Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.

NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo sono stati approvati dalla sottocommissione per la ricerca cura degli animali, che serve come la cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) per il Massachusetts General Hospital, e sono in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute. 1. Animal Housing e procedura Handling <ol><li> All&#39;arrivo, casa adulti Sprague Dawley femmine circa 8-10 settimane di età (del peso di 200-225 g) in gruppi di bidoni di plastica 3-4 pollici con biancheria da letto di cippato. A mantenere una dieta ad libitum accesso a Chow e acqua e un 12 hr luce / buio ciclo. Lasciare ratti per ambientarsi alla condizioni abitative e animali struttura per un minimo di 1 settimana. NOTA: Tutte le procedure di questo manoscritto sono condotti durante il ciclo di luce. </li><li> In seguito a questo periodo di acclimatazione, di gestire tutti gli animali per 5 minuti ciascuno per 2-3 giorni. Correttamente prendere i topi uno alla volta (sostenuto dal torso e non per la coda),tenerli saldamente, e li animali durante questo tempo. Maneggiare animali che appaiono più stressati, nervosi, ansiosi o per periodi di tempo più lunghi. Fate questo per ridurre al minimo la manipolazione dello stress, che possono incidere sui seguenti operazioni in questo protocollo. NOTA: Il numero di giorni e la quantità di gestire gli animali può variare tra i diversi laboratori di tempo; tuttavia, questi dovrebbero essere coerenti tra esperimenti all&#39;interno dello stesso laboratorio. </li></ol> 2. Monitoraggio del ciclo estrale: tamponi vaginali sbavature e Procedura di colorazione <ol><li> Preparare la soluzione salina allo 0,9% (cloruro di sodio sciolto in acqua distillata). Inumidire un cotton fioc in questa soluzione. Asciugare la punta con un tovagliolo di carta per evitare di sovrasaturazione, che potrebbe portare il campionario inadeguata o la perdita di cellule. Tenendo la coda verso l&#39;alto dalla apertura vaginale, inserire delicatamente la punta di cotone nel canale vaginale e tirare intorno alle mura di catturare le cellule vaginali sciolti. </li><li> Se l&#39;animale urina sul lettinoTip Ton, sostituirlo con uno nuovo, come la contaminazione delle urine sarà difficile per l&#39;identificazione di fase. Fare molta attenzione per non causare disagi all&#39;animale durante questa procedura, perché l&#39;esposizione allo stress sarà interrompere il ciclo estrale. Quando tampone, mirare a raggiungere un inserimento rapido e il ritiro che non sia troppo profonda da ridurre al minimo stimolo in più per la cervice, che può indurre pseudogravidanza. NOTA: Pseudopregnancy può essere identificato come un ciclo estrale aciclico che in genere dura per circa 12 giorni, cioè giorni consecutivi di diestrus 25. </li><li> Rimuovere con attenzione la punta dell&#39;applicatore e rotolare su un vetrino da microscopio pre-etichettati. Evitare premendo troppo duro come troppo liquido sul vetrino può rendere l&#39;identificazione fase difficile, una volta asciutta. NOTA: Una diapositiva può contenere più giorni per ogni animale, anche se questo può essere fatto in base alle preferenze individuali. </li><li> Assicurarsi che i trasferimenti del campione sul vetrino. Raccogliere campioni per severAL giorni consecutivi in ​​una diapositiva per poter meglio traccia e identificare quotidiane fasi estro modifiche. NOTA: Se possibile, è ideale anche se le persone che raccolgono campioni rimangono le stesse per tutti gli animali. </li><li> Una volta che la slitta è asciutto, iniziare il protocollo di colorazione per l&#39;identificazione di fase. Utilizzando il kit di colorazione (vedi Tabella dei Materiali), immergere i vetrini 10 volte in fissativo (azzurro), 10 volte in soluzione colorante (rosa), e 5 volte in soluzione di contrasto (viola). Sciacquare scivola delicatamente con acqua corrente. Lasciate asciugare completamente le diapositive prima visione al microscopio. NOTA: Il lungo ciclo estrale tipicamente 4-5 giorni è composto da (in questo ordine): estro (E), metestrus (M), diestrus (D), e proestrus (P) 26. Estrus è caratterizzata da blu, cellule corneo, metestrus dai leucociti e una combinazione di cellule nucleate e cornified, diestrus è simile a metestrus in presenza di tipi cellulari eccetto quando sono molto scarse, e proestrus da aggregati viola tintocellule nucleate di (figura 1). Ci sono varie procedure di colorazione, oltre a quelli sopra descritti, che sono ugualmente efficaci per striscio vaginale citologia. </li><li> Raccogliere i campioni per almeno due cicli completi (~ 8-10 giorni) al fine di monitorare le fasi accuratamente prima sperimentazione. Essere coerente con l&#39;ora del giorno del prelievo del campione. Raccogliere campioni striscio vaginale giornaliero durante e fino alla fine dell&#39;esperimento. </li></ol> 3. Pre-esposizione <ol><li> Prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, pre-esporre gli animali al condizionamento camere consentono agli animali di acclimatarsi al contesto (camere di condizionamento) prima di ogni prova comportamentale. <ol><li> Pre-esporre le femmine alle camere di condizionamento (che si trova in scatole-attenuazione del suono) con le luci di casa avanti per 20-30 minuti al giorno per 3 giorni prima di ogni sperimentazione. Assegnare scatola sono pre-esposta come loro camera per lo studio. Pulire accuratamente tlui scatole (pareti e vassoi) tra le sessioni e gli animali per eliminare gli odori in quanto possono influenzare il comportamento e ciclo estrale. </li></ol></li></ol> 4. Giorno 1: assuefazione / Paura condizionata <ol><li> Una volta che gli animali sono stati verificati per essere nella fase estro dei cicli di estro, inizia la fase di assuefazione / condizionamento dell&#39;esperimento 3 giorni. <ol><li> Prendere pre-tone misure basali di congelamento precedenti allo stimolo primo tono condizionata (CS) presentazioni ogni giorno dell&#39;esperimento. A tale scopo, l&#39;acquisizione di punteggi per cento di congelamento (calcolato dividendo i secondi trascorsi immobile per la durata della prova, moltiplicato per 100) durante l&#39;intervallo di tempo stimolo assente all&#39;inizio della prima prova CS-alone prima dell&#39;inizio CS. NOTA: Queste misure possono essere utilizzati per valutare e confrontare i livelli di congelamento basali con quelli durante assuefazione, condizionata, l&#39;estinzione, e richiamo. </li><li> Per condurre la formazione di estinzione durante la fase metestrus,condizionare i topi nel loro ultimo giorno di estro. Tampone e identificare fase estrale (step 2) ogni giorno prima di iniziare il protocollo sperimentale (condizionata / estinzione / richiamo). Poiché la fase di estro può durare più a lungo di un giorno, la storia del ciclo uso per predire la lunghezza delle fasi per determinare quando gli animali sono pronti per iniziare l&#39;allenamento. </li></ol></li><li> Nelle camere di condizionamento, collegare il piano rete foot-shock per un generatore di stimolazione elettrica. Usare un livello di stimolazione di 0,5-0,6 mA come stimolo incondizionato (US). Utilizzare un 4 kHz, 80 dB tono come stimolo condizionato (CS). NOTA: Questi parametri possono variare tra i laboratori e possono essere modificati per il condizionamento ottimale. <ol><li> Se il programma di analisi congelamento richiede segnali visivi (a differenza temporale), co-attivare una luce LED con il tono. Posizionare la luce all&#39;esterno della camera operante, all&#39;interno del fotogramma video. All&#39;inizio di ogni prova, attivare la luce LED e tenerlo accesa finché l&#39;estremità di The di prova. NOTA: Questa luce non è visibile da animali e serve solo come marcatore per l&#39;inizio e la fine del processo entro i file video registrati (da utilizzare per misurare il comportamento di congelamento). </li></ol></li><li> Mettere gli animali nelle camere di condizionamento per 5 studi CS-alone di assuefazione. Subito dopo la sessione di assuefazione, eseguire 7 coppie prove CS-USA del condizionamento alla paura. Assicurarsi che il tono CS dura 30 secondi e coterminates con il 0,5 sec Uniti shock. Eseguire le prove in tutte le sessioni (assuefazione, condizionata, l&#39;estinzione, e richiamo) con un intervallo tra le prove variabile in media 3 minuti. </li><li> Alla fine della sessione di condizionamento, rispedire gli animali loro gabbie a casa e al stabulario fino al giorno successivo. </li></ol> 5. Giorno 2: Estradiolo Preparazione <ol><li> Tampone e identificare la fase estrale per tutti gli animali sottoposti Day 1 di questo protocollo. Preparare estradiolo (noto anche come E2, 17-beta-estradiolo, obeta-estradiolo) per una dose di 15 mcg kg / iniezione sottocutanea con olio di sesamo o 0,9% soluzione salina come veicolo. </li><li> Per calcolare la quantità di estradiolo per prepararsi per le iniezioni, usare i pesi del corpo di tutti gli animali, che sono stati misurati e registrati quando sono stati condizionati al Day 1 del presente protocollo. </li><li> Fare i calcoli di standardizzare il volume somministrato di estradiolo (cioè 0,2 ml) per ratto. Poiché estradiolo è difficile da sciogliere per la sua insolubilità in acqua e richiede un grande volume di solvente per la piccola dose, preparare una soluzione madre mescolando estradiolo in olio di sesamo a fuoco fino a dissoluzione. La soluzione può quindi essere fatto passare attraverso un filtro di 0,22 micron per rimuovere i contaminanti. Ad esempio, aggiungere un volume calcolato di un / 1 ml di soluzione di olio di sesamo magazzino 3.000 mg estradiolo al volume totale di olio di sesamo necessaria per ottenere una dose di 15 mg / kg in un volume di 0,2 ml di iniezione per animale. NOTA: In alternativa, utilizzare altre forme di estrogeni tha<html> t è solubile in acqua e più facile da dissolvere. </li></ol> 6. Giorno 2: Estradiolo Amministrazione / Estinzione Training <ol><li> Amministrare il sottocutanea estradiolo. Sollevare la pelle flaccida tra la scapola per il collo in una presa dolce e inserire l&#39;ago della siringa nel triangolo che si forma dalle pieghe cutanee. </li><li> 30 minuti dopo iniezioni sottocutanee di estradiolo, mettono gli animali nelle camere di condizionamento di nuovo e iniziano la formazione di estinzione. In questa sessione di estinzione, effettuare 20 prove CS-alone, con ogni prova consistente in un 30 secondi, 4 kHz, 80 dB tono, presentato in un intervallo tra le prove variabile in media 3 min. NOTA: L&#39;effetto dell&#39;estradiolo sul richiamo si verifica quando l&#39;estradiolo viene somministrato prima formazione estinzione o immediatamente dopo l&#39;estinzione. L&#39;effetto non è stato osservato 4 ore post-estinzione, per cui si consiglia di iniettare vicino in tempo per l&#39;inizio o alla fine della sessione di allenamento 15. </li></ol>. Le &quot;&gt; 7 Giorno 3: Extinction Recall <ol><li> 24 ore dopo l&#39;allenamento di estinzione, tampone gli animali che hanno completato giorno 1 e 2 del presente protocollo. </li><li> Mettere gli animali nelle loro camere di condizionamento assegnati (stessi come giorno 1 e 2). Iniziare la sessione di richiamo di estinzione con la presentazione di 3 studi CS-alone (le tre prove di richiamo di estinzione), che consiste di soli 3,80 dB prove CS-alone con intervalli tra le prove simili a 20 prove somministrate per la formazione di estinzione come descritto al punto 6.2. </li><li> Al termine della sessione di richiamo, rispedire gli animali loro gabbie a casa. </li></ol> Analisi 8. Dati <ol><li> Acquisire dati comportamentali attraverso il video e analizzarli utilizzando il software del computer. NOTA: Congelamento punteggi possono anche essere contati manualmente uno sperimentatore che è cieco al trattamento farmacologico cronometrando attacchi congelamento durante la presentazione CS di ogni prova, espresso come percentuale del tempo speso congelamento durante il tono. Congelamento èdefinita dalla completa mancanza di movimento con l&#39;eccezione di respirazione durante le prove 30 sec CS-USA. Calcolare cento congelamento dividendo i secondi trascorsi congelamento (immobile) per 30 secondi (durata della prova) moltiplicato per 100. </li></ol>

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Gli autori di questo manoscritto non hanno interessi finanziari in competizione o altri conflitti di interesse da dichiarare.

La paura di estinzione è stata ampiamente studiata in ratti maschi con i meccanismi neurali che mediano condizionato estinzione paura individuati e valutati in diverse manipolazioni. Relativamente pochi studi hanno esaminato topi di sesso femminile o il ruolo degli ormoni gonadici nella paura di estinzione. Per studiare specificamente gli effetti degli estrogeni sulla paura estinzione, naturalmente ciclismo ratti femmine sono sottoposti ad un paradigma comportamentale di tre giorni. Questa procedura si compone di fasi ...

Differenze di sesso inerenti si osservano in vari comportamenti cognitivi e paradigmi di apprendimento in entrambi gli esseri umani e roditori. Ad esempio, è stato riportato che le donne hanno generalmente abilità verbali e orientato al dettaglio più forti, mentre gli uomini hanno migliori abilità spaziali 1-3. Queste differenze di sesso può essere dovuto in parte l&#39;influenza degli ormoni gonadici. Alti livelli di estradiolo migliorare le prestazioni in compiti in cui le donne sono migliori, ma peggiorano le prestazioni in compiti che gli uomini in genere fanno bene 4-6. Anche se questa prova è convincente, la limitata capacità di controllare completamente gli ambienti sperimentali in studi sull&#39;uomo rende difficile determinare se questi effetti sul comportamento possono essere attribuiti specificamente agli ormoni. Gli studi su animali, al contrario, permettono di circostanze completamente controllate. Anche se i meccanismi neurali di base della paura dell&#39;estinzione sono stati identificati e sono ben studiata nei maschi, non è chiaro sequesti sistemi sono gli stessi nelle femmine o come cambiano in tutto il ciclo estrale. La paura condizionata ed estinzione sono ampiamente utilizzati paradigmi comportamentali nei roditori e nell&#39;uomo per condurre studi in materia di disturbi d&#39;ansia. Dato che le donne hanno un rischio più elevato per i disturbi d&#39;ansia e maggiore durata dei sintomi e la gravità 7-13, è fondamentale per comprendere le femmine in questi studi. La sottorappresentazione delle donne in questa ricerca può essere attribuita alle sfide del monitoraggio fase estrale e contabile per gli effetti comportamentali degli ormoni sessuali. I laboratori che fanno esaminare le femmine a questo proposito le questioni di incontro che spesso vanno non dichiarata o non sono descritte nei metodi per i loro studi. Emergenti prove in roditori suggeriscono che le differenze di sesso nella paura di estinzione sono modulati dagli ormoni gonadici 14-18. In condizionamento alla paura, gli animali vengono addestrati a temere uno stimolo particolare. Dopo una serie di presentazioni di non rinforzatilo stimolo, gli animali imparano a non temere la stecca, un processo chiamato di estinzione. Quanto bene apprende l&#39;animale e consolida il ricordo di imparare questa attività si può osservare nel corso di un test di richiamo di estinzione dato qualche tempo dopo la formazione di estinzione. Espressione paura Meno durante il richiamo estinzione dimostra buon consolidamento della memoria estinzione. Recenti scoperte dal nostro laboratorio indicano che gli estrogeni possono modulare il consolidamento della memoria paura dell&#39;estinzione e migliorare richiamo estinzione. In particolare, i topi femmina che si estinguono proestrus, la fase del ciclo estrale durante il quale livelli circolanti di estrogeni picco, mostra una maggiore ritenzione della memoria estinzione. Al contrario, le donne che sono estinte nel basso-estrogeno visualizzazione della fase metestrus relativamente scarsa memoria di estinzione, che possono essere migliorati con la somministrazione di estradiolo esogeno prima o immediatamente dopo l&#39;estinzione allenamento 15,16. I meccanismi neurali di consolidamento della memoria di estinzione (inclUding il ruolo degli ormoni gonadici) nelle donne non sono chiare. Negli animali da laboratorio, il ruolo degli ormoni può essere indagato utilizzando invasive procedure di rimozione chirurgiche come la castrazione e ovariectomia. Dopo il recupero da un intervento chirurgico, ormoni gonadici sono spesso esogena manipolati durante l&#39;esecuzione di un compito comportamentale 19. Questo approccio ha fornito informazioni critiche su ormoni sessuali ed è utile perché permette di manipolazioni ben controllati di ormoni gonadici (in termini di tempi e di dose) 20-23. Questo approccio, tuttavia, non valutare l&#39;influenza delle fluttuazioni naturali che si verificano nel corso del ciclo estrale non rappresentano animali &quot;normali&quot;, limitando così il potenziale traslazionale per studi sull&#39;uomo. E &#39;stato ben documentato che i livelli di ormone sessuale femminile picco e il declino a specifiche fasi del ciclo estrale, e cambiamenti di espressione dei recettori degli estrogeni all&#39;interno del ciclo,e dopo ovariectomia 24. Quindi, vi è la necessità di condurre studi su femmine con gonadi intatti e perfezionare progetti sperimentali per studiare in modo affidabile gli effetti che gli stati alti e bassi di estrogeni possono avere su donne in tutta la loro durata di vita. Questo protocollo concentra sull&#39;effetto degli estrogeni sui sistemi neurobiologici coinvolti nella paura estinzione. Si descrive come: 1) monitorare attentamente il ciclo estrale, 2) preparare le dosi efficaci di estradiolo per somministrazione sistemica, e 3) seguire un paradigma comportamentale che include condizionamento alla paura, l&#39;estinzione, e richiamare in modo naturale in bicicletta ratti femmina. Questo protocollo può essere modificato con altre manipolazioni farmacologiche e strumenti molecolari e cellulari per aiutare gli studi per capire meglio le differenze di sesso che si osservano in condizionato temere comportamento estinzione. Si noti che le procedure descritte qui sotto sono quelli utilizzati nel nostro laboratorio, ed esistono un certo numero di varianti di queste procedure in letteratura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="613">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog number</td>
			<td style="width:199px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Fear conditioning chamber</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Graphic State</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Sound-attenuating box</td>
			<td style="width:159px;">Med Associates, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">NIR-022MD</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Estradiol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E1024</td>
			<td style="width:199px;">In sesame oil for subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Sesame oil</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S3547-250ML</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Freezescan</td>
			<td style="width:159px;">Cleversys, Inc.</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Dip quick stain</td>
			<td style="width:159px;">Jorgensen Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">J0322A1, J0322A2, J0322A3</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">23-400-114</td>
			<td style="width:199px;">6-inch, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">0.9% saline</td>
			<td style="width:159px;">LabChem, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">LC23460-2</td>
			<td style="width:199px;">Sodium chloride w/v</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Selectfrost microscope slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-550-003</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Virex II 256</td>
			<td style="width:159px;">Diversey, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">5019317</td>
			<td style="width:199px;">Dilute 1:256 with water</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Luer-Lok Tip 1ml Syringes</td>
			<td style="width:159px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:135px;">309628</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:120px;">Hypodermic disposable needles</td>
			<td style="width:159px;">Exelint International, Co.</td>
			<td style="width:135px;">26402</td>
			<td style="width:199px;">26-gauge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats

Estinzione della paura condizionata è stata ampiamente studiata nei roditori maschi. Recentemente, ci sono stati un numero crescente di studi che indicano che i meccanismi neurali per determinati compiti comportamentali e comportamenti di risposta sono diversi in femmine e maschi. Utilizzando femmine in studi di ricerca può rappresentare una sfida a causa della variazione di ormoni gonadici durante il loro ciclo estrale. Questo protocollo descrive le procedure consolidate che sono utili nelle indagini il ruolo degli estrogeni nella paura consolidamento della memoria estinzione nei ratti femmina. Fase del ciclo estrale e somministrazione di estrogeni esogeni prima formazione all&#39;estinzione può influenzare richiamo estinzione 24 ore più tardi. La tecnica swabbing vaginale per l&#39;identificazione fase estrale descritto favorisce l&#39;esame e la manipolazione di ciclismo naturalmente ormoni gonadici. L&#39;utilizzo di questo modello di roditore di base può ulteriormente delineare i meccanismi attraverso i quali gli estrogeni possono modulare paura memoria estinzionefemmine.

In questo protocollo richiamo paura dell&#39;estinzione, per cento di congelamento è stata misurata come indicatore della paura. Gli animali che estinte bene e conservate la memoria della formazione dell&#39;estinzione esposte basso paura l&#39;ultimo giorno di test comportamentali durante il richiamo di estinzione. Ratti maschi e femmine non presentano differenze significative nell&#39;espressione paura condizionata durante il condizionamento, l&#39;estinzione, e ricordano le fasi (Figura 2). Tuttavia...

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Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Protocollo per lo studio Extinction of Fear Condizionata in Naturalmente bicicletta ratti di sesso femminile

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Research

JoVE Journal

Behavior

13.1K Views.  Massachusetts General Hospital. Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

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Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Ricerca

Comportamento

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during abstinence. Moreover, various environmental challenges can exacerbate this effect, as well as increase ongoing drug intake.
The procedure we describe here highlights the impact of a common environmental challenge, food restriction, on drug craving that is expressed as an augmentation of drug seeking in abstinent rats.
Rats are implanted with chronic intravenous i.v. catheters, and then trained to press a lever for i.v. heroin over a period of 10-12 days. Following the heroin self-administration phase the rats are removed from the operant conditioning chambers and housed in the animal care facility for a period of at least 14 days. While one group is maintained under unrestricted access to food (sated group), a second group (FDR group) is exposed to a mild food restriction regimen that results in their body weights maintained at 90% of their nonrestricted body weight. On day 14 of food restriction the rats are transferred back to the drug-training environment, and a drug-seeking test is run under extinction conditions (i.e.&#160;lever presses do not result in heroin delivery).
The procedure presented here results in a highly robust augmentation of heroin seeking on test day in the food restricted rats. In addition, compared to the acute food deprivation manipulations we have used before, the current procedure is a more clinically relevant model for the impact of caloric restriction on drug seeking. Moreover, it might be closer to the human condition as the rats are not required to go through an extinction-training phase before the drug-seeking test, which is an integral component of the popular reinstatement procedure.

A procedure that allows a demonstration of robust augmentation of drug seeking in food-restricted rats is described. Following heroin self-administration training, rats go through an abstinence period, in a drug-free environment, during which they are mildly food restricted. Drug seeking is then tested in the drug-associated environment.

Una procedura per studiare l&#39;effetto della prolungata restrizione alimentare sulla Cerco eroina nei ratti in astinenza

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association between environmental cues and aversive experiences. In this test, mice are placed into a conditioning chamber and are given parings of a conditioned stimulus (an auditory cue) and an aversive unconditioned stimulus (an electric footshock). After a delay time, the mice are exposed to the same conditioning chamber and a differently shaped chamber with presentation of the auditory cue. Freezing behavior during the test is measured as an index of fear memory. To analyze the behavior automatically, we have developed a video analyzing system using the ImageFZ application software program, which is available as a free download at http://www.mouse-phenotype.org/. Here, to show the details of our protocol, we demonstrate our procedure for the contextual and cued fear conditioning test in C57BL/6J mice using the ImageFZ system. In addition, we validated our protocol and the video analyzing system performance by comparing freezing time measured by the ImageFZ system or a photobeam-based computer measurement system with that scored by a human observer. As shown in our representative results, the data obtained by ImageFZ were similar to those analyzed by a human observer, indicating that the behavioral analysis using the ImageFZ system is highly reliable. The present movie article provides detailed information regarding the test procedures and will promote understanding of the experimental situation.

This article presents a protocol for a contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system to assess fear learning and memory in mice.

Contestuali e Cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video Analizzare in topi

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Trace paura condizionata in topi

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate drug-seeking behavior and prompt relapse in abstinent drug users. We have developed a procedure to study the behavioral and neural processes that mediate the impact of context on alcohol-seeking behavior in rats. Following acclimation to the taste and pharmacological effects of 15% ethanol in the home cage, male Long-Evans rats receive Pavlovian discrimination training (PDT) in conditioning chambers. In each daily (Mon-Fri) PDT session, 16 trials each of two different 10 sec auditory conditioned stimuli occur. During one stimulus, the CS+, 0.2 ml of 15% ethanol is delivered into a fluid port for oral consumption. The second stimulus, the CS-, is not paired with ethanol. Across sessions, entries into the fluid port during the CS+ increase, whereas entries during the CS- stabilize at a lower level, indicating that a predictive association between the CS+ and ethanol is acquired. During PDT each chamber is equipped with a specific configuration of visual, olfactory and tactile contextual stimuli. Following PDT, extinction training is conducted in the same chamber that is now equipped with a different configuration of contextual stimuli. The CS+ and CS- are presented as before, but ethanol is withheld, which causes a gradual decline in port entries during the CS+. At test, rats are placed back into the PDT context and presented with the CS+ and CS- as before, but without ethanol. This manipulation triggers a robust and selective increase in the number of port entries made during the alcohol predictive CS+, with no change in responding during the CS-. This effect, referred to as context-induced renewal, illustrates the powerful capacity of contexts associated with alcohol consumption to stimulate alcohol-seeking behavior in response to Pavlovian alcohol cues.

A procedure to study the capacity of an alcohol associated environmental context to trigger the renewal of alcohol-seeking behavior in rats is described.

Una Procedura di osservare Context-indotta Rinnovo pavloviano condizionata alcol-seeking comportamento in Rats

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

A Treatment Package without Escape Extinction to Address Food Selectivity

Feeding difficulties and feeding disorders are a commonly occurring problem for young children, particularly children with developmental delays including autism. Behavior analytic interventions for the treatment of feeding difficulties oftentimes include escape extinction as a primary component of treatment. The use of escape extinction, while effective, may be problematic as it is also associated with the emergence of challenging behavior (e.g., extinction burst). Such challenging behavior may be an acceptable side effect in treatment cases where feeding problems are severe and chronic (e.g., failure to thrive). However, in more acute cases (e.g., selective eating), the negative side effect may be unwarranted and undesired. More recent research on the behavioral treatment of food selectivity has begun to evaluate treatments for feeding difficulties that do not include escape extinction (e.g., demand fading, behavioral momentum), with some success. However, research to date reveals individual differences in responsiveness to such treatments and no clear preferable treatment has emerged. This manuscript describes a multi-component treatment package that includes shaping, sequential presentation and simultaneous presentation, for the treatment of food selectivity in four young children with developmental delays. This treatment package extends the literature on the behavioral treatment for food selectivity and offers a multi-component treatment protocol that may be clinically applicable across a range of treatment scenarios and settings.

Feeding difficulties are a common problem for children with developmental disorders, including autism, and behavioral interventions often include escape extinction. Recent research has begun to evaluate treatments that do not include escape extinction. This manuscript describes a multicomponent treatment package that does not use escape extinction to treat feeding difficulties.

Un Pacchetto Trattamento senza Fuga Estinzione di Indirizzo alimentare Selettività

Feeding difficulties and feeding disorders are a commonly occurring problem for young children, particularly children with developmental delays including ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Stimolazione del nervo vago come strumento per indurre plasticità Percorsi rilevanti per l&#39;apprendimento Extinction

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the attribution of incentive salience, or the transformation of neutral stimuli into attractive, &#34;wanted&#39; stimuli capable of motivating behavior. Pavlovian conditioned approach (PCA) develops after the response-independent presentation of a conditioned stimulus (CS; e.g., a lever) that predicts the delivery of an unconditioned stimulus (US; e.g., a food pellet) and can be used to measure incentive salience. During training, three patterns of conditioned responses (CRs) can develop: sign-tracking behavior (CS-directed CR), goal-tracking behavior (US-directed CR), and an intermediate response (both CRs). Sign-trackers attribute incentive salience to reward-related cues and are more vulnerable to cue-induced reinstatement of drug-seeking as well as other addiction-related behaviors, making PCA a potentially valuable procedure for studying addiction vulnerability. Here, we describe materials and methods used to elicit PCA behavior from rats as well as analyze and interpret PCA behavior in individual experiments.

Here, we present a protocol to elicit Pavlovian conditioned approach behavior in rats. This procedure can be used to measure individual differences in the tendency to approach and attribute incentive salience to reward-related cues and investigate addiction vulnerability.

Pavloviano Training Approach condizionati in Rats

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Stress-Enhanced Fear Learning, a Robust Rodent Model of Post-Traumatic Stress Disorder

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders such as post-traumatic stress disorder (PTSD). To understand the biological mechanisms of fear dysregulation in PTSD, it is important to start with a valid animal model of the disorder. This protocol describes the methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of PTSD, in both rats and mice. SEFL was developed to recapitulate critical aspects of PTSD, including long-term sensitization of fear learning caused by an acute stressor. SEFL uses aspects of Pavlovian fear conditioning but produces a distinct and robust sensitized fear response far greater than normal conditional fear responses. The trauma procedure involves placing a rodent in a conditioning chamber and administering 15 unsignaled shocks randomly distributed over 90 minutes (for rat experiments; for mouse experiments, 10 unsignaled shocks randomly distributed over 60 minutes are used). On day 2, rodents are placed in a novel conditioning context where they receive a single shock; then, on day 3 they are placed back in the same context as on day 2 and tested for changes in freezing levels. Rodents that previously received the trauma display enhanced levels of freezing on the test day compared to those that received no shocks on the first day. Thus, with this model, a single highly stressful experience (the trauma) produces extreme fear of the stimuli associated with the traumatic event.

Here we describe the detailed methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of post-traumatic stress disorder, in both rats and mice. The model utilizes aspects of Pavlovian fear conditioning and freezing as an index of enhanced fear in rodents.

Paura lo stress-Enhanced Learning, un robusto modello del roditore del disturbo da Stress post-traumatico

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed incubation of drug craving. Here, we describe a morphine conditioned place preference (CPP) protocol for measuring the incubation of craving in rats. In this protocol, a CPP paradigm mainly employing somatosensory cues is used to establish a long-term reward memory of morphine. A three-chamber CPP box that differs in the texture of the chamber floor is constructed. First, the animals are tested for their baseline preference to the two side chambers for three consecutive days. Then, they are injected intraperitoneally with morphine/saline and put into their non-preferred/preferred chamber for 45 min. After 6 days of conditioning, their preference to the side chambers is tested for 15 min at different time points after the last conditioning session. With this paradigm, the reward memory of morphine could last for at least 18 days. To test whether the above-mentioned protocol can model increased craving, the number of entrances into the two side chambers are counted during the abstinence period. The results show that the entrances increased, suggesting that the CPP paradigm could mimic the incubation of craving. Future studies can employ this model to study neural mechanisms underlying long-term memory and incubation of craving.

Here, a morphine conditioned place preference (CPP) protocol is described to measure incubation of craving in rats.

Un protocollo di Conditioned Place Preference per l'incubazione di Craving nei ratti di misura

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...