This work was supported by Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior research group to E.A.L.) within the faculty of Medicine at RWTH Aachen University. We are grateful Dr. Rusu and Ashley Christina Vourakis for critical review of the manuscript and Mrs. Roya Soltan for the professional help with immunohistochemistry staining.

NOTA: Gli esperimenti presentati in questo documento vengono eseguiti di conseguenza per il basso tedesco e alle linee guida europee per la cura degli animali. Gli animali vengono allevati nella struttura animali di Institute for Laboratory Animal Science, Universiy ospedale Aachen, in Germania, sotto la supervisione del Prof. Dr. R. Tolba e Dr. A. Teubner (animale assistente sociale). 1. Animal Care <ol><li> Tenere i topi in un reparto di terapia specializzata, assicurando un adeguato accesso al cibo e controllo veterinario specializzato e il trattamento. Se gli animali vengono spostati o acquistati all&#39;esterno, si prega di assicurare una settimana alloggio prima di subire la procedura. </li></ol> 2. intubazione <ol><li> Anestetizzare 8-10 settimane vecchio maschio C57BL / 6 topi wild-type, 25-27 g con iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina. Monitorare il livello di anestesia da punta riflessi pizzico. Posizionare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura. </li><li&gt; gestire la terapia del dolore con buprenophine 0,1 mg / kg di peso corporeo per via sottocutanea prima di iniziare la procedura chirurgica, seguendo le linee guida per la cura degli animali della vostra istituzione. </li><li> Assicurare il mantenimento delle condizioni di sterilità per evitare infezioni durante l&#39;intervento chirurgico, utilizzando materiali e strumenti sterili. </li><li> Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina su un tavolo operatorio riscaldato. Rimuovere i capelli da entrambi zona ventrale del collo e la metà sinistra del torace utilizzando un piccolo rasoio e disinfettare con alcool al 70% prima incisione. <ol><li> Eseguire una piccola incisione mediana di 0.5 cm usando forbici chirurgiche nel centro del collo. Sotto la pelle, passare attraverso i corpi grassi 2 con una pinza sterile curve e visualizzare la trachea sotto stereomicroscopio attraverso la trasparenza del muscolo copertura. </li></ol></li><li> Introdurre oralmente la cannula di intubazione nella trachea sotto vista utilizzando lo stereomicroscopio (Figura 1A). Distinguere la cannula metallica through il tessuto trasparente. E controllare, la posizione e la posizione durante l&#39;operazione in qualsiasi momento (Figura 1B). </li><li> Collegare la cannula al piccolo ventilatore animali e regolare le impostazioni di ventilazione secondo produce linee guida (volume corrente tra i 100-150 ml e una frequenza respiratoria tra 100-150 al minuto). </li></ol> 3. Myocardial Infarction induzione <ol><li> Eseguire una incisione cutanea meno di 0,5 centimetri nel bel mezzo di una linea tra xifoideo e axila sinistra. Utilizzare pinze per separare lo strato muscolare dalle costole sottostanti. </li><li> Eseguire una piccola incisione tra nervature utilizzando una piccola forbice fino alla cavità toracica è aperta 17. Per miocardico cronico, eseguire l&#39;incisione nel 5 ° spazio intercostale (Figura 1C) e / o per il modello di ischemia / riperfusione, nel 4 ° spazio intercostale (Figura 1D): per un numero più facile approccio dal basso TH 2 e la 3 ° </sup&gt; spazio intercostale, rispettivamente). </li><li> Posizionare i divaricatori nell&#39;incisione di aprire cavità toracica e di visualizzare il cuore. </li><li> Rimuovere con attenzione il pericardio per evitare eccessive processi fibrotici. </li><li> Visualizzare coronaria sinistra discendente (LAD) come una luce nave rosso intenso posizionato. Se il LAD non può essere visualizzato, prendere in considerazione alcuni punti di riferimento per aumentare la riproducibilità. <ol><li> Per il modello miocardico cronico, posizionare la legatura a metà del lato ventrale del cuore (tra il padiglione auricolare e apice), avendo come riferimento la vena come mostrato nella Figura 1C. Associare entrambi i rami dell&#39;arteria con 0/7 sutura di seta per ottenere un transmurale anteriore e posteriore del miocardio. Il colore grigio indica la posizione di legatura e può essere ripetuto se necessario (Figura 1C). </li><li> Per ischemia modello / riperfusione, posizionare la legatura sotto il padiglione auricolare, il corpo principale della LAD (Figura 1D). Il ligature si trova su un tubo in silicone per proteggere l&#39;integrità della nave. Il colore grigio indica l&#39;area infartuata e dovrebbe comparire in tutta cuore (Figura 1D). Posizionare suture temporali sulle costole durante il periodo di ischemia e bagnare con un impacco per evitare l&#39;essiccamento del tessuto. Dopo ischemia, rimuovere il tubo di silicone e tagliare la sutura con piccole forbici per visualizzare la riperfusione. </li></ol></li><li> Oltre ai anestetici e analgesici utilizzati all&#39;inizio del procedimento (passi 2.1 e 2.2), utilizzare 0,5% isoflurano durante l&#39;intervento per garantire il corretto comodità dell&#39;animale, o seguire le linee guida per la cura degli animali della vostra istituzione. </li></ol> 4. sutura e ripristino <ol><li> Eliminare l&#39;aria residua dal torace riempiendo con soluzione calda di sale isotonica. </li><li> Chiudere il torace con 3 suture 0/6 (come mostrato nella Figura 2A e 2B). Posizionare suture mediali ad un angolo di 90 °, per assicurare comeealed chiusura delle nervature, come mostrato nella Figura 2 (Figura 2A, B). </li><li> Chiudere lo strato muscolare con 2 punti di sutura (Figura 2C) e la pelle con 3-4 punti di sutura 0/6 (Figura 2D). Eseguire queste suture separatamente per ottenere una finestra adeguata per ulteriori misurazioni ecocardiografica. </li><li> Staccare la cannula di intubazione dal ventilatore e consentire respiro spontaneo. Per l&#39;identificazione, marcando il mouse utilizzando il sistema locale (chiedere al responsabile del benessere degli animali dal vostro istituto). </li><li> Adagiare il mouse sul lato sinistro sotto la lampada rossa fino a quando non si sveglia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente. Non consentire a un animale che è stato sottoposto a un intervento chirurgico per essere in compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. </li><li> Gestire la terapia del dolore con buprenophine 0,1 mg / kg di peso corporeo, per via sottocutanea per i prossimi 3 giorni, seguendo le linee guida per la cura degli animali della vostra istituzione. </li&gt; </ol> 5. Analisi del Myocardial Infarction <ol><li> Monitorare regolarmente la funzione cardiaca mediante ecocardiografia (figura 3A): la frazione di eiezione, frazione di accorciamento, gittata cardiaca e le dimensioni del cuore. </li><li> Anestetizzare gli animali utilizzando iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg ketamina e 10 mg / kg xilazina. Verificare il corretto anesthetization prima dell&#39;intervento dalla mancanza di riflessi. </li><li> Aprire la cavità toracica e accise cuore, ponendolo in soluzione sterile PBS lavaggio ampiamente il sangue residuo. </li><li> Se necessario, raccogliere il sangue direttamente dal cuore, evitando la lesione delle regioni infracted, o dopo la rimozione del cuore, dalla cavità toracica. </li><li> Dopo il lavaggio, si ferma il cuore in Diastola in soluzione KCl satura (sterile filtrato 3M KCl in PBS). Per l&#39;analisi istologica riparare il cuore in formalina al 10% e procedere con il punto 5.7. </li><li> Se necessario, misurare la vitalità della vetturacellule DIAC da Evans-Blue / Trifenil cloruro di tetrazolio (TTC) colorazione. Dopo aver ricostruito la legatura nel luogo iniziale, profumato cuore con 200 microlitri 1% Evans Blu Solution utilizzando una cannula aortica e congelare cuore in un sacchetto di plastica a -20 ° C, senza lavaggio. <ol><li> Dopo 2 ore, effettuare 5 scivoli trasversalmente con un bisturi tagliente e incubare per 10-15 min in soluzione TTC a 37 ° C, come descritto da fabbricati. Fissare i vetrini per 10 min in formalina al 10% e metterli tra i preparati microscopici per ulteriori analisi. </li><li> Incorporare il tessuto cardiaco in paraffina, posizionando il cuore sulla punta, effettuare trasversali sezionamento. Eseguire sezione seriale del 5 micron. Raccogliere le prime 20 sezioni e scartare il prossimo 300 micron. Continuare il protocollo sezione finché il livello della valvola mitrale è stato raggiunto (Figura 3A, B). Sezioni seriali, 400 micron a parte lungo tutto cuore sono raccolti e possono essere colorati fo l&#39;analisi qualitativa e quantitativa. </li></ol></li><li> Misurare le dimensioni del miocardio usando di Gomori one-step colorazione 6-8. </li><li> Analizzare l&#39;angiogenesi, il contenuto di collagene o di cellule infiammatorie reclutamento nella sezione seriale utilizzando solito colorazione immunohistological. </li></ol>

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	<li>Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A., Marx, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+after+myocardial+infarction,+between+fantasy+and+reality:+the+role+of+chemokines.">Repair after myocardial infarction, between fantasy and reality: the role of chemokines.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2357-2362 (2011).</li><li>Liehn, E. 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The authors have nothing to disclose.

Durante la procedura, ci sono alcuni punti critici da notare: la intubazione, la aprendo la cavità toracica e la legatura LAD. Il primo passo fondamentale è l&#39;intubazione dell&#39;animale prima experiements. Molti gruppi utilizzano un supporto verticale per il fissaggio del mouse e una sorgente di luce per inserire la cannula direttamente nella trachea. Questo metodo ha incertezza riguardo il corretto inserimento della cannula nella trachea ed è la più incline alla rottura dai novizi. Facendo una piccola incisione, la posizione della cannula può essere controllata durante l&#39;intera manovra, riducendo così il tasso di default. Inoltre, la tracheotomia viene superato, diminuendo così le complicazioni e riducendo il tempo di funzionamento. Il successivo passo critico è l&#39;apertura della cavità toracica. La sternotomia mediana rappresenta una manovra ad alto rischio di ritardare il recupero degli animali. L&#39;incisione laterale sinistra implicando il taglio di 2-3 nervature 15 </sup&gt;, porta a recupero carenti e aumento della mortalità. Abbiamo utilizzato nel modello piccolo, incisione discreta tra le costole che offrono un peso minimo. Gli animali recuperano molto rapidamente dopo l&#39;intervento chirurgico e non lo fanno i difetti presenti o guarigione disturbato. Lo spazio intercostale inferiore viene preso come punto di riferimento. Considerando questo, il corretto e differenziato accesso al luogo di legatura per cronica e ischemia / riperfusione modella, non solleva seri problemi. La legatura stesso rappresenta la fase più critica. La coronaria discendente sinistra è difficile da essere visualizzato, e spesso ha bisogno di essere vincolati senza vista. Pertanto, alcuni punti di riferimento anatomici sono segnalati per aiutare il chirurgo di eseguire la legatura corretta. Per il modello di infarto cronica, la legatura è collocato nel centro del lato ventrale del cuore, tra il padiglione auricolare e l&#39;apice, sopra la fine dei principali anterior vena (Figura 2B). L&#39;efficienza può essere Controriempito visualizzando l&#39;aspetto del colore grigio nelle zone colpite. Se l&#39;area infartuata appare anteriore e non include la parete posteriore, un nuovo sutura può essere posizionato alla sinistra del primo suture. La radice principale LAD è sempre visibile sotto il padiglione auricolare 18, e quindi non presenta gravi problemi nel rilevare questa parte. Tuttavia, il padiglione auricolare presenta il maggior rischio di sanguinamento e deve essere maneggiato con cura. La procedura è limitata dalla presenza di attrezzature adeguate. Il ventilatore e il sistema adeguato di anestesia per piccoli animali sono costosi e richiedono collegamenti al sistema gas e ventilazione del locale. Inoltre, una stretta sorveglianza degli animali è necessaria nella prima settimana dopo il procedimento per rilevare la possibile clinica. Per esaminare la funzione cardiaca durante l&#39;esperimento, sono tenuti ad alta risoluzione ultrasuoni, complesso perfusione sistema Langendorf, o piccoli intraventricolare misurazioni catetere, involving alti costi e ulteriori competenze. Considerando l&#39;infarto miocardico, non ci sono metodi alternativi di riprodurre la complessità degli eventi in vitro. A seconda del punto di interesse, ex vivo perfusione del cuore isolato nel sistema Langendorff fornisce informazioni sulla contrattilità, funzione cardiaca e vitalità miocardica in risposta a differenti stimoli o farmaci. Tuttavia, esclude tutte le interferenze dei componenti del sangue e del sistema immunitario, e non è indicato per-lunghi studi di rimodellamento e di guarigione dopo infarto miocardico. Dopo aver eseguito la procedura di infarto del miocardio, tutte le altre analisi funzionale può essere effettuata, come la misurazione della pressione intraventricolare, ultrasuoni (piccoli sistemi a ultrasuoni animale) o cuore isolato Langendorff-perfusione. Inoltre, tutte le analisi biologiche e molecolari può essere effettuata per identificare le cellule, proteine, mRNA, microRNA, genes o altri biomarker, che possono essere utilizzati come bersagli terapeutici per sviluppare nuove strategie di trattamento per infarto del miocardio.

L&#39;infarto miocardico è una delle principali cause di morte nei paesi industrializzati. Nonostante innegabili progressi di approcci diagnostici e terapeutici, le malattie cardiovascolari sono ancora la principale causa di mortalità. Data la speranza di vita migliore e rischi connessi con la vita, un continuo aumento dell&#39;incidenza di malattie cardiovascolari è prevista per il futuro. Pertanto, vi è una forte necessità di stabilire e validare nuovi approcci per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Le informazioni di studi sull&#39;uomo soffrono suoi limiti, questi studi sono generalmente sufficienti per spiegare e comprendere i meccanismi a livello molecolare, essendo in grado di fornire soluzioni a questi problemi di salute. Inoltre, la ricerca di base è stato limitato a causa della complessità e difficoltà di riprodurre i meccanismi di malattie cardiovascolari in laboratorio. Pertanto, per aumentare la nostra conoscenza sulla fisiopatologia di cardiomalattie vascolari, è essenziale per convalidare modelli animali 1,2. Tuttavia, per identificare tutte le cascate di eventi molecolari coinvolti nella guarigione dopo infarto miocardico, analisi a differenti tempi è necessaria, causando un gran numero di animali esperimenti. Esperimenti di infarto del miocardio sono spesso eseguiti utilizzando modelli animali. Indurre infarto miocardico nei piccoli animali 3-11 è il modello più adatto ed efficiente impiegato per indagare gli eventi cellulari e molecolari di modelli animali di grandi dimensioni. Inoltre, nessuna altra specie presenta la disponibilità di transgenici o knockout ceppi come mouse a 12. Questi modelli di topo sono molto utili in altre malattie, tra cui patologie cardiovascolari (come l&#39;aterosclerosi, in stent restenosi) 13,14. Inoltre, il periodo di bassa gravidanza e l&#39;elevato numero di progenie qualificano modelli murini come sistema più attraente per lo studio dei meccanismi molecolari di INFA miocardicarction 12. Tuttavia, la dimensione del cuore nei topi aspetta elevata precisione di manipolazione durante microchirurgia. Insegnare tale personale qualificato e specializzato di chirurgia è in termini di tempo e di processo ad alta intensità di lavoro. Pertanto, noi qui presentiamo una procedura di microchirurgia dettagliata, compresi suggerimenti e trucchi per guidare i collaboratori anche con qualifiche medie, come studenti o ai tecnici di eseguire il complesso modello di infarto miocardico nei topi. Inizialmente, l&#39;intubazione viene eseguita mediante una cannula corta senza utilizzare la tracheotomia. L&#39;incisione toracica si trova nella zona intercostali, evitando lesioni di nervature o / e il tessuto circostante. Questo sotto-fase è molto importante per assicurare un veloce recupero e guarigione 15. La legatura è fatta differenziale per i modelli di ischemia cronica e ischemia / riperfusione, per un elevato tasso di sopravvivenza, pur mantenendo una dimensione significativa infarto. La nostra esperienza mostra that con sutura di seta assicura una riproducibilità più elevato rispetto a crio-lesioni 16. In conclusione, il metodo qui descritto è applicabile sia ischemia cronica e modelli di ischemia / riperfusione in piccoli animali. I trucchi e suggerimenti presentati in questo procedimento hanno lo scopo di consentire al personale in possesso della qualifica anche basso o medio da applicare in piccoli modelli animali.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730043</td><td>Model Minient 845</td></tr><tr><td>Dual Anesthesia System (Tabletop Version)</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Selfcontained isofluranebased anesthesia unit for use on lab tables, with a compact 8&quot; x 11&quot; footprint.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Intubation cannula</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732737</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST, Germany</td><td>9119700</td><td>standard tip curved 0.17 mm x 0.1 mm</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST, Germany</td><td>9146011</td><td>straight</td></tr><tr><td>Vannas scissor</td><td>Aesculap, Germany</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>Retractors</td><td>FST, Germany</td><td>1820010</td><td>2.5mm wide</td></tr><tr><td>Retractors</td><td>FST, Germany</td><td>1820011</td><td>5 mm wide</td></tr><tr><td>Wire handles</td><td>FST, Germany</td><td>1820005</td><td>&amp;nbsp;10 cm</td></tr><tr><td>Wire handles</td><td>FST, Germany</td><td>1820006</td><td>&amp;nbsp;14 cm</td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>CEVA, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 2%</td><td>Medistar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthene eye and nose cream</td><td>Bayer, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tube</td><td>IFK Isofluor, Germany</td><td>custommade&amp;nbsp; product</td><td>diameter 500 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>section thickness 100 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polytetrafluorethylene catheter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROLENE Suture 6/0&amp;nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>8707H</td><td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC1, 13 mm, 3/8 Circle</td></tr><tr><td>7/0 Silk</td><td>Seraflex</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound&amp;nbsp;</td><td>Vevo, Canada</td><td>770 Vevo</td><td></td></tr></tbody></table>

minimal invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice

Infarto del miocardio rimane ancora la principale causa di morte nei paesi occidentali, nonostante i notevoli progressi nel settore dello sviluppo dello stent negli ultimi decenni. Per chiarimento dei meccanismi alla base e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, la disponibilità di modelli animali validi sono obbligatori. Dal momento che abbiamo bisogno di nuove intuizioni in meccanismi patogenetici delle malattie cardiovascolari sotto le condizioni in vivo per combattere l&#39;infarto del miocardio, la validità del modello animale è un aspetto cruciale. Tuttavia, la protezione degli animali sono molto rilevante in questo contesto. Pertanto, stabiliamo un modello mini-invasiva e semplice di infarto miocardico nei topi, che garantisce una riproducibilità elevata e il tasso di sopravvivenza degli animali. Così, questo modello soddisfa i requisiti del principio 3R (Replacement, miglioramento e riduzione) per gli esperimenti sugli animali e garantire le informazioni scientifiche necessarie per l&#39;ulteriore sviluppo di strategie terapeutiche per cardiovmalattie ascular.

La procedura di infarto miocardico si verifica entro 25-30 minuti e mostra un tasso di mortalità del 10%. Dopo l&#39;intervento chirurgico, i topi recuperare da anestesia entro il prossimo 15 min. Nessun danno fisico è stato osservato al mouse operato. Tuttavia, vi è un elevato rischio di rottura cuore una settimana dopo infarto miocardico post-cronica, se i processi di riparazione sono disturbati durante la fase infiammatoria. Poiché cuore è in grado di modificare significativamente le dimensioni durante il pompaggio, è importante che tutti i cuori ottenuti da arrestare nella stessa posizione, ad esempio in Diastola. Ciò può essere ottenuto mediante perfusione del cuore con soluzione KCl satura. Aumento blocchi concentrazione extracellulare K + pompe ioniche, diminuisce il potenziale di membrana delle cellule cardiache, causando un arresto diastolico dell&#39;attività cardiaca. L&#39;area del miocardio può essere visto in analisi ad ultrasuoni (Figura 3A, pannello inferiore). In confronto amiocardio normale, regioni ischemiche apparire sottile e ipocinetico (figura 3A, pannello superiore). A seconda del modello utilizzato, la dimensione del miocardio sarà diverso. Il modello di infarto cronica induce circolare, infarto transmurale dell&#39;apice (figura 3B), mentre l&#39;ischemia / riperfusione induce un sottile, mezza parete e per tutta cuore (Figura 3C). Ci sono molti metodi per determinare le dimensioni del miocardio. Se l&#39;obiettivo è quello di analizzare l&#39;effetto diretto sulla vitalità cardiaca, un Evans-Blue / TTC colorazione 18 è indicato da eseguire almeno 2 ore dopo la riperfusione, per essere in grado di vedere eventuali cambiamenti nel miocardio. Le sezioni possono essere analizzati immediatamente (figura 3B, pannello centrale) dopo colorazione o possono essere mantenuti fra vetrini in formalina per 2-3 giorni (Figura 3C, pannello centrale). L&#39;area blu rappresenta il miocardio sano, non affetti da ischemia. La zona rossa rappresenta il miocardio vitale all&#39;interno the area ischemica (miocardio rischio), e l&#39;area bianca rappresenta il tessuto morto. Solitamente, la dimensione infarto è espressa come percentuale della zona a rischio. La cicatrice maturo risultante dopo processi di rimodellamento può essere facilmente misurato con immunohistolgy utilizzando uno-fase di colorazione di Gomori. Aree blu-tinto infartuati e rosse macchiate sani ventricolari (Figura 3B e C, i pannelli di destra) sono determinati nella prima sezione di ciascun livello fino alla valvola mitrale. Per evitare la variazione dovuta al legame LAD a diversi livelli, l&#39;infarto da ogni sezione è considerata ed espresso come percentuale del volume totale del ventricolo sinistro. Un volume infarto del 15-20% nel modello infarto cronica e del 10-15% dopo modello ischemia / riperfusione può essere raggiunto. Inoltre, il modello di infarto cronico induce una dilatazione accentuato, non osservate nel modello ischemico / riperfusione (Figura 3B e C righPannello t). Procedure di colorazione convenzionali possono essere utilizzati, come ad esempio: la colorazione CD31 utilizzato per rivelare la angiogenesi (rosso, figura 4A) o liscio colorazione actina del muscolo per determinare miofibroblasti (verde, figura 4B). Doppia colorazione in fluorescenza può essere applicato anche per identificare differenti molecole bersaglio nella zona infarto, poiché l&#39;assenza di cardiomiociti fornisce alcuna auto-immunofluorescenza (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig1.jpg" /> Figura 1: Incisione mediale ed inserimento della cannula del intubazione (A). La visualizzazione stereomicroscopio della cannula metallica attraverso la trasparenza del tessuto (B). Gli anelli tracheali (frecce blu) e la cannula (freccia nera) sono evidenziate. L&#39;incisione intercostali per il mo infarto cronicodel e la legatura di LAD (C). La legatura si trova al centro del cuore (tra il padiglione auricolare e apice, nero pannello inferiore), prendendo come riferimento la fine della vena (schematica in blu, pannello inferiore). Entrambi i rami dell&#39;arteria devono essere vincolati (rosso a pannello inferiore). Il colore grigio indica dell&#39;area infartuata e appare nella mezza parte inferiore del cuore (riquadro in basso a destra). La legatura per il modello di ischemia / riperfusione è fatto sotto il padiglione auricolare, legando il corpo principale della LAD (rosso pannello inferiore) su un tubo di silicone (destra) (D). Il colore grigio indica l&#39;area d&#39;infarto, che è presente su tutto il cuore (pannello in basso a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig2.jpg" /> Figura 2: </strong&gt; Le guarnizioni sutura nervature l&#39;incisione toracica se le suture mediali sono posizionati a un angolo di 90 ° in entrambe cronica (A) e ischemia / riperfusione modello (B, pannello di sinistra). immagini in vivo di nervature di sutura (C, pannello di sinistra ), la sutura dei muscoli (C, pannello centrale) e suturare la pelle (C, pannello di destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig3.jpg" /> Figura 3: immagini ecocardiografiche. Immagini di normale (A, pannello superiore) e aree infartuati (A, pannello inferiore), vengono acquisiti in asse lungo (, pannelli longitudinali sinistra) o in asse corto (trasversale, pannelli di destra) .. miocardio indotta da legatura cronica(B) e da una ischemia hr seguita da riperfusione (C). Evans blu / TTC colorazione permette di identificare perfuso (blu) / zone non perfuso nonché il vitali (rosso) / morti (bianco) miocardio (B, C, pannelli centrali). Di uno stadio di colorazione di Gomori permette l&#39;individuazione delle aree infartuati (blu), e li differenzia dalle normali regioni (rosso) (B, C, pannelli di destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig4.jpg" /> Figura 4: differenti colorazioni possono essere eseguite nella zona d&#39;infarto, come descritto al CD31 neo-angiogenesi (A, rosso, frecce semplici), o actina muscolo liscio per miofibroblasti (B, green, frecce semplici), così come doppia colorazione (C, CD31-rosso / actina-verde del muscolo liscio), contrastate con DAPI per nuclei (blu). Miofibroblasti possono essere differenziati facilmente da cellule muscolari lisce da piccoli o grandi arterie, che sono sempre accompagnati da uno strato endoteliale (C, frecce). Doppie frecce puntano il eritrociti autofluorescenza. Scala bar 50 micron.

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Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal procedura chirurgica invasiva di indurre infarto miocardico nei topi

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

minimal-invasive-surgical-procedure-inducing-myocardial-infarction

Research

JoVE Journal

Medicine

27.5K Views.  RWTH Aachen University, Germany. A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Legatura dell&#39;arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Ricerca

Medicina

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Tecnica modificata di legatura dell&#39;arteria coronarica in Mouse

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa valutazione della struttura del miocardio, la funzione, la perfusione e sostenibilità Utilizzando cardiaca micro-tomografia computerizzata

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioingegneria

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Metodo semi-minimo invasivo per indurre l'infarto miocardico nei ratti e la valutazione della funzione cardiaca da parte di un sistema cardiaco funzionante isolato

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI remodeling and evaluation of novel therapeutics. Different methods (e.g., isoproterenol treatment, cryoinjury, coronary artery ligation, etc.) have been used to induce MI. Compared with isoproterenol treatment and cryoinjury, coronary artery ligation may better reflect the ischemic response and chronic remodeling after MI. However, traditional methods for coronary ligation in mice are technically challenging. The current study describes a simple and efficient process for induction of MI in mice with readily available materials. The mouse chest skin was cut open under stable anesthesia. The heart was immediately externalized through the intercostal space after blunt separation of the pectoralis major and pectoralis minor. The left anterior descending branch (LAD) was ligated with a 6-0 suture 3 mm from its origin. Following LAD ligation, staining with 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) indicated successful induction of MI and temporal changes of post-MI scar size. Meanwhile, survival analysis results showed overt mortality within 7 days after MI, mainly due to cardiac rupture. Moreover, post-MI echocardiographic assessment demonstrated successful induction of contractile dysfunction and ventricular remodeling. Once mastered, an MI model can be established in mice within 2-3 min with readily available materials.

Under adequate anesthesia, the mouse heart was externalized through the intercostal space, and myocardial infarction was successfully induced by ligating the left anterior descending artery (LAD) using materials readily available in most laboratories.

Un metodo semplice modificato per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Induzione di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

Impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Left Coronary Artery Ligation: A Surgical Murine Model of Myocardial Infarction

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In order to explore the pathophysiological changes after myocardial infarction and design future treatments, research models of MI are required. Permanent ligation of the left coronary artery (LCA) in mice is a popular model to investigate cardiac function and ventricular remodeling post MI. Here we describe a less invasive, reliable, and reproducible surgical murine MI model by permanent ligation of the LCA. Our surgical model comprises of an easily reversible general anesthesia, endotracheal intubation that does not require a tracheotomy, and a thoracotomy. Electrocardiography and troponin measurement should be performed to ensure MI. Echocardiography at day 28 after MI will discern heart function and heart failure parameters. The degree of cardiac fibrosis can be evaluated by Masson's trichrome staining and cardiac MRI. This MI model is useful for studying the pathophysiological and immunological alterations after MI.

Presented here is a surgical procedure for permanent ligation of the left coronary artery in mice. This model can be used to investigate the pathophysiology and associated inflammatory response after myocardial infarction.

Legatura coronaria sinistra: un modello chirurgico murino di infarto miocardico

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In ...

Minimal procedura chirurgica invasiva di indurre infarto miocardico nei topi

Riepilogo

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Legatura dell'arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Tecnica modificata di legatura dell'arteria coronarica in Mouse