This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Preparazione del Peptide Array <ol><li> Programmazione del Peptide Sequenze <ol><li> Progettare sequenze peptidiche per la sintesi utilizzando il software MultiPep Spotter. Inserire le sequenze peptidiche in codici alfabetici singoli. Peptide 1: TARKSTGGKA </li><li> Generare librerie alanina o arginina camminare con un comando specifico (.Sostituire, A) per lo screening importanti aminoacidi necessari per il riconoscimento di un substrato definito. Ad esempio, nel seguente esempio la prima riga è la sequenza di tipo selvatico e dalla seconda linea di ciascun amminoacido in un peptide viene modificato a sequenzialmente alanina. sostituire, A TARKSTG A -ARKSTG T- A -RKSTG TA A -KSTG TARGET A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> Utilizzare comandi simili (.Sostituire R,.sostituire N etc.) come descritto in 1.1.2 con tutti i residui amminoacidici naturalmente disponibili (eventualmente omettendo cisteina, metionina e triptofano, perché questi residui sono soggetti ad ossidazione e la resa di sintesi volte inferiore) per sintetizzare una matrice peptide per determinare il consenso substrato motivo di sequenza per un enzima. NOTA: Come mostrato in Figura 4A, l&#39;asse orizzontale rappresenta la data sequenza peptidica e l&#39;asse verticale rappresenta gli aminoacidi che sono selezionati per il comando. Simile alla sequenza mostrata nella 1.1.2, A sull&#39;asse verticale significa che un sequenzialmente Ala sostituisce ogni posizione della sequenza indicata nella prima riga in Fig. 4A. Allo stesso modo sequenziale arginina sostituisce ciascun amminoacido nella seconda riga e così via con altri amminoacidi. Librerie complete matrice peptide sono sintetizzati sostituendo sistematicamente ciascun residuo nella sequenza substrato peptidico fornito con ciascuno di the altri residui amminoacidici naturalmente disponibili, ciò aiuta a comprendere l&#39;influenza di ciascun residuo in ciascuna posizione della sequenza proposta. </li><li> In alternativa, la metilazione di substrati peptidici noti o previsti può essere facilmente verificato sintetizzare librerie peptidiche con i peptidi target del PKMT insieme con controlli metilazione positivi e negativi (ossia peptidi notoriamente metilato o noti non essere metilato). Sintetizzare peptidi scambiando il presunto obiettivo di lisina di alanina per confermare metilazione della lisina destinazione come illustrato di seguito per la programmazione manuale. Tipo selvaggio peptide: STGG K PRQFL Peptide Mutant: STGG A PRQFL NOTA: Il software ha anche script inerenti a creare varie biblioteche, come la mappatura epitopo con uno spostamento fotogramma desiderato della sequenza per mappare importanti aminoacidi necessari per un&#39;interazione. </li></ol></li><li> Preparazione della membrana, Aminoacidi und Reagenti <ol><li> Pre-gonfiano la membrana SPOT in DMF (N, N -Dimethylformamide) per 10 minuti e poi posizionare la membrana bagnata sul telaio SPOT sintetizzatore, senza bolle d&#39;aria o grinze. </li><li> Lavare la membrana tre volte con 100% di etanolo. Essiccare le membrane completamente per almeno 10 minuti prima di iniziare il programma di sintesi. </li><li> In parallelo, appena preparare 0,5 M concentrazioni lavorativi amminoacidi Fmoc-protetti commercialmente disponibili sciogliendoli in NMP e preparare l&#39;attivatore e la base come descritto nella Tabella 1. </li><li> Assicurarsi che tutti i contenitori della soluzione dei rifiuti del sintetizzatore SPOT sono stati svuotati e riempire i serbatoi di solvente con DMF, etanolo e piperidina. NOTA: questo punto la macchina è pronta per la sintesi. </li></ol></li><li> Spotting del primo amminoacido <ol><li> Per generare il legame ammidico con il gruppo ammino libero sulla membrana, attivare il gruppo carbossilico dell&#39;amminoacido entrata dall&#39;inserzionistading l&#39;attivatore (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) e soluzione di base (Ethyl cianoacetato idrossiimmino) al derivato aminoacidico. </li><li> Spot i volumi desiderati di aminoacidi attivati ​​sulla membrana funzionalizzato Amino-PEG utilizzando il robot programmabile. NOTA: In tal modo, il C-terminale della aminoacido è accoppiato al gruppo amminico della membrana. </li><li> Ripetere questa operazione tre volte per consentire un miglior accoppiamento del primo amminoacido attivato. Incubare la membrana per 20 minuti e poi lavare con DMF per rimuovere aminoacidi disaccoppiati. </li></ol></li><li> Blocco di spazi liberi in zone non-punto NOTA: Dopo l&#39;accoppiamento del primo amminoacido C-terminale di tutti i peptidi al gruppo amminico della membrana, i gruppi amminici tra le macchie e anche alcuni dei gruppi amminici nelle zone piatte non formano legami con gli aminoacidi. <ol><li> Bloccare questi gruppi amminici liberi incubando con la soluzione tappatura (20% anidride acetica in DMF)per 5 min. NOTA: Questo evita l&#39;accoppiamento di aminoacidi nelle ulteriori cicli con la membrana anziché crescente catena peptidica. </li></ol></li><li> Rimozione di Fmoc Group <ol><li> Dopo il blocco, lavare la membrana con DMF 4 volte e poi incubare con 20% piperidina in DMF per 20 minuti per rimuovere il gruppo di protezione Fmoc. NOTA: Questo passaggio porta alla rimozione dei gruppi Fmoc-protezione amino e si chiama deprotezione. </li><li> Successivamente, lavare la membrana due volte con DMF e due volte con etanolo e lasciare asciugare. NOTA: Ora la membrana è pronto per l&#39;accoppiamento dei prossimi amminoacidi. </li></ol></li><li> Allungamento catena NOTA: Aggiunta di ciascun amminoacido è chiamato ciclo. A parte l&#39;accoppiamento di primo amminoacido, il ciclo inizia con la deprotezione del gruppo Fmoc dell&#39;amminoacido accoppiato ed è seguito dall&#39;accoppiamento del gruppo carbossilico attivato di un aminoacido in entrata al gruppo amminico della crescente pepchain marea. <ol><li> Ripetere le fasi 1.3 e 1.5 fino ad ottenere la lunghezza desiderata peptide. </li></ol></li><li> Colorazione NOTA: Dopo il ciclo finale, gli array di peptidi sono macchiate di blu di bromofenolo per confermare la riuscita sintesi di peptidi. Blu di bromofenolo lega con i gruppi amminici liberi dei peptidi. Macchie Peptide mostrano colore azzurro dopo la colorazione ma l&#39;intensità delle macchie varia a seconda della sequenza peptidica. Questo permette colorazione conferma la completa rimozione di piperidina, perché in presenza di piperidina blu di bromofenolo non macchia i peptidi. Inoltre, questo aiuta anche per segnare le matrici peptide per un ulteriore utilizzo. <ol><li> Dopo la deprotezione del gruppo Fmoc nell&#39;ultimo ciclo di sintesi, lavare la membrana con DMF e 100% etanolo. Quindi, trattare la membrana con blu di bromofenolo (0,02% blu di bromofenolo in DMF) per un minimo di 5 min finché non diventa completamente blu. </li><li> Successivamente, lavare la membrana con DMF e ethAnol seguito da essiccazione per 10 min. Ora togliere la membrana dal sintetizzatore ed eseguire deprotezione catena laterale (sezione 1.8) manualmente. Se necessario, fotografare la membrana per documentare i risultati della sintesi peptidica (Fig. 2). </li></ol></li><li> Deprotezione Side Chain <ol><li> Trattare le membrane con 20 a 25 ml di miscela di deprotezione delle catene laterali composto da 95% di acido trifluoroacetico (TFA) per scindere i gruppi di protezione della catena laterale e reagenti scavenger (2,5% di acqua e 2,5% triisopropylsilane) per proteggere le catene laterali degli amminoacidi modifica durante questa fase. Prendete un volume sufficiente di miscela deprotezione per garantire che essa ricopre la membrana completamente nel contenitore resistente chimico ben chiuso e incubare per 1 a 2 ore agitando delicatamente. </li><li> Lavare la membrana sei volte con 20-25 ml di DCM (diclorometano) per 2 min ciascuno e infine due volte con 100% di etanolo e asciugare in un essiccatore notte. NOTA: Orala membrana può essere utilizzato per esperimenti. Uno schema di sintesi matrice peptide è fornito in Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. proteine ​​espressione e purificazione <ol><li> Proteina espressione di PKMTs come GST Fusions <ol><li> Usando tecniche standard, clonare il gene che codifica per l&#39;intera lunghezza o PKMT suo dominio catalitico in un vettore di espressione batterica (come pGEX-6p2) per esprimerlo come proteina GST-fusion. </li><li> Trasferire il vettore con il PKMT desiderata inserire nel BL21 o BL21 codone più E. coli secondo il metodo shock termico o qualsiasi altro metodo. </li><li> Preparare una pre-coltura con 30 ml di Luria-Bertani supporti (LB) del giorno di espressione e incubare a 37 ° C per 7 a 8 ore con agitazione continua. </li><li> Poi, il trasferimento di 10 ml di pre-cultura in un 2 L grandi palloni sconcertati contenenti 1 l di mezzi LB e incubare a 37 ° C in incubatore con agitazione continua fino alla portata colturaes una densità ottica a 600 nm definito. NOTA: Anche se questo può essere ottimizzato per ogni proteina, abbiamo regolarmente inducono ad una 600nm OD di circa 0,8. La temperatura di induzione deve essere ottimizzato per ogni proteina individualmente, alcune proteine ​​mostrano buona espressione a 22 ° C e alcuni a temperature più elevate. </li><li> Spostare le cellule alla temperatura di induzione per 15 min, poi indurre con 1 mM di isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside e permettere la cultura di crescere per 10-12 ore a temperatura induzione. </li><li> Successivamente raccogliere le cellule per centrifugazione a 5.000 xg per 15 min e infine lavare il pellet con 30 ml di tampone STE (10 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM e 0,1 mM EDTA) e conservare a -20 ° C per un ulteriore utilizzo. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Scongelare il pellet e risospendere in 30 ml di tampone di sonicazione (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT e 5% glicerolo) e disturbare per sonicazione. NOTA: Questo buffer needs per essere ottimizzate per ogni proteina alla fine. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare a 22.000 xg per 1 ora e, poi raccogliere il surnatante e passare attraverso una colonna contenente 600 ml di glutatione resina Sepharose 4B. </li><li> Lavare la colonna con 50 ml di tampone di sonicazione e successiva con 100 ml di tampone di sali (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, 1 mM DTT e 5% glicerolo) per rimuovere le proteine ​​legate aspecifico. Eluire la proteina legata con 5 ml di tampone di sale contenente glutatione mm 40. </li><li> Dializzare la proteina eluita in 2 L di tampone di dialisi con bassa glicerolo (20 mM Tris pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e il 10% glicerolo) per 2 ore e poi in 20 mM Tris pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e il 70% glicerolo per 8 ore o durante la notte. Assicurarsi che tutti i buffer di purificazione sono a 4 ° C ed eseguire la purificazione della proteina nella cella per evitare denaturazione proteica. </li></ol></li></ol> 3. Peptide Array metilazione <ol><li> Pre-incubation di Peptide Array <ol><li> Eseguire peptide matrice metilazione o in una scatola di dimensioni appropriate o in un sacchetto di plastica per evitare lo spreco di enzima e costoso marcato radioattivamente AdoMet. Pre-incubare la membrana peptide array in sacchetto di plastica sigillato contenente il rispettivo buffer di metilazione senza enzima ed etichettato [metil-3H] -AdoMet per 10 min. Il volume di tampone dipende dalla dimensione della matrice, per esempio, utilizzare 8 ml di tampone di metilazione per una matrice profilo completo peptide specificità. Ottimizzare la quantità e la concentrazione del AdoMet per ciascun enzima. </li></ol></li><li> La metilazione del Peptide Array <ol><li> Eliminare il buffer di pre-incubazione e incubare la membrana in 8 ml di tampone metilazione contenente il rispettivo PKMT ed etichettato [metil-3H] -AdoMet per 1 a 2 ore. NOTA: La quantità di enzima necessario per una reazione di metilazione dipende dall&#39;attività di PKMT specifica, iniziamo nostri esperimenti di screening tipicamente con 50 nM fin enzimaticiconcentrazione al. </li></ol></li><li> Lavaggio delle Peptide Array <ol><li> Successivamente eliminare il buffer metilazione in un contenitore per rifiuti radioattivi e lavare gli array peptidici per 5 volte con 20 ml di tampone contenente 100 mM di bicarbonato di ammonio e 1% SDS per 5 minuti per rimuovere la proteina legata. Eliminare la soluzione di lavaggio in un contenitore per rifiuti radioattivi. </li></ol></li><li> Rilevamento del segnale radioattivo <ol><li> Dopo i lavaggi incubare la membrana per 5 minuti in 10 ml di soluzione di Amplify (NAMP100V). </li><li> Poi, scartare la soluzione Amplify nel contenitore dei rifiuti radioattivi per solventi organici, sigillare la matrice peptide in un sacchetto di plastica e metterlo in una cassetta autoradiografia. </li><li> Posizionare il film autoradiografia sull&#39;array peptide in camera oscura. Chiudere con cura la cassetta ed esporlo a -80 ° C per il tempo necessario. Poi, sviluppare la pellicola per analizzare i risultati. Catturare la coppia immagine di volte con diversi exposition volte per evitare la saturazione di substrati peptidici fortemente metilati. </li></ol></li></ol> 4. Elaborazione dati e analisi <ol><li> Analisi densitometrica di Spot intensità <ol><li> Scansione il film in uno scanner tradizionale e analizzare le intensità saltuari da densitometria. Fate questo utilizzando ImageJ (che è freeware) o un programma commerciale. NOTA BENE: Usiamo software Phoretix per questo compito. </li></ol></li><li> Normalizzazione e della media dei risultati dei vari Membrane <ol><li> Condurre esperimenti metilazione matrice peptide almeno in triplicato. Normalizzare le intensità scanditi per ogni esperimento da uno sfondo sottrazione e impostare l&#39;attività in un substrato di riferimento 1.0. Calcolare la media dei dati per i singoli punti e segnalarli come valori medi e le deviazioni standard. </li></ol></li><li> Analisi dei dati e display <ol><li> Tracciare i dati in 2D utilizzando uno schema in scala di grigi oa colori per indicare la relativa attività. Fate questo with Excel o SigmaPlot come mostrato qui. Inoltre, preparare un grafico della distribuzione delle deviazioni standard degli esperimenti ripetuti per analizzare la qualità dei dati. </li><li> Per confrontare e visualizzare l&#39;accuratezza del riconoscimento di ciascun residuo nel peptide substrato quantitativamente, calcolare la relativa preferenza del PKMT per ciascun amminoacido i alla posizione x di un fattore discriminazione D 16,17: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Dove v i è il tasso di metilazione della variante peptide portando aminoacido i alla posizione x e &lt;v j ≠ i&gt; è il tasso medio di metilazione di tutti i 19 peptidi che trasportano un altro amminoacido j ≠ i alla posizione x (compreso il selvaggio tipo sequenza). NOTA: Il fattore di discriminazione definito da questa dipende dal livello di sfondo. Se un solo residuo è accettata in una certa posizione con uno sfondo del 3%, una discriminazionesi ottiene fattore 32.3. Nessuna preferenza in una posizione traduce in un fattore di discriminazione di 0. </li></ol></li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Sintesi SPOT come qui descritto è un potente metodo per mappare i siti di interazione proteina-proteina e indagare il riconoscimento del substrato di peptide modificare enzimi. Tuttavia, la sintesi SPOT ha ancora alcuni inconvenienti, in quanto anche se i peptidi sintetizzati dal metodo SPOT sono segnalati per avere più del 90% di purezza 21 è difficile confermare in ciascun caso. Pertanto, i risultati devono essere riprodotte con altri metodi, per esempio utilizzando domini di proteine ​​o con peptidi...

Negli ultimi due decenni, diverse segnalazioni hanno dimostrato l&#39;importanza delle modificazioni post-traduzionali (PTM) a sviluppo cellulare e diverse malattie come il cancro, ma di recente la proteina lisina metilazione è emerso come un altro importante PTM. Mentre inizialmente metilazione dell&#39;istone lisina è risultato essere un segno essenziale della cromatina, il lavoro in seguito ha anche mostrato lisina metilazione di diverse proteine ​​non istoniche 1-4. Il trasferimento sequenziale dei gruppi metilici da S-adenosil-L-metionina al gruppo ε-amino di residui di lisina è catalizzata da una famiglia di enzimi chiamati proteina lisina metiltransferasi (PKMTs) che contiene oltre 60 proteine ​​nel genoma umano. PKMTs sono stati inizialmente scoperti come istoni modificando enzimi che metilato specifico residuo di lisina, ma i rapporti successivi hanno dimostrato che potrebbero anche metilare proteine ​​non istoniche 5. Fino ad ora, circa 5.000 siti di metilazione lisina sono stati identificati diversi proteine ​​6 </sup&gt;, ma gli enzimi responsabili di queste modifiche non vengono spesso identificati. Una ragione di ciò è che la specificità della maggior PKMTs non è stato studiato estesamente. Pertanto, si verifica che ricorrentemente nuovi substrati di PKMTs vengono scoperti. La mancanza di una conoscenza dettagliata della specificità di substrato della PKMTs ostacola comprensione della loro funzione biologica e ruolo. Per studiare la specificità di un PKMT in dettaglio, i tassi di metilazione di molti substrati peptidici che differiscono in uno o pochi amminoacidi devono essere misurate e confrontate, che è idealmente fatto usando array peptidici. Sulla base dei profili di specificità, potenziali substrati di PKMTs possono essere identificati che può essere studiato ulteriormente. Array Peptide sono ampiamente utilizzati gli strumenti per l&#39;analisi biochimica di anticorpi, peptidi enzimi che modificano e mappatura dei siti di interazione proteina-proteina (antigene-anticorpo, recettore-ligando) 7-9. Sono necessarie diverse centinaia di peptidi per such applicazioni. Sono disponibili diversi metodi per la sintesi di peptidi, tra i quali peptide di sintesi sulla resina è molto comunemente usato, ma ha limiti in velocità ed è relativamente costoso. Questi problemi sono stati risolti con l&#39;introduzione del metodo di sintesi SPOT di Frank e colleghi 10. Il metodo di sintesi SPOT consente sintesi di diverse centinaia di peptidi in parallelo e in media è poco costoso rispetto alla sintesi resina. I peptidi sintetizzati su membrana di cellulosa possono essere usate direttamente per varie applicazioni o peptidi possono essere spaccati dalla membrana e utilizzato come peptidi liberi per saggi in soluzione o preparare microarray peptide 10-13. Sintesi SPOT è una variante della sintesi in fase solida del peptide, che utilizza una membrana di cellulosa come un supporto solido e impiega il Fmoc-chimica standard di 10-13. Pertanto, la sintesi di catene peptidiche inizia al termine C-terminale e procede versol&#39;estremità N-terminale in contrasto con la sintesi biologica in ribosomi. Membrane di cellulosa sono funzionalizzati per il fissaggio del primo acidi ammino attivato (Fig. 1). Il metodo si basa sulla SPOT consegna sequenziale di aminoacidi attivati ​​in una goccia di solvente a macchie definite sulla membrana utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato. La gocciolina di liquido viene erogato sulla membrana porosa dove forma un punto bagnato circolare, che poi agisce come un reattore aperto per le reazioni chimiche di sintesi peptidica. La dimensione del punto è determinata dal volume erogato e la capacità di assorbimento della membrana, multipli di tali punti sono disposti come array. La scala della sintesi correla con la dimensione del punto e la capacità di carico della membrana. La distanza tra i punti e la densità degli array sono gestiti variando le dimensioni del punto. Membrana Cellulosa ha diversi vantaggi come fase solida in sintesi peptidica, è poco costoso, tollerante chemicals utilizzati nella sintesi di peptidi, stabili in soluzioni acquose e facili da maneggiare. Inoltre, la sua natura idrofila rende adatto per diversi sistemi di dosaggio biologici. SPOT sintesi può essere effettuata manualmente o automatizzato (per 1000s di peptidi) a seconda del numero di peptidi. Un sintetizzatore SPOT completamente automatizzata da Intavis (Köln, Germania) è usato per le nostre applicazioni. Permette sintesi di peptidi in quantità diverse e di diversa lunghezza. Peptidi lineari sono regolarmente sintetizzati con lunghezza acido 15 a 20 amminoacidi, peptidi in aggiunta fino a 42 aminoacidi possono anche essere preparati mediante graduale sintesi 14,15. Tuttavia, aumentando il numero di aminoacidi porta a riduzioni dei rendimenti complessivi di accoppiamento, che colpisce la qualità dei peptidi. A causa della bassa quantità di peptidi per punto, i prodotti sono spesso difficili da purificare e la qualità dei singoli peptidi non possono essere facilmente valutati. Pertanto, i risultati ottenuti da SPOT PEPTarray ide devono essere confermati sia con peptidi sintetizzati con metodi standard in scala più grande, che può essere purificato e analizzati secondo le norme in sintesi peptidica o di sintetizzare le proteine ​​contenenti le sequenze peptidiche desiderati. Tuttavia, abbiamo trovato la sintesi SPOT per essere altamente affidabili e risultati generalmente essere riproducibile. Sintesi SPOT non è limitato a proteinogenici aminoacidi, acidi disponibili in commercio diversi amminoacidi modificati anche possono essere utilizzati per la sintesi, permettendo peptidi da modificare prima e dopo il clivaggio finale del gruppo di protezione della catena laterale e, inoltre, permette anche di incorporazione fosforilata, denaturato o acetilate amminoacidi 11. Librerie peptidiche immobilizzate sintetizzati con il metodo SPOT può essere utilizzato direttamente per molti saggi biologici e biochimici. Abbiamo impiegato array di peptidi comprendenti 300-400 peptidi di indagare la specificità di substrato di PKMTs. Per modifi enzimaticacazione, gli array peptidici vengono incubati con il rispettivo PKMT ed etichettato [metil- 3 H] -AdoMet in un tampone appropriato. La metilazione del rispettivo substrato viene analizzato seguendo il trasferimento enzimatica dei gruppi metilici marcati radioattivamente dal AdoMet al substrato peptidico tramite autoradiografia (Fig. 3). Con questo procedimento, gli array peptidici permettono lo studio della metilazione di differenti substrati peptidici contemporaneamente. Un importante vantaggio di questo metodo è che tutti i peptidi sono metilate in concorrenza, tale che, durante la fase lineare della cinetica metilazione, la relativa metilazione di ciascun peptide è proporzionale alla costante di velocità catalitica divisa per la costante di dissociazione (k cat / K D) dell&#39;enzima per il rispettivo substrato peptidico. Pertanto, la quantità di radioattività incorporata in ciascun punto è direttamente correlata con l&#39;attività enzimatica verso il particolare peptide. Utilizzando ilrisultati di un esperimento metilazione matrice peptide, il profilo specificità del PKMT possono essere definite e basate su possono essere legati all&#39;ottenimento questo romanzo substrati. Array peptidici consentono la rapida ed economica validazione efficiente della metilazione di nuovi substrati a livello peptide. Per questo, gli array sono preparati che contengono i predetti nuovi substrati con peptidi modificati contenenti un Ala anziché Lys ai siti bersaglio nonché peptidi di controllo positivi e negativi. Infine, i nuovi supporti possono essere preparati come proteine ​​insieme mutanti, in cui l&#39;obiettivo Lys è alterata per Ala e la metilazione può essere confermato a livello proteico. A seconda dei risultati, questo è seguito da studi biologici indirizzamento potenziali ruoli della metilazione dei substrati proteici appena descritte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lisina metilazione è una modificazione post-traduzione emergente ed è stato identificato sulle proteine ​​diverse istone e non-istoni, dove svolge un ruolo cruciale nello sviluppo delle cellule e di molte malattie. Circa 5.000 siti di metilazione della lisina sono stati identificati su diverse proteine, che sono impostati da poche decine di metiltransferasi proteine ​​lisina. Ciò suggerisce che ogni PKMT metila più proteine, ma fino ad ora solo uno o due substrati sono stati identificati per diversi di questi enzimi. Matrice peptide Per affrontare questo problema, abbiamo introdotto basato specificità di substrato analisi di PKMTs. Array Peptide sono strumenti potenti per caratterizzare la specificità della PKMTs causa metilazione di diversi substrati con diverse sequenze possono essere testati su un array. Abbiamo sintetizzato array di peptidi su membrane di cellulosa con un sintetizzatore Intavis SPOT e analizzato la specificità dei vari PKMTs. Sulla base dei risultati, per molti di questi enzimi, novel substrates potrebbero essere identificati. Ad esempio, per NSD1 impiegando matrici peptidi, abbiamo dimostrato che metila K44 di H4 invece del H4K20 riportato e in aggiunta H1.5K168 è il substrato altamente preferito sul H3K36 precedentemente noto. Quindi, gli array di peptidi sono strumenti potenti per caratterizzare biochimicamente le PKMTs.

Array peptidici sono stati utilizzati con successo per caratterizzare biochimicamente la specificità di PKMTs, e sono stati identificati diversi romanzo istone e non istoni substrati di PKMT da questo approccio 5,16-19. Definire lo spettro substrato corretta di un PKMT (o qualsiasi enzima) è un passo essenziale verso la comprensione del meccanismo molecolare e funzioni cellulari. Come esempio di applicazione del metodo di matrice metilazione peptide SPOT, descriviamo i risultati...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l&#39;analisi quantitativa dei peptidi epitopi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

Analisi Specificità di proteine lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array