Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

1. CRISPR design <ol><li> SgRNAs design manualmente o utilizzando liberamente disponibili strumenti online 7. Utilizzare questi strumenti per aiutare a identificare le sequenze di guida che riducono al minimo le partite genomiche identiche o quasi le partite per ridurre il rischio di scissione da siti bersaglio (effetti off-target). Assicurarsi che le sequenze di guida sono costituiti da un 20-mer (&quot;sequenza protospacer&quot;) a monte di una sequenza &quot;NGG&quot; (&quot;protospacer motivo contiguo&quot; o PAM) presso il sito di riconoscimento genomica. NOTA: La figura 1 descrive le possibili strategie di eliminazione per i geni ed elementi non codificanti. Per la creazione di un knockout gene, due sgRNA situati all&#39;interno esoni arricchiranno cloni di eliminazione anche monoallelic per perdita di funzione. Ciò è dovuto alla elevata frequenza di indels formati su alleli non cancellato 12, che possono causare frameshift mutazioni che portano a dialogo mediata decadimento della trascrizione dell&#39;mRNA (Figura 1B). </li><li> Utilizzare ilesempio guida per l&#39;eliminazione prevista di PIM1 nel topo (Mus musculus, Tabella 1, Figura 2A). NOTA: In questo esempio, la sequenza di protospacer sgRNA-A e PAM capita di cadere sul filo di fondo (Crick), mentre la sequenza protospacer di sgRNA-B e PAM cadono in alto (Watson) filamento (Figura 2A). Tuttavia, si verificherà DSB indipendente dall&#39;orientamento del protospacer sequenza / PAM rispetto al filo superiore o inferiore. </li><li> Determinare il complemento inverso (rc) di ciascuna sequenza guida. Esempio invertire sequenze complemento del PIM1 sgRNA dalla tabella 1 si trovano nella tabella 2. </li><li> Ottenere 24- o 25-mer oligonucleotidi per ogni guida e il suo complemento rovescio associato tra l&#39;altro nucleotidi complementari a scopi di clonazione e di espressione. NOTA: Qui si discute l&#39;uso del pSpCas9 (BB) plasmide (pX330) (Addgene ID plasmide 42230). Questo plasmide permette la simultaneaespressione di sgRNA e SpCas9, ma non contiene marcatori per la selezione 7. Altri costrutti possono essere utilizzati, come ad esempio pX458 (Addgene ID plasmide 48138) o pX459 (Addgene ID plasmide 48.139), che includono GFP e puromicina marcatori selezionabili, rispettivamente, o costrutti in cui più sgRNAs può essere espresso da un singolo plasmide. <ol><li> Aggiungi &quot;CACC&quot; prima della sequenza di guida 20-mer e &quot;AAAC&quot; prima di complemento retromarcia della guida per la clonazione nel vettore pX330 utilizzando BBSI enzima di restrizione (tabella 3). </li><li> Aggiungere un nucleotide G dopo la sequenza CACC e prima 20-mer se la prima posizione del 20-mer non è espressione G. sgRNA dal promotore U6 del vettore pX330 è migliorata con l&#39;inclusione di un nucleotide G dopo la sequenza CACC . Aggiungere una C all&#39;estremità 3 &#39;del complemento inverso oligo (es sgRNA-A nella tabella 4). Gli oligo risultanti sarebbero oligo 25-mer. </li><li> Comemai, se la prima posizione del 20-mer (sequenza protospacer) è G, non aggiungere un&#39;altra G (ad esempio, sgRNA-B in Tabella 4) e non aggiungere C alla posizione finale del complemento oligo inverso. In questo caso, gli oligo risultanti sarebbero oligonucleotidi 24-mer (Tabella 4). </li></ol></li></ol> 2. Progettazione di eliminazione Primer screening <ol><li> Disegno un set di primer interni alla sequenza da cancellare (&quot;banda non-soppressione&quot;) e un&#39;altra serie di primer a monte ea valle dei siti sgRNA scissione (&quot;soppressione banda&quot;; Figure 1 - 2). In assenza di soppressione, &quot;banda eliminazione&quot; è spesso troppo grande per amplificare in modo efficiente. Tipicamente utilizzare primer almeno 100 bp dal sito di taglio previsto per garantire il rilevamento non essere influenzato da una piccola indel presso il sito di destinazione sgRNA. <ol><li> Progettare primer supplementari da analizzare per sfregio (piccole indels prodotti nello sgRNA csito leavage senza la soppressione prevista). Utilizzare un paio di avanti e indietro primer fiancheggianti ogni sito di destinazione sgRNA (entro 150-350 bp) per amplificare il sito di destinazione sgRNA esaminare per sfregio. Questo può essere utile per caratterizzare i allele non eliminati in cloni di eliminazione monoallelic. </li></ol></li><li> Per piccole delezioni (come &quot;banda eliminazione&quot; può ancora amplificare), risolvere ampliconi su gel di agarosio per determinare se la dimensione è coerente con la presenza o l&#39;assenza di eliminazione. Per questo approccio, i primer interni descritti al punto 2.1 possono essere omesse. </li></ol> 3. CRISPR Clonazione <ol><li> Ricottura e fosforilare oligonucleotidi. <ol><li> Oligo Risospendere una concentrazione di 100 mM in DDH 2 O. </li><li> Preparare una miscela di 10 ml di reazione per ogni guida e il suo complemento inverso: 1,0 microlitri sgRNA 24 o 25-mer oligo (100 micron; vedere il punto 1.4), 1,0 ml sgRNA 24 o 25-mer invertire complement oligo (100 micron; vedere il punto 1.4), 1,0 ml 10x T4 Ligation Buffer, 6,5 ml DDH 2 O, e 0,5 microlitri T4 Polynucleotide Kinase (PNK) (10.000 U / ml). NOTA: fosforilata oligos possono essere ordinati invece. Per questo approccio, l&#39;uso di PNK T4 viene omesso. </li><li> Anneal in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 37 ° C per 30 min; 95 ° C per 5 minuti e poi rampa fino a 25 ° C a 5 ° C / min. </li><li> Diluire oligo 1:10 in DDH 2 O (ad esempio, 1,0 microlitri ricotti oligo + 9,0 ml DDH 2 O per ottenere una concentrazione di 1 mM). </li></ol></li><li> Legare oligo ricotto in pX330 con un Golden Gate assemblea strategia clonazione 26. <ol><li> Preparare una miscela di reazione 50 microlitri: 100 ng vettore circolare pX330, 1.0 ml oligos ricotto (1 micron; vedere il punto 3.1.4), 5,0 ml di buffer enzima di restrizione (10x), 4,0 ml (20 U) BBSI enzima di restrizione (5.000 U / ml), 5.0 μl ATP (10 mM), 0,25 ml (5 mg) BSA (20 mg / ml), 0,375 ml (750 U) DNA ligasi T4 (2.000.000 U / ml) e H 2 O al volume finale di 50 pl. Questa reazione può essere ridotta ad un volume finale inferiore se necessario. </li><li> Campioni eseguito in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: Cicli 1-20 (37 ° C per 5 minuti, 20 ° C per 5 min); Ciclo 21 (80 ° C per 20 min). Queste condizioni consentono di ciclismo per la digestione e legatura a verificarsi in una reazione (vedi punto 3.2). </li><li> Trasformare 10 ml di DH5α E. coli con 1 ml di reazione (da 3.2.1 - 3.2.2). </li><li> Piatto su una lisogenia brodo (LB) piastra di agar con 100 mg / ml di ampicillina e incubare O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Scegli 2 - 3 colonie e inoculare in una cultura mini-prep. <ol><li> Eseguire mini-preparazione per ogni campione e sequenziare ogni colonia con un primer forward promotore U6: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Questo è arepresentative sequenziamento Primer; altri primer fiancheggianti possono essere utilizzati. </li></ol></li><li> Scegli una colonia sequenza verificata e inoculare in una cultura maxi-prep. Dimensioni Prep può essere scalata in base alla resa DNA richiesto. </li><li> Eseguire maxi-prep per ogni CRISPR / Cas9 costrutto. </li></ol> 4. trasfettando CRISPRs in cellule di interesse NOTA: Questo protocollo prevede la consegna di CRISPR / Cas9 plasmidi mediante elettroporazione 27. Questo protocollo è descritto in dettaglio per eritroleucemiche murina (MEL) cellule, una linea cellulare di sospensione. Il mezzo di coltura in tutti i passaggi consiste di DMEM supplementato con 2% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina, che viene utilizzato per le cellule MEL. Tuttavia, trasfezione transitoria di CRISPR / Cas9 plasmidi può essere adattato con successo a numerosi tipi di cellule utilizzando condizioni di coltura preferite e le strategie di trasfezione per ogni tipo di cellula. Mentre le cellule MEL sono cellule di sospensione, le istruzioni per le cellule aderenti have stato anche incluso. <ol><li> Assicurarsi che non ci sono 2 x 10 6 cellule per paio CRISPR. Risospendere 2 x 10 6 cellule in 100 ml di soluzione di elettroporazione e aggiungere al elettroporazione cuvetta. <ol><li> Aggiungere 5 mg di ogni CRISPR / Cas9 costrutto (10 mg totali). Aggiungere 0,5 mg di GFP espressione costrutto. </li></ol></li><li> Cellule elettroporazione con 250 volt per 5 msec in una provetta 2 millimetri che utilizzano un sistema di elettroporazione. NOTA: In alternativa, usare un altro metodo di trasfezione come cationico transfezione a base di liposomi. Ottimizzare le condizioni di trasfezione per ciascuna linea cellulare con un costrutto giornalista per garantire la consegna plasmide robusta prima di tentare la modifica del genoma. </li><li> Trasferire immediatamente soluzione dalla cuvetta in 1 ml di coltura dopo elettroporazione. Minimizzare il tempo tra elettroporazione e trasferire la soluzione in media per migliorare la vitalità cellulare. </li><li> Incubare a 30 - 37 ° C per 24-72 ore. 30 ° C possono migliorare genomamodifica l&#39;efficienza, ma 37 ° C è accettabile. </li></ol> 5. Fluorescence Activated Cell ordinamento (FACS) di cellule trasfettate <ol><li> Preparare cellule per FACS filtrandoli attraverso un filtro 50 micron in un tubo FACS. </li><li> FACS ordinare il top ~ 3% di cellule GFP positive per arricchire le cellule che hanno ricevuto alti livelli di CRISPR / Cas9 costruisce. </li><li> Piatto cellule ordinati individualmente in piastre a fondo rotondo da 96 pozzetti con sorter o utilizzando diluizione limite a 30 cellule per 96 pozzetti a fondo tondo piastra. Ottimizzare placcatura tipo di cellula usato in diluizione limite prima di eseguire questa procedura per ottenere in modo affidabile circa 30 cellule per piastra da 96 pozzetti. </li><li> Include 100 ml per pozzetto di coltura cellulare multimediale. </li><li> Per le restanti cellule ordinati (&quot;bulk&quot;) che non sono stati placcati, congelare la metà delle cellule per il futuro la placcatura. Piatto l&#39;altra metà per lo screening e la validazione di fondo (vedi punto 6). NOTA: Questo pROTOCOLLO è per cellule in sospensione. Cellule aderenti possono sia crescere le cellule individuali in piastra inferiore da 96 pozzetti piatto o in un piatto di 10 centimetri a bassa concentrazione in modo che unicellulari individuo cloni derivati ​​possono essere raccolti e trasferiti in un fondo piastra a 96 pozzetti piatta. </li><li> Lasciare le cellule rinfusa ad incubare a 37 ° C per 3 - 7 giorni e permettere ai cloni di incubare a 37 ° C per 7 - 14 giorni. Vary questi tempi a seconda del tempo di raddoppio della linea cellulare utilizzata. NOTA: Questa volta incubazione consente per la proliferazione cellulare sufficiente per lo screening del DNA genomico (gDNA) per la cancellazione previsto mediante PCR (vedere i passi 6.1 e 7.1). Le cellule di massa hanno sufficientemente moltiplicate quando la concentrazione supera ~ 100.000 cellule / ml o per cellule aderenti, le cellule hanno raggiunto ~ 80% di confluenza. I cloni sono sufficientemente proliferato volta macroscopicamente visibili di diametro ~ 2 mm. </li></ol> 6. Primer Convalida e Screening per CRISPR / Soppressione Cas9-mediata <ol><li> Isolare gDNA da cellule ordinati parentali e sfusi risospendendo pellet cellulari parentali e di massa in 50 ml di soluzione di estrazione del DNA. NOTA: Generalmente ~ 100.000 cellule sono utilizzati per l&#39;estrazione del DNA, anche se una vasta gamma di numero di cellule è accettabile. Le cellule bulk filtrate sono composti da una popolazione policlonale esposta a sgRNA-A e sgRNA-B (vedere la fase 5). Lo scopo del seguente PCR è validare primer e verificare la presenza di destinato delezione genomica. </li><li> Eseguire campione termociclatore ed eseguire il seguente programma: 65 ° C per 6 min, 98 ° C per 2 minuti per estrarre gDNA. Misurare la concentrazione di DNA. NOTA: Mentre fasi 6.1 e 6.2 suggeriscono un metodo efficiente per l&#39;estrazione del DNA, qualsiasi metodo per l&#39;isolamento del DNA genomico può essere utilizzato per essere in grado di effettuare PCR nel passo 6.3. </li><li> Assemblare un 20 microlitri PCR con i seguenti componenti: 10 ml mix 2x PCR, 0,5 microlitri primer forward (10 _6, M), 0,5 ml di primer inverso (10 micron), 50-100 ng gDNA, e H 2 O fino a 20 ml. Utilizzare i primer disegnati al punto 2. Condurre PCR per &quot;banda di non-soppressione&quot; e &quot;banda cancellazione&quot; in reazioni separate. NOTA: Numerose polimerasi possono essere utilizzati per passo 6.3. <ol><li> Campioni eseguito in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 95 ° C per 15 minuti, 35 cicli di (95 ° C per 30 sec, 60 ° C per 1 min, 72 ° C per 1 min), e 72 ° C per 10 min . Ottimizzare le condizioni di PCR per ciascuna coppia di primer progettato sulla base di test delle celle di massa ordinato. </li></ol></li><li> Eseguire campioni su 2% gel a 10 V / cm utilizzando 1x Tris-acetato-EDTA (TAE) buffer. </li><li> Esaminate campioni per la presenza / assenza di non-delezione e bande di cancellazione (Figura 2). Considerare il multiplexing &quot;eliminazione&quot; e &quot;non-cancellazione&quot; PCR coppie di primer in una singola reazione. Ottimizzare multiplexingin una popolazione policlonale (cioè, bulk cellule allineati) prima di screening singoli cloni. È fondamentale che l&#39;eliminazione e non cancellazione amplificati essere facilmente risolti su un gel per multiplexing. </li></ol> 7. Screening CRISPR / Cas9 cloni per Cancellazioni e Clone selezione <ol><li> Per le cellule di sospensione, trasferire tutti i cloni di un&#39;unica piastra a 96 pozzetti che contiene già 50 microlitri colture cellulari per pozzetto per un volume finale di 150 microlitri. Questo facilita lo screening consentendo una pipetta multicanale da utilizzare per il resto dei passaggi nel passaggio 7. <ol><li> Trasferire 50 microlitri di ciascun pozzetto (100 pl lasciando in ciascun pozzetto) ad una piastra a 96 pozzetti PCR usando una pipetta multicanale. </li><li> Centrifugare piastra PCR a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante muovendo la piastra PCR sopra un lavandino. Aggiungere 50 ml di soluzione di estrazione del DNA per bene e risospendere. Passare alla fase 7.3 per cellule in sospensione. </li&gt; </ol></li><li> Per le cellule aderenti, media aspirare. Aggiungere 20 ml di 0,05% tripsina-EDTA ad ogni pozzetto con un clone presente. <ol><li> Risospendere le cellule in 200 l di media. Pipetta mix di staccare le cellule. </li><li> Piatto 100 ml ciascuna in due 96-ben lastre piane-bottom separati. Mantenere una piastra per consentire cloni di crescere e utilizzare l&#39;altra piastra per lo screening ogni clone per le eliminazioni. </li><li> Aggiungere ulteriori 100 microlitri di ciascun pozzetto per un volume totale di 200 microlitri. Attendere 24-72 ore per permettere alle cellule di crescere. </li><li> Aspirare il terreno. Aggiungere 50 ml di soluzione di estrazione di DNA per pozzetto, risospendere e trasferimento a 96 pozzetti PCR. Passare al punto 7.3. </li></ol></li><li> Estrarre il gDNA da cloni. Eseguire campione termociclatore: 65 ° C per 6 minuti e 98 ° C per 2 min per estrarre gDNA. </li><li> Schermo ogni clone utilizzando lo stesso primer PCR e condizioni di reazione ottimizzate sulle cellule massa (vedi punto 6). </li><li> Selezionare la cloni identificata con la cancellazione desiderato e passare al piatto più grande o pallone per la crescita. </li></ol> 8. La convalida di biallelici di eliminazione Clones <ol><li> Al fine di caratterizzare cloni ottenuti e validare un ko di successo, di valutare i cloni del DNA, così come i livelli di RNA e / o proteine. <ol><li> Per valutare il DNA, amplificare bande cancellazione da cloni delezione biallelici con polimerasi revisione e clonare le amplificati (ad esempio, con un kit di clonazione PCR) in un vettore plasmide. Trasforma il plasmide in DH5α E. coli cellule e piastra su piastre di agar LB con antibiotico in questione. Selezionare più colonie, mini-prep ciascuno, e sottoporre ogni clone di Sanger sequenziamento di caratterizzare ogni cancellazione allele 28 - 30. Ripetendo la prova PCR per l&#39;eliminazione dopo la schermata iniziale assicura che il clone corretto è stato selezionato e riproducibilità dei risultati. </li><li> Per valutare l&#39;RNA, eseguire RT-qPCR per gene l&#39;espressione del gene corrispondente 30,31. </li><li> Per valutare la proteina, eseguire un immunoblot usando un anticorpo contro la proteina rilevante 33. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+(CRISPRi)+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Genomic+Deletion+Efficiency+Mediated+by+CRISPR/Cas9+in+Mammalian+Cells.">Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li><li>Xiao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+deletions+and+inversions+mediated+by+TALENs+and+CRISPR/Cas+in+zebrafish.">Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish.</a> Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9+mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. , (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Gene-Modified+Cynomolgus+Monkey+via+Cas9/RNA-Mediated+Gene+Targeting+in+One-Cell+Embryos.">Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Xie, K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR-Cas+system.">RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system.</a> Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).</li><li>Waaijers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).</li><li>Bassett, A. R., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+and+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila.</a> Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+Intestinal+Stem+Cell+Organoids+of+Cystic+Fibrosis+Patients.">Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+Genetic+Disease+in+Mouse+via+Use+of+CRISPR-Cas9.">Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).</li><li>Lappalainen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+genome+sequencing+uncovers+functional+variation+in+humans.">Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans.</a> Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).</li><li>Bauer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Erythroid+Enhancer+of+BCL11A+Subject+to+Genetic+Variation+Determines+Fetal+Hemoglobin+Level.">An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level.</a> Science. 342 (6155), 253-257 (2013).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3, e3647 (2008).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+PCR+products.">Molecular cloning of PCR products.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Detection+in+Prostate+Tumors+by+Quantitative+Real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR).</a> J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).</li><li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Human+Vestibular+Schwannomas.">Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas.</a> J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>McVey, M., Lee, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMEJ+repair+of+double-strand+breaks+(director&#8217;s+cut):+deleted+sequences+and+alternative+endings.">MMEJ repair of double-strand breaks (director&#8217;s cut): deleted sequences and alternative endings.</a> Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. , (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).</li><li>Alem&#225;n, L. M., Doench, J., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Comparison+of+siRNA-induced+off-target+RNA+and+protein+effects.">a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects.</a> RNA. 13 (3), 385-395 (2007).</li><li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity+Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity.">Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity.</a> RNA. 14, 853-861 (2008).</li><li>Marine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+seed+analysis+to+identify+off-target+effects+in+siRNA+screens.">Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).</li></ol>

We have no conflicts of interest related to this report.

Il sistema CRISPR / Cas9 può essere utilizzato per generare delezioni genomiche di una gamma di dimensioni. Anche se abbiamo osservato che la frequenza di eliminazione varia inversamente rispetto alle dimensioni cancellazione previsto, siamo stati in grado di recuperare le eliminazioni fino a 1 Mb, e le cancellazioni fino a 100 kb di routine resa più biallelici cancellato cloni. Abbiamo osservato alcun calo di efficienza di delezioni sequenzialmente introduzione in una linea cellulare. Questa strategia può essere utilizzato per la creazione di delezione combinatoria di numerosi geni ed elementi. Il processo per ottenere cloni di delezione biallelici può essere accelerato stimando il numero minimo di cloni necessari per essere proiettato in base alle dimensioni delezione per ottenere il numero desiderato di cloni con delezione biallelica 12. La possibilità di ottenere la cancellazione monoallelic con assenza di delezione biallelica alla distribuzione probabilistica potrebbe indicare letalità cella associata con completa perdita di funzione. Low frequency o delezioni assenti potrebbero riflettere un certo numero di scenari tra cui poveri trasfezione, sgRNAs inefficienti o inefficienti primer di screening PCR (a causa della mancanza di un controllo positivo per convalidare primer PCR per lo screening per l&#39;eliminazione). Cellule GFP + può essere utilizzato come un surrogato per efficienza di trasfezione (vedi punto 5.2), quindi una riduzione delle cellule GFP + probabilmente riflette poveri trasfezione e una risultante diminuita efficienza eliminazione. Utilizzando due diverse coppie sgRNA con primer di screening indipendenti possono contribuire a controllare per sgRNA inefficiente e screening primer PCR e massimizzare le possibilità di ottenere cloni di eliminazione biallelici. Cella di ordinamento per + cellule GFP arricchisce per alleli cancellazione. Anche se questo passaggio può essere omesso, omissioni probabilmente necessitano di screening più cloni per identificare quelli con delezioni monoallelic o biallelici. Nella misura in cui l&#39;efficienza di trasfezione può essere ottimizzato, ci aspetteremmo efficienza editing genoma da valorizzare. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Gli eventi NHEJ che sono alla base delezioni e risultato riparazione locale in una serie di alleli con una varietà di indels nei siti di destinazione. Il risultato predominante è di piccole ~ 1 - 10 inserimenti BP o più comunemente delezioni nel sito di scissione sgRNA diretto (Figura 2B). Spesso questi alleli sembrano essere il risultato di base microhomology riparazione 34,35. Va notato che la strategia di rilevamento basato su PCR descriviamo non identificherà inserzioni più grandi o più complessi, delezioni, inversioni o riarrangiamenti. Anche se questi eventi sono meno comuni, abbiamo osservato cloni in cui potrebbero essere rilevate né l&#39;eliminazione né ampliconi non delezione, e dopo ulteriori indagini riflettere questi risultati più complessi. Abbiamo osservato vasta CRISPR / Cas9-mediata &quot;cicatrici&quot; del non-delezione alleli di monoallelic e non cancellazione cloni (vedi Figura 2B). Questi &quot;cicatrici&quot; sono composti dapiccole indels prodotti nel sito di clivaggio sgRNA senza cancellazione previsto (cioè, soppressione del segmento intercorrente tra sgRNAs A e B). Queste cicatrici spesso interrompono il riconoscimento di destinazione dal sgRNA. Pertanto esortiamo cautela in retargeting alleli in cellule precedentemente esposti a sgRNAs utilizzando le stesse sgRNAs. Una strategia di retargeting più efficace sarebbe utilizzare sgRNA unico sequenze distinte da siti di riconoscimento in precedenza &quot;segnate&quot;. In casi in cui una coppia di sgRNAs riconosce sequenze exonic (Figura 1B, in basso), alleli frameshift può essere prodotto anche in assenza di eliminazione. Pertanto, cloni eliminazione monoallelic possono essere arricchiti per la perdita-di-funzione a causa della elevata frequenza di mutazioni frameshift sulla non-eliminato allele 12. Una preoccupazione con il sistema CRISPR / Cas9 è fuori bersaglio effetti, vale a dire, la modifica genomico in siti non voluti 36-38. Rrapporti alcune recenti hanno suggerito che RNA guida più brevi con 17-19 nucleotidi in grado di ridurre la frequenza di CRISPR / Cas9 basato effetti 39 fuori bersaglio. Inoltre, una strategia doppio intaccare utilizzando due guide per sito bersaglio con un nickase può essere usato per creare DSBs minimizzando effetti 7 off-target. In alternativa, analogo a strategie utilizzate per RNAi, vi consigliamo di diverse coppie di sgRNAs con non sovrapposti sequenze protospacer essere usati per dimostrare che il fenotipo osservato è il risultato della CRISPR / modifica on-target Cas9 al contrario di un potenziale fuori bersaglio effetto. Un approccio pratico sarebbe quello di progettare almeno due coppie sgRNA adiacenti ma non si sovrappongono in modo che un singolo set di primer di screening (vedi punto 2) può essere utilizzato per più coppie sgRNA (Figura 1A). Inoltre, integrando una linea cellulare cancellazione reintroducendo la sequenza mancante e / o gene interrotto può dimostrare una relazione causale traun dato delezione genomica e fenotipo. Per i biologi che lavorano con sistemi modello cellulare, RNAi ha rappresentato un potente strumento per la genomica funzionale. Tuttavia, i limiti di questo approccio hanno incluso riduzione incompleta in livelli di trascrizione bersaglio mRNA, eterogeneità degli effetti dei reagenti indipendenti destinate lo stesso gene, e sono noti effetti off-target, inclusi gli effetti di semi-based e non-seme 40-42. Strategie di montaggio Genome promettono di risolvere molti di questi problemi e rappresentano un approccio interessante, complementare perturbazione genetico prospettico 8,36,37. Inoltre, la modifica del genoma permette lo studio di non-codificanti elementi genetici in un modo impossibile da RNAi e stimolante di mira convenzionali approcci 25. Incoraggiamo generazione di delezioni genomiche da CRISPR / Cas9 come metodo robusto e specifico per produrre e caratterizzare la perdita-di-funzione alleli.

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1&#8211;3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate &#8220;nicking&#8221; or transcriptional regulation respectively7&#8211;9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12&#8211;14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17&#8211;21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:388px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pSpCas9(BB) (pX330)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX Solution and 2mm Cuvettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP Plasmid</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq PCR Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zero Blunt PCR Cloning Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2700-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

L&#39;obiettivo di questo esperimento è stata la cancellazione di PIM1 in cellule MEL. L&#39;utilizzo di più coppie non sovrapposti sgRNA (cioè, sequenze protospacer indipendenti) può aiutare a controllare gli effetti off-bersaglio (Figura 1A). Un fenotipo coerente sarebbe più probabile il risultato di un effetto on-target rispetto a un comune effetto off-obiettivo condiviso da più sequenze protospacer indipendenti. Ogni coppia dovrebbe portare alla produzione di un punto di interruzione delezione unico. Se ravvicinati (cioè, meno di n ~ 150 bp), gli stessi primer di screening possono essere usati per rilevare delezioni prodotte da ciascuna serie di sgRNAs. Delezioni genomiche possono disturbare geni utilizzando coppie sgRNA in diverse posizioni rispetto al gene (Figura 1B). Ad esempio, la coppia sgRNA può affiancare un gene per l&#39;eliminazione di tutto il corpo gene; la coppia potrebbe essere situata all&#39;interno di due esoni, con la possibilità di creare indels frameshift anche se uno o entrambi alleles non sono stati cancellati; o la coppia può affiancare un esone specifico per consentire rottura di un particolare isoforma. La strategia utilizzata per delezione PIM1 era progettare accompagnamento sgRNAs per eliminare tutto il corpo gene, una delezione 8 kb (Figura 2). Questa strategia è stata scelta, in parte a causa delle dimensioni relativamente ridotte del gene PIM1. Questo esempio mostra uno PAM (verde) in alto (Watson) filamento e uno PAM sul fondo (Crick) filamento; Tuttavia, DSB è indipendente sequenza PAM localizzazione al filo superiore o inferiore. coppie sgRNA possono avere entrambe le sequenze PAM sul filamento superiore, sia sul filamento inferiore, o uno di ciascuno. Utilizzando il protocollo sopra descritto, sono stati progettati due sgRNA, clonati nel vettore di espressione pX330, e consegnati alle cellule MEL ​​mediante elettroporazione con un reporter GFP (Figura 2A). La top 3% di cellule GFP + sono stati ordinati due giorni post-elettroporazione e placcato clonale a limitare la diluizione. Schermoprimer ing sono stati progettati come descritto al punto 2 e, come illustrato nella figura 2. condizioni di PCR sono stati ottimizzati utilizzando gDNA isolate da cellule MEL ​​parentali e da &quot;massa&quot; cellule ordinati. 10 giorni dopo la placcatura, gDNA stato isolato da tutti i cloni e proiettato per la cancellazione tramite PCR, che ha individuato non la cancellazione, monoallelic e cloni cancellazione biallelici secondo i modelli di non-delezione (ND) e cancellazione (D) amplificati (Figura 3) . Cloni non-delezione sono stati identificati come aventi la presenza dell&#39;amplicone non-soppressione e l&#39;assenza dell&#39;amplicone eliminazione. Monoallelic cloni sono stati identificati come aventi la presenza sia del non-soppressione e ampliconi cancellazione. Biallelici cloni sono stati identificati come aventi assenza dell&#39;amplicone non-soppressione e la presenza dell&#39;amplicone eliminazione. Per questa soppressione, 400 cloni sono stati sottoposti a screening che ha individuato 126 cloni cancellazione monoallelic e 32 delet biallelic<html> cloni ioni (è importante notare che la frequenza delezione varia con delezione dimensione 12). Cloni cancellazione biallelici sono stati selezionati e spostati palloni con 8 ml di media. Dopo 5 giorni per consentire l&#39;espansione, ciascun clone è stato riprovato mediante PCR di gDNA per confermare biallelici delezione e cancellazione ampliconi sono stati sottoposti a sequenziamento Sanger per identificare il preciso delezione (Figura 2B). L&#39;eterogeneità nei ampliconi eliminazione riflette imperfetta-indel formando NHEJ riparazione. Il sequenziamento del allele non-delezione in cloni di eliminazione monoallelelic indels scoperti nella maggior parte dei casi, a dimostrazione che anche l&#39;allele non-eliminato viene frequentemente modificato da CRISPR / Cas9, che può essere importante per le applicazioni in cui sono richieste due cloni cancellazione monoallelic e biallelici . RNA è stato isolato da cloni di delezione biallelici e analizzato mediante RT-qPCR per confermare la perdita di espressione PIM1 (Figura 4). modi &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig1highres.jpg" /> Figura 1. Schema di possibili strategie di eliminazione. (A) Due esempi sgRNA coppie di delezioni genomiche (mostrata in nero e arancione, rispettivamente). Le frecce blu indicano primer per rilevare l&#39;amplicon non cancellazione e frecce rosse indicano primer per rilevare l&#39;amplicon eliminazione. sgRNA posizioni 17 e 18 sono evidenziati in rosso e blu a sgRNA-Siti-A 1 / A 2 e sono evidenziati in viola e arancio a sgRNA-Siti-B 1 / B 2 con una linea rossa che indica la scissione Cas9 previsto tra le posizioni 17 e 18. (B) cleavages CRISPR diretto vengono visualizzati come linee nere verticali. Le frecce blu indicano primer per rilevare l&#39;amplicon non cancellazione e frecce rosse indicano primer per rilevare l&#39;amplicon eliminazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere</a>una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig2highres.jpg" /> Figura 2. Strategia per produrre e rilevare la cancellazione di PIM1, tra cui l&#39;eliminazione di sequenziamento e alleli non-delezione. (A) Schema della strategia di screening basata sulla PCR per identificare PIM1 cloni di eliminazione. Una coppia di primer si trova interno alla cancellazione (frecce blu) e una coppia di primer è localizzato esterna per la cancellazione (frecce rosse). sequenze sgRNA (sequenze protospacer) sono mostrati in viola. Le linee rosse verticali indicano il clivaggio Cas9 previsto tra le posizioni 17 e 18 della sequenza sgRNA. (B) Sanger sequenziamento rivela formazione indel al sito di riconoscimento sgRNA. sequenze sgRNA sono mostrati in sequenza viola e PAM in verde. Eventi di eliminazione sono shproprio da un numero equivalente di marchi precipitare e inserimenti sono evidenziati in blu. Linee rosse verticali indicano predetto sito di taglio, tra le posizioni 17 e 18 della sgRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig3highres.jpg" /> Figura 3. Gel Rappresentante individuazione non la cancellazione, monoallelic, e cloni biallelici. Per ogni clone, la corsia di sinistra rappresenta il non-delezione amplicone (&quot;ND&quot; in blu) e la corsia di destra rappresenta la amplicone cancellazione (&quot;D&quot; in rosso ). Cloni individuali sono separati da linee tratteggiate. I tre cloni di delezione monoallelic sono cloni 5, 6, e 2. Le tre cloni di delezione biallelici sono cloni 15, 17, e 13. Come si vede dai dati di sequenziamento, la banda di eliminazione per c<html> solo 13 ha una dimensione inferiore a causa di cancellazioni più grandi allo svincolo eliminazione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig4highres.jpg" /> Figura 4. Perdita di espressione PIM1 in cloni di eliminazione biallelici. Espressione PIM1 è stato calcolato per due cloni cancellazione biallelici di RT-qPCR. I dati sono stati normalizzati per GAPDH con il 2 - metodo ΔCt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Protospacer Sequence </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 1. 20-mer sequenze protospacer per due sgRNA per la cancellazione di PIM1. 543 &quot;&gt; <tbody><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:101px;"></td><td style="width:443px;"> Complemento inversione di sequenza Protospacer </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-A-RC </td><td> 5&#39;-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 2. complemento inverso delle sequenze protospacer per i due sgRNA dalla Tabella 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Sequenze </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-RC </td><td> 5&#39;-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 3. sequenze Protospacer e l&#39;inversione completa con &quot;CACC&quot; e &quot;AAAC&quot; aggiunto per la clonazione nel vettore pX330 utilizzando BBSI enzima di restrizione. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Sequenze </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-RC </td><td> 5&#39;AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 4. sgRNA espressione dal promotore U6 del vettore pX330 è migliorata con l&#39;aggiunta di un nucleotide G dopo la sequenza CACC e prima20-mer. L&#39;aggiunta di un G nucleotide supplementare richiede l&#39;aggiunta di un nucleotide C all&#39;estremità 3 &#39;del complemento oligo inversa (ad esempio, sgRNA-A). Tuttavia, se la prima posizione del 20-mer (sequenza protospacer) è già un nucleotide G, non è necessario aggiungere un&#39;altra G (ad esempio, sgRNA-B) e senza necessità di aggiungere C alla posizione finale del complemento inverso oligo.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generazione di Genomic eliminazioni in linee cellulari di mammiferi via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

generation-of-genomic-deletions-in-mammalian-cell-lines-via-crisprcas9

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

94.9K Views.  Harvard Medical School. CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Video: Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Ricerca

Biologia

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Crescita anaerobica e la manutenzione di linee cellulari di mammifero

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β endoteliale mediato a transizione mesenchimale (EndMT) e la valutazione funzionale degli effettori EndMT utilizzando crispr/cas9 gene editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological phenomena. Zebrafish have been used as an effective genetic model to study numerous questions related to heritable disease, development, and toxicology at the whole-organ and -organism level. Due to the well-annotated and mapped zebrafish genome, numerous tools for gene editing have been developed. However, the efficacy of generating and ease of detecting precise knock-in edits using CRISPR is a limiting factor. Described here is a CRISPR-Cas9-based knock-in approach with the simple detection of precise edits in a gene responsible for cardiac repolarization and associated with the electrical disorder, Long QT Syndrome (LQTS). This two-single-guide RNA (sgRNA) approach excises and replaces the target sequence and links a genetically encoded reporter gene. The utility of this approach is demonstrated by describing non-invasive phenotypic measurements of cardiac electrical function in wild-type and gene-edited zebrafish larvae. This approach enables the efficient study of disease-associated variants in a whole organism. Furthermore, this strategy offers possibilities for the insertion of exogenous sequences of choice, such as reporter genes, orthologs, or gene editors.

This protocol describes an approach to facilitate precise knock-in edits in zebrafish embryos using CRISPR-Cas9 technology. A phenotyping pipeline is presented to demonstrate the applicability of these techniques to model a Long QT Syndrome-associated gene variant.

Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...