This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOTA: Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state effettuate in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health 26. Il protocollo (MO13M391) è stato approvato dall&#39;Università Animal Care and Use Committee Johns Hopkins. Sacrificio 1. neonatale mouse, Dissection, e fissazione <ol><li> Sacrifica un mouse neonatale da CO 2 inalazione. </li><li> Immediatamente tagliare il arti posteriori sopra il ginocchio. Fino al giorno di circa 7 postnatale, le ossa delle gambe sono abbastanza morbido per tagliare con forbici grandi laboratorio o lama affilata e alla successiva sezione un criostato. </li><li> Posizionare il hindlimb in 10 ml di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide in tampone fosfato salino (PBS) in una provetta da 15 ml. </li><li> Immersion fissare il arti posteriori in paraformaldeide per 4-24 ore a 4 ° C. Tessuti embrionali richiede solo alcune ores di fissazione. <ol><li> Evitare di fissaggio più di 24 ore, in quanto ciò potrebbe ridurre l&#39;efficienza TUNEL assay. </li></ol></li><li> Cryoprotect il arti posteriori immergendolo in una soluzione di saccarosio. <ol><li> Cambiare paraformaldeide al 10% di saccarosio in PBS nello stesso tubo 15 ml, incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Variazione al 30% di saccarosio in PBS, incubare una notte a 4 ° C o fino ai lavandini hindlimb al fondo della provetta. Tissue può essere lasciato nel 30% di saccarosio per un periodo più lungo, a condizione che il saccarosio è stata filtrata sterile. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Embedding <ol><li> Riempire uno stampo embedding metà marcato con mezzo di inclusione. </li><li> Inserire hindlimb sopra il mezzo di inclusione, con la parte tagliata il più vicino possibile ad una parete dello stampo. Contrassegnare l&#39;orientamento della arti posteriori sulla parte esterna dello stampo. <ol><li> Incorpora diverse arti posteriori e tagliare nello stesso blocco. Tuttavia, è importante assicurare che tutte hindlimbs nel blocco sono orientate parallelamente tra loro per ottenere sezioni in corrispondenza livelli lungo l&#39;asse dell&#39;arto. </li></ol></li><li> Coprire arti posteriori con mezzo di inclusione. Se zampe posteriori spostano durante il versamento del mezzo, ri-orientare con una pinza a punta smussata o uno stuzzicadenti. </li><li> Lasciare mezzo di inclusione per infiltrarsi tessuto a temperatura ambiente per almeno 15 min. </li><li> Mettere gli stampi direttamente in ghiaccio secco o in isopentano in ghiaccio secco per congelare mezzo di inclusione. Assicurarsi di mantenere il livello di stampi in ogni momento e di evitare lo spostamento del tessuto incorporato. </li><li> Mantenere stampi congelati a -80 ° C fino al momento di taglio, fino a diversi mesi. </li></ol> 3. criosezionamento incorporato Limbs <ol><li> Impostare temperatura della camera criostato a -20 ° C, la temperatura dell&#39;oggetto a -18 ° C; regolare la temperatura dell&#39;oggetto verso il basso, se necessario. </li><li> Portate il blocco di tessuto all&#39;interno della camera criostato per almeno 30 min. Blocco corretta temperaturaerature è fondamentale per la qualità sezione. </li><li> Tagliare sezioni trasversali ad uno spessore di 10 micron o meno. Sezioni spesse non saranno pienamente penetrati da reagenti TUNEL. Utilizzare la piastra anti-rollio, pale, e l&#39;angolo della lama (tipicamente 5 °), raccomandato per il criostato. </li><li> Raccogliere sezioni su gelatin- o vetrini vectabond rivestite a temperatura ambiente. Mettere subito in una scatola di diapositive in ghiaccio secco. Conservare la scatola diapositiva in un contenitore separato con ghiaccio secco posto in prossimità del criostato a portata di mano. <ol><li> Tagliare sezioni trasversali seriali attraverso l&#39;asse dell&#39;arto, saltare 100-200 micron. Raccogliere almeno 3 sezioni adiacenti a ciascun livello di serie. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL test sulle sezioni degli arti posteriori utilizzando un kit in commercio Disponibile (tutte le misure a temperatura ambiente se non indicato) <ol><li> Scongelare vetrini con sezioni a temperatura ambiente e asciugare durante la notte o durante il fine settimana. </li><li> Reidratare sezioni di immersing vetrini in PBS per 2 x 10 min in una vaschetta Coplin. Asciugare con un laboratorio di pulire, rimuovere quanto più liquido intorno alla sezione possibile. </li><li> Sezioni permeabilize <ol><li> Utilizzare un non-proteolitici, reattivo a base di saponina commerciale oppure 0,5% e il 0,05% Tween20 Triton X100 in PBS. </li><li> Posizionare il vetrino in una camera umida. Una semplice camera umida è una scatola vuota puntale con un coperchio a tenuta, con acqua sufficiente a coprire appena aggiunto il fondo della scatola. </li><li> Pipetta abbastanza reattivo sul vetrino per coprire la sezione (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Non pipettare direttamente sulla sezione, come agitazione ripetuta può provocare la sezione per sollevare la diapositiva. </li><li> Utilizzando pinze a punta smussata, posizionare un piccolo rettangolo di parafilm sulla parte superiore della sezione di diffondere la goccia di reagente e coprire completamente la sezione. Se le bolle si formano sotto la parafilm, delicatamente sollevarlo, asciutto, e riapplicare. </li><li> Incubare i vetrini con permeabilireattivo zione per 1 ora in una camera umida coperta. Se sezioni iniziano a sollevarsi dalla diapositiva, tempo di permeabilizzazione può essere ridotto a 30 min. </li><li> Lavare i vetrini in PBS in una vaschetta Coplin 2 x 5 min. I rettangoli parafilm dovrebbero fluttuare verso l&#39;alto e può quindi essere rimosso e scartato. </li><li> Utilizzando un laboratorio strofinata, asciugare quanto più liquido intorno sezioni possibili. </li></ol></li><li> DNA etichettatura pausa TdT-mediata <ol><li> Seguire le istruzioni del kit per fare 1x buffer di etichettatura TdT, pipetta abbastanza buffer di etichettatura sul vetrino per coprire la sezione di tessuto (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Incubare nella camera umida per 5 min. In alternativa, immergere il vetrino in buffer di etichettatura TdT in una vaschetta Coplin. </li><li> Seguire le istruzioni del kit per fare TdT mix di etichettatura. Il kit comprende cobalto, magnesio, manganese e cationi; il catione manganese funziona bene su una varietà di tessuti, compresi i muscoli scheletrici, tiss sistema nervosoUES, il fegato, la pelle e ossa. </li><li> Per un controllo positivo, aggiungere DNase (etichetta &quot;nuclease&quot; nel kit) per il mix di etichettatura TdT. In alternativa, pre-trattamento di una sezione di controllo positivo con DNasi in tampone nucleasi per 1 ora a 37 ° C, secondo le istruzioni del kit. Tenere soluzione DNasi e sezioni DNasi trattati da altre sezioni sperimentali per evitare la contaminazione incrociata. </li><li> Per un controllo negativo, omettere TdT enzima dalla miscela etichettatura. </li><li> Utilizzare un laboratorio wipe per rimuovere la maggior quantità di buffer etichettatura TdT dalla diapositiva possibile. Pipettare TdT mix etichettatura sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Seguire le istruzioni del kit per fare tampone arresto 1x. Utilizzare un laboratorio pulire per rimuovere TdT mix etichettatura dalla diapositiva, e aggiungere 200-300 tampone di arresto microlitri per coprire la sezione di tessuto e incubare in camera umida per 5 min. Al<html> ternativa, immergere il vetrino in buffer di arresto in una vaschetta Coplin. </li><li> Lavare il vetrino 2 x 2 min in PBS. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere quanto più PBS dal vetrino possibile. </li></ol></li><li> Etichettatura fluorescente <ol><li> Seguire le istruzioni del kit per la preparazione soluzione di etichettatura fluoresceina etichettare dNTP a rotture del DNA. Soluzione Pipettare sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida per 20 min. </li><li> Lavare il vetrino per 2 minuti in PBS in una vaschetta Coplin. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere il più possibile dal PBS diapositiva. </li><li> Diluire Hoechst 33258 colorazione nucleare a 1 mg / ml in PBS e pipetta sul vetrino (100-200 ml è sufficiente a coprire la sezione). Incubare nella camera umida per 5 min. </li><li> Lavare 3x per 5 min in PBS. </li><li> Coverslip con Antifade mezzi di montaggio fluorescenza e sigillare i bordi con smalto. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Acquisizione Immagine Digitale <ol><li> Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale con DAPI, FITC, e filtri Texas rossi (o equivalenti). Utilizzare un obiettivo più alto ingrandimento (20X o 40X) per verificare che l&#39;etichettatura era successo e nuclei (intatti o frammentati) sono stati etichettati. Un obiettivo 10X è sufficiente per la quantificazione di puncta TUNEL-positive. </li><li> Raccogliere immagini della colorazione Hoechst, TUNEL colorazione, e il segnale autofluorescenti come tre canali a falsi colori separati uniti in una sola immagine. Se l&#39;etichetta fluoroforo TUNEL è verde, segnale di immagine autofluorescenti nel filtro rosso, e viceversa. <ol><li> Mantenere tutte le impostazioni di imaging equivalente tra le diapositive per la successiva soglia e quantificazione. Per ogni filtro, i tempi prestabiliti e di esposizione di registrazione, il guadagno, e binning (senza binning è meglio); non utilizzare le impostazioni di esposizione o di guadagno automatico. </li><li> Usa-prove ed errori per trovare esposizione e guadagno impostazioni che meglio catturare la gamma di intenpiazzole in tutti i vetrini colorati. Assicurarsi che non vi siano pixel saturi nelle immagini acquisite, in modo da pregiudizi quantificazione. </li></ol></li><li> Prendere le immagini di tutto il gruppo muscolare di interesse. Questo può richiedere più immagini da &quot;cuciti&quot; insieme. </li></ol> Analisi 6. Immagine <ol><li> Utilizzare i programmi di analisi delle immagini disponibili in commercio per analizzare le immagini digitali di TUNEL colorazione. Analisi con software commerciale qui è mostrato. In alternativa, il software ImageJ esente da NIH può essere utilizzato per analizzare TUNEL colorazione. </li><li> Macchia una sezione adiacente alla sezione TUNEL macchiato con ematossilina eosina (H &amp; E) e prendere un full-sezione di immagine digitale con un microscopio campo chiaro convenzionale. Usa questa immagine H &amp; E in combinazione con un atlante di anatomia 5,18,19 tracciare le strutture anatomiche da quantificare. </li><li> Con il canale TUNEL spento, tracciare manualmente il contorno dell&#39;area da quantificare, utilizzandoHoechst e canali di autofluorescenza di orientamento. Convertire l&#39;area tracciata in una maschera (un insieme di pixel selezionato coordinate da analizzare). </li><li> Attivare il canale TUNEL. Utilizzando la funzione di intensità thresholding nel programma di analisi delle immagini, impostare la soglia inferiore di escludere tutti i segnali autofluorescenza. </li><li> Applicare le stesse impostazioni di soglia a tutte le immagini del set di studio. Convertire le selezioni thresholded in maschere. </li><li> Per ogni immagine, combinare la maschera zona muscolare e la maschera TUNEL. La nuova maschera combinazione rappresenterà segnale TUNEL all&#39;interno solo l&#39;area del muscolo tracciato. </li><li> Eseguire maschera quantificazione sulla maschera combinazione per determinare il numero di oggetti e l&#39;area del segnale TUNEL all&#39;interno dell&#39;area muscolare tracciata oggetto. Eseguire questo utilizzando la funzione Particle Analyzer in ImageJ. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un metodo per rilevare e analizzare quantitativamente DNA danni associata apoptosi nel topo muscoli scheletrici è descritto. La procedura prevede la raccolta dei tessuti, TUNEL colorazione, l&#39;acquisizione di immagini digitali, e l&#39;analisi delle immagini. Sono necessarie forniture istologiche comuni e strumenti, e uno speciale kit di TUNEL commerciale è necessario. Gli elementi essenziali necessari grandi apparecchiature sono un criostato, microscopio epifluorescente con capacità di immagine digitale, e un sis...

Etichettatura fine nick Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP (TUNEL) è il processo di utilizzo dell&#39;enzima TdT allegare dUTP al 3 &#39;estremità del doppio e singolo filamento di DNA rompe 12,23. Il metodo TUNEL per il rilevamento di apoptosi e danni al DNA è stato segnalato prima oltre 20 anni fa da Gavrieli et al. 1,12,24. Da allora è stato valutato e ottimizzate in diverse preparazioni di tessuto 7,23,27,40. TUNEL è stato utilizzato per studiare ischemia indotta morte cellulare dei neuroni 6,14,29 e cardiomiociti 43,44, eccitotossico morte neuronale 30,31, e come biomarker nel trattamento dell&#39;artrite 39. E &#39;stato anche utilizzato come fattore prognostico e marker delle cellule tumorali in diversi tumori umani 2,3,15,32,37,38,42. Esistono metodi alternativi per il danno al DNA e la rilevazione morte cellulare, ma hanno sfide tecniche e avvertimenti. Southern blotting può essere utilizzato per quantifdanno al DNA y in tutto lisati tissutali 7,9-11, ma questo metodo non fornisce la risoluzione-livello cellulare ed è difficile da quantificare. Il Comet assay è un metodo a base di cellule alternativa che richiede l&#39;estrazione di nuclei conservati dalle cellule 4,20,28,36. Sebbene il saggio comet funziona bene su cellule isolate coltivate, è molto più difficile preparare nuclei intatti dal tessuto muscolare scheletrico 8,21. Come con la macchia del sud, il test della cometa non fornisce informazioni cell-tipo-specifica da un intero tessuto omogenato muscolare. Un&#39;altra alternativa al metodo TUNEL è immunoistochimica utilizzando anticorpi contro il DNA a singolo filamento 25,33,41 o contro le proteine ​​che partecipano a percorsi di DNA di risposta danno e morte cellulare (ad es p53, H2AX, e caspasi) 13,17,22,40. Tali metodi a base di anticorpi richiedono caratterizzazione completa di anticorpi ed eccellente anticorpo specificità per produrre un elevato rapporto segnale-background. Anche quando specEsistono anticorpi IFIC, possono richiedere la denaturazione delle proteine ​​bersaglio mediante procedure di recupero antigene 34,35. Mentre discutiamo qui, il recupero antigene risultati tessuto muscolare in inaccettabilmente alto autofluorescenza. A differenza dei metodi alternativi, TUNEL raggiunge DNA rilevamento dei danni con un segnale alto e basso fondo, eccellente specificità che può essere testato con semplici controlli positivi e negativi, buona penetrazione tissutale, che non richiedono il recupero dell&#39;antigene, e la risoluzione a livello cellulare. Inoltre, il metodo TUNEL dura circa 4 ore per completare, mentre i metodi alternativi in ​​genere richiedono incubazione durante la notte. Studiamo la morte delle cellule del muscolo scheletrico in un modello murino di atrofia muscolare spinale (SMA) 10 che è stato generato da Hsieh-Li e colleghi 16. Per quantificare cellule apoptotiche nel muscolo, abbiamo sviluppato un metodo di preparazione dei tessuti, la colorazione, e quantificazione che funziona robusto tra i diversi Skelegruppi muscolari Tal in diversi momenti dello sviluppo nei topi. Usiamo un kit TUNEL etichettatura disponibile in commercio e disponibile in commercio software di analisi dell&#39;immagine. Abbiamo anche utilizzato con successo il test TUNEL in combinazione con immunofluorescenza nel midollo spinale 10. I metodi descritti sono utili per gli investigatori che vogliono valutare la patologia dei tessuti, dei meccanismi della malattia, i meccanismi di invecchiamento, e di sviluppo (pre e post-natale) la morte cellulare nel muscolo scheletrico. La tecnica TUNEL è particolarmente utile per gli studi di danno e riparazione del DNA e morte cellulare in sistemi modello in cui solo un sottoinsieme di celle è colpita e risoluzione livello cellulare è necessaria. Questo video descrive la dissezione, processazione dei tessuti, sezionamento, e l&#39;etichettatura TUNEL basato sulla fluorescenza del mouse del muscolo scheletrico. Viene inoltre descritto un metodo di semi-automatico del segnale quantificazione TUNEL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Con la colorazione di successo, il segnale TUNEL-positivi dovrebbe essere abbastanza luminoso per isolare da autofluorescenza impostando soglie di intensità. Oggetti TUNEL-positive a basso ingrandimento possono apparire frammenti irregolari come brillanti nel muscolo scheletrico (Figura 1A). Tuttavia, a più alto ingrandimento, si devono osservare alcuni oggetti TUNEL-positivi con la classica morfologia apoptotica, se il tipo di morte cellulare in questione è l&#39;apoptosi (Figura 1B).</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method at JoVE.com

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.1K Views.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Video: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedure di Rat<em&gt; In situ</em&gt; Proprietà muscolatura scheletrica contrattili

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ricerca

Biologia

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Quantificazione dell'infiltrazione adiposa del muscolo scheletrico mediante decellularizzazione

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autore in primo piano: Quantificazione basata sulla decellularizzazione dell'infiltrazione adiposa del muscolo scheletrico  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.

Quantificazione basata sulla decellularizzazione dell'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analisi CyTOF a cellula singola di progenitori miogenici nella rigenerazione muscolare

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle stem cells become activated upon muscle injury. Following activation, they proliferate, and most of their progeny differentiate to generate fusion-competent muscle cells while the remaining self-renews to replenish the stem cell pool. While the identity of muscle stem cells was defined more than a decade ago, based on the co-expression of cell surface markers, myogenic progenitors were identified only recently using high-dimensional single-cell approaches. Here, we present a single-cell mass cytometry (cytometry by time of flight [CyTOF]) method to analyze stem cells and progenitor cells in acute muscle injury to resolve the cellular and molecular dynamics that unfold during muscle regeneration. This approach is based on the simultaneous detection of novel cell surface markers and key myogenic transcription factors whose dynamic expression enables the identification of activated stem cells and progenitor cell populations that represent landmarks of myogenesis. Importantly, a sorting strategy based on detecting cell surface markers CD9 and CD104 is described, enabling prospective isolation of muscle stem and progenitor cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) for in-depth studies of their function. Muscle progenitor cells provide a critical missing link to study the control of muscle stem cell fate, identify novel therapeutic targets for muscle diseases, and develop cell therapy applications for regenerative medicine. The approach presented here can be applied to study muscle stem and progenitor cells in vivo in response to perturbations, such as pharmacological interventions targeting specific signaling pathways. It can also be used to investigate the dynamics of muscle stem and progenitor cells in animal models of muscle diseases, advancing our understanding of stem cell diseases and accelerating the development of therapies.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Indagine sulle dinamiche cellulari e molecolari durante la rigenerazione muscolare utilizzando tecnologie all'avanguardia a singola cellula<

The protocol presented here enables the identification and high-dimensional analysis of muscle stem and progenitor cells by single-cell mass cytometry and their purification by FACS for in-depth studies of their function. This approach can be applied to study regeneration dynamics in disease models and test the efficacy of pharmacological interventions.

Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...