tasso di fallimento superiore del saggio di placca usando cellule dal passaggio 30 o superiore. Anche se questo probabilmente variano da laboratorio a laboratorio, è importante includere un controllo positivo (ad esempio, un campione con un titolo virale noto) per garantire titoli riproducibili, soprattutto quando si utilizzano più elevati passaggio RAW 264,7 cellule. Per limitare l&#39;uso di cellule di passaggio più elevati, si consiglia di congelare fiale del primo Passacellule ge dopo il ricevimento del RAW 264,7 cellule e iniziare una nuova cultura dai flaconi congelati frequentemente. Si riparte con colture cellulari a basso passaggio sarà anche utile quando le cellule presentano caratteristiche alterate, come ad esempio il mancato rispetto, i cambiamenti della morfologia cellulare (ad esempio, da rotondo a esile ed estesa), o quando la contaminazione da micoplasma è stato rilevato. Un altro punto importante da prestare attenzione è di garantire che i puntali delle pipette sono cambiati tra i campioni e durante le diluizioni. In questo modo garantire l&#39;accuratezza dei diluizioni seriali e prevenire la contaminazione incrociata tra i campioni. Di un passo nel protocollo in cui il puntale stesso può essere utilizzato nuovamente quando diluizioni seriali dello stesso campione vengono aggiunti ai pozzetti. In tal caso, si deve partire da l&#39;inoculo più diluito al minimo, e vigorosamente pipettare su e giù al momento di elaborare una nuova diluizione. Il protocollo del saggio placca è modificabile di numerose modifiche. Una modifica che possono essere effettuate quando tqui non sono cellule sufficienti per vaccinare i pozzi in duplice copia è di inoculare solo un singolo pozzo per ogni diluizione. Tuttavia, poiché il volume dell&#39;inoculo è 0,5 ml, il numero di placche deve poi essere moltiplicato per un fattore di 2 per normalizzare a pfu / ml. Il saggio di placca può anche essere adattato per l&#39;uso con qualsiasi altra linea cellulare aderente che è in grado di supportare la replica di MNV, e questo è stato descritto per la linea murina microglia BV-2 cella 8. Altre modifiche che possono essere attuate sono adattamenti che sono stati descritti per i protocolli di test placca sviluppati per altri virus. In caso di MNV, le seguenti modifiche sono già state realizzate con successo, l&#39;uso di metil cellulosa invece di placca Mare agarosio 9, e la colorazione delle cellule con violetto cristallo o blu di metilene al posto del rosso neutro 10, 11. Nel complesso, questo protocollo può essere facilmente adattato per quantificare altri formanti placca virus o utilizzati per OTHer virus che causano infezioni litiche in RAW 264,7 cellule, che lo rende uno strumento utile per quantificare particelle virali infettive in generale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DMEM / glucosio di alta </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x penicillina e streptomicina </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM aminoacidi non essenziali </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mm (100x) L-glutammina </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea placca agarosio </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutral Red 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 millimetri Zirconia / silice perline </td><td> Biospec Prodotti </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modello 35 Velocità Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Lyser strumento Magna </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Raw 264,7 linea cellulare </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Coltura tissutale incubatore </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Norovirus murino (MNV) è l&#39;unico membro del genere Norovirus che cresce in modo efficiente nella coltura del tessuto 1, 2. Lisi cellulare e l&#39;effetto citopatico (CPE) sono osservate durante MNV-1 infezione di cellule dendritiche murine o macrofagi 1. Questa proprietà di MNV-1 può essere utilizzato per quantificare il numero di particelle infettive in un dato campione eseguendo un saggio di placca 1. Il saggio di placca si basa sulla capacità di MNV-1 per lisare le cellule e per formare i fori in un monostrato di cellule confluenti, che sono chiamati placche 3. Molteplici tecniche possono essere utilizzate per rilevare infezioni virali in coltura tissutale, tessuto raccolto, clinica, e campioni ambientali, ma non tutti misura del numero di particelle infettive (es qRT-PCR). Un modo per quantificare particelle virali infettive è quello di eseguire un saggio di placca 3, che sarà descritto in dettaglio nel seguito. Una variazione del saggio di placca MNV è la fluorfuoco saggio escent, dove è immunostained antigene MNV in monostrati cellulari 4. Questo test può essere più veloce, in quanto espressione di antigene virale precede la formazione della placca. E &#39;anche utile per titolazione virus incapaci di formare placche. Tuttavia, il saggio fuoco fluorescente richiede risorse aggiuntive rispetto a quelle del saggio di placca, come anticorpi e un microscopio per contare fuoco unità formanti. MNV infettiva può anche essere quantificato determinando il 50% della dose infettante Tissue (TCID 50) 3. Questo saggio misura la quantità di virus necessaria per produrre CPE nel 50% delle cellule del tessuto inoculate coltura mediante titolazione finale 5. Tuttavia, il suo limite di rilevamento è più alto rispetto ad un saggio di placca 4. In questo articolo, si descrive un protocollo di saggio di placca che può essere utilizzato per determinare efficacemente il numero di particelle infettive MNV presenti in campioni biologici o ambientali 1, 4, 6. Questo metodo è based sulla preparazione di diluizioni seriali di 10 volte di MNV contenenti campioni, che vengono utilizzati per inoculare un monostrato di cellule permissive (RAW 264,7 macrofagi murini). Virus è consentito collegarsi al monostrato cellulare per un dato periodo di tempo e quindi aspirata prima di coprire cellule con una miscela di agarosio e mezzo di coltura. L&#39;agar permette la diffusione della progenie virale alle cellule vicine, limitando la diffusione di cellule situate lontano. Di conseguenza, le cellule infettate vengono lisate e fori formano nel monostrato noto come placche. Alla diffusione del virus sufficiente, placche diventano visibili seguente colorazione delle cellule con coloranti, come il rosso neutro, blu di metilene, o viola cristallo. A basse diluizioni, ogni placca proviene da una particella infettiva virale e la sua progenie, che si è diffusa a cellule vicine. Così, contando il numero di placche permette di calcolare unità formanti placca (PFU) presenti nel campione non diluito 3.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Qui si descrive un metodo per quantificare particelle infettive di norovirus murino (MNV), che è l&#39;unica norovirus che replica efficiente in coltura cellulare. Il saggio di placca sfrutta MNV tropismo per i macrofagi murini e può essere adattato all&#39;uso con campioni biologici o ambientali contenenti MNV.

Saggio di placca per Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.2K Views.  University of Michigan, Ann Arbor. Qui si descrive un metodo per quantificare particelle infettive di norovirus murino (MNV), che è l'unica norovirus che replica efficiente in coltura cellulare. Il saggio di placca sfrutta MNV tropismo per i macrofagi murini e può essere adattato all'uso con campioni biologici o ambientali contenenti MNV.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;