This work was supported by NIH HL-10342

NOTA: Tutti i protocolli su animali sono stati approvati dall&#39;Università Animal Care and Use Committee Johns Hopkins. 1. Preparazione degli animali <ol><li> Preparare topi 6 C57BL / 6 di controllo per la misurazione DFCO, da loro anestetizzare con ketamina e xilazina come indicato al punto 2.3. </li><li> Preparare tutti gli altri topi con diverse patologie polmonari mostrati nella Tabella 1 usando la stessa procedura per i controlli. I dettagli specifici necessari per stabilire ciascuno di questi modelli si trovano nei riferimenti pertinenti. Topi di controllo e quelle delle altre coorti patologiche sono tutti 6-12 settimane di età. </li></ol> 2. Misura di Diffusion Factor per monossido di carbonio (DFCO) <ol><li> Impostare il modulo gascromatografo fornito con la macchina per misurare picchi di azoto, ossigeno, neon, e il monossido di carbonio. Per questo uso applicazione solo i dati al neon e CO. NOTA: Questo strumento utilizza un s molecolareIEVE colonna con l&#39;elio come gas di trasporto, con un 12,00 micron film, 320.00 ID micron e 10 m di lunghezza. La colonna cromatografo ha un volume di 0,8 ml, ma abbiamo usato 2 ml per garantire un&#39;adeguata compensazione del tubo di collegamento con il campione. </li><li> All&#39;inizio di ogni giornata sperimentale, prima di effettuare le misurazioni dei campioni dai topi, prendere un campione di 2 ml direttamente da un sacchetto di miscela di gas contenente circa lo 0,5% Ne, 0,5% di CO, e bilanciare l&#39;aria, e utilizzare questo esempio per calibrare il gascromatografo. </li><li> Anestetizzare topi con ketamina (90 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), e confermare l&#39;anestesia dall&#39;assenza di movimento riflesso. Applicare pomata veterinaria sugli occhi per evitare la secchezza. Tracheostomize i topi con una cannula stub ago (18 G in adulti o 20 G in molto giovani topi). NOTA: Il DFCO si completa in meno di 10 minuti dopo l&#39;anestesia e prima di ogni ventilazione meccanica o altre procedure. </li><li> Nei topi superiori a 6 settimane di età, usare una siringa da 3 ml to prelevare 0,8 ml di gas dalla sacca miscela di gas. Collegare la siringa cannula tracheale e gonfiare rapidamente il polmone. Utilizzando un metronomo, conta 9 sec, e poi rapidamente ritirare i 0,8 ml (aria espirata). </li><li> Diluire questa ritirati 0,8 ml aria espirata a 2 ml con aria ambiente, lasciarlo riposare per almeno 15 sec. Poi iniettare l&#39;intero campione nel gascromatografo per l&#39;analisi. </li><li> Analizzando questo primo campione DFCO, gonfiare il polmone mouse con una seconda 0,8 ml dal sacchetto miscela di gas, e quindi elaborare questo campione identico al primo campione. La media dei due misurazioni DFCO. NOTA: Per misure in topi giovani come 2 settimane di vita, utilizzare un volume di 0,4 ml, in quanto 0,8 ml è un volume eccessivo di fare misure in polmoni dei giovanissimi topi. E &#39;meglio usare il volume di 0,8 ml per i topi più anziani di 6 settimane, e che se è necessario il volume 0,4 ml per alcuni topi, che dovrebbe essere utilizzato in modo coerente per tutti i mouse nella coorte in fase di studio. </li><li> Calcola DFCOcome 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), dove C e 9 pedici riferiscono alle concentrazioni dei gas di taratura iniettati e gas rimossi dopo un tempo 9 sec apnea, rispettivamente. </li><li> Analizzare e confrontare le differenze con un one-way ANOVA e valutare il livello di significatività con correzione di Tukey per confronti multipli in tutti i topi di coorte. Considerare p &lt;0,05 valore significativo. NOTA: Tutti i topi utilizzati qui facevano parte di studi sperimentali che coinvolgono diverse misurazioni successive di ventilazione polmonare, la meccanica, lavaggio polmonare, o istologia, che non sono riportati qui. Inoltre, dato che il metodo è la stessa in tutti i modelli sperimentali come è stato fatto in precedenza nei topi di controllo, solo i risultati dei vari modelli patologiche sono presentati. Per ulteriori informazioni su questi modelli è presentato nella tabella supplementare. </li><li> Eutanasia degli animali da profondi anestheoverdose tic seguita da dislocazione cervicale o decapitazione. Dove necessario, rimuovere le cellule e / o tessuti polmonari da topi morti per ulteriori biologica o trasformazione istologica e analisi. </li></ol>

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	<li>Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+breath+holding+technique+for+the+clinical+measurement+of+the+diffusing+capacity+of+the+lung+for+carbon+monoxide.">A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide.</a> J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).</li><li>Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusing+capacity+and+forced+vital+capacity+in+5,003+asbestos-exposed+workers:+Relationships+to+interstitial+fibrosis+(ILO+profusion+score)+and+pleural+thickening.">Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening.</a> Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).</li><li>Enelow, R. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palifermin+induces+alveolar+maintenance+programs+in+emphysematous+mice.">Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).</li><li>Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vaccination+as+a+novel+treatment+for+lung+fibrosis.">Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis.</a> PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).</li><li>Alessio, F. 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Nessun conflitto di interesse, e nulla da rivelare.

Nel presente lavoro, abbiamo definito una nuova metrica di quantificare la capacità gas scambio del polmone mouse. Questo parametro è analogo alla capacità di diffusione, una misura comune clinica che misura la funzione primaria del polmone, cioè la capacità di scambiare gas. La capacità di diffusione è l&#39;unica misurazione funzionale polmonare che può essere fatto facilmente e rapidamente sia nei topi e nell&#39;uomo. Per la rilevazione di malattie polmonari nei topi, un obiettivo importante è quello di quantificare i cambiamenti nella funzione polmonare tra controllo e coorti sperimentali. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo definito e utilizzato la DFCO per dimostrare la sua capacità di quanitfying variazioni fenotipiche nella maggior parte dei modelli più comuni di malattia polmonare nei topi, inclusi i cambiamenti funzionali con lo sviluppo del polmone. Un&#39;ipotesi inerente l&#39;approccio che semplifica la misurazione DFCO nei topi è che l&#39;effetto di non miscelato gas inspirato nello spazio morto anatomico e apparecchiature è ignORed. Tuttavia, come precedentemente descritto 10, l&#39;utilizzo del volume di gonfiaggio 0,8 ml introduce un piccolo ma consistente di errore in tutte le misure. L&#39;entità di questo errore è una funzione delle dimensioni relative del gonfiaggio e volumi di spazio morto. Nel presente metodo, questo errore è minimizzata eliminando lo spazio morto in rubinetti o connettori a T, e come mostrato nel video, semplicemente utilizza un dito per sigillare la siringa e facilitare il trasferimento di gas. Questa procedura comporta una elevata ripetibilità tra le misurazioni. L&#39;effetto del volume più piccolo di gonfiaggio richiesta nei giovani topi è chiarito nelle 6 settimane topi mostrati nella Figura 2, dove il primo 0,4 ml prova è stata immediatamente seguita con 0,8 ml di prova in ciascun topo. Con 0,8 ml valore DFCO in era nell&#39;intervallo di C57BL / 6 topi degli altri gruppi, ma la misura con 0,4 ml è sempre più piccolo. Questa è una manifestazione diretta del fatto che con il volume più piccolo, il recovered 9 sec campione ha una maggiore frazione dell&#39;aria spazio morto, che consiste solo delle concentrazioni di gas di controllo. Questo fatto si manifesta come una variazione frazionaria più piccola della concentrazione di CO, che l&#39;avvicina il cambiamento nella concentrazione Ne. Con un aumento del rapporto CO / Ne, la calcolata DFCO (1 - questo rapporto) è quindi più piccola. In molti modelli di patologia polmonare mostrati in Figura 1, c&#39;erano significative diminuzioni osservate in DFCO. Tuttavia, ci sono diversi motivi per cui il DFCO diminuisce in questi diversi modelli. In fibrosi causata dalla singola dose di bleomicina, c&#39;è infiammazione e un ispessimento della barriera di diffusione che porta ad una riduzione della capacità 16 diffondente. In enfisema, vi è una perdita di area superficiale agisce direttamente per diminuire sia la superficie di diffusione e il volume di sangue nei capillari che era stato in pareti distrutte. Nessun relazioni dose-risposta con i elastase sono presentati qui, ma i dati non pubblicati mostra una buona correlazione della DFCO con il livello di danno enfisematosa. Con l&#39;infezione influenzale, vi è riduzione della capacità probabilmente come risultato sia un ispessimento della barriera di diffusione e un aumento nelle regioni non ventilati consolidati di diffusione polmonare. Nel modello dell&#39;influenza PR8 usato qui, questa peggiora nel tempo (come risulta in ulteriore significativa riduzione DFCO al giorno 8), ei topi generalmente muoiono intorno giorno 10. Nei topi nulli CFTR, c&#39;è stato un DFCO più piccolo al basale , ma questi topi sono fatte su un background genetico misto 17, così ci possono essere differenze strutturali con i controlli C57BL6. Tuttavia, l&#39;infezione Aspergillus causato una più consistente diminuzione significativa DFCO, e le ragioni di questo declino con l&#39;infezione fungina è probabile simili a quelli con l&#39;influenza. I risultati LPS di infiammazione acuta che provoca una diminuzione significativamente DFCO, probabilmente da ispessimento edematosa della dibarriera la La fusione e le regioni non ventilati del polmone pieni di liquido. Con la dose di LPS utilizzata, la diminuzione DFCO è maggiore al giorno 4 o 5 e poi recupera torna al controllo di giorno 10 (dati non mostrati). Per l&#39;analisi delle variazioni DFCO con una crescita del polmone nei topi giovani, il volume di inflazione 0,4 ml permesso chiaramente misurazioni riproducibili, ed è stato in grado di mostrare un lento aumento della capacità come il polmone raggiunto la maturità per adulti (figura 2) diffusione. L&#39;effetto di utilizzare un volume di 0,4 ml di gonfiaggio minore discendente l&#39;calcolato DFCO è anche quello che ci si aspettava, ma maggiore di 0,8 ml di volume non può essere utilizzato nei topi piccoli. Ma i cambiamenti con lo sviluppo o patologie devono ancora essere riproducibile rilevabile anche con il volume di 0,4 ml. In conclusione, questo video e manoscritto allegati mostra come ottenere una misurazione funzionale in topi che è simile a quello che può essere misurata in esseri umani. La metrica riflette l&#39;unabilità del polmone di scambio di gas con una varietà di cambiamenti strutturali polmonari causati dalle patologie più comunemente studiati. Questo fattore di diffusione per il monossido di carbonio (DFCO) è altamente riproducibile, e abbastanza sensibile per rilevare i cambiamenti funzionali e strutturali con patologie più sperimentalmente indotti in giovani o vecchi topi. Il fatto che è direttamente analogo a misurazioni simili eseguite nell&#39;uomo per valutare malattia polmonare, rende un modo semplice per ottenere una metrica molto rilevante per phenytype patologie polmonari mouse.

Il mouse è ora l&#39;animale principale utilizzato per modellare una varietà di malattie polmonari. Per studiare i meccanismi che sottostanno tali patologie, sono necessari metodi fenotipici in grado di quantificare il che le alterazioni patologiche. Anche se ci sono molti studi sui topi in cui sono misurati meccanici di ventilazione, queste misure sono generalmente estranei a valutazioni standard di funzionalità polmonare di solito fatto in esseri umani. Questo è un peccato, in quanto la capacità di eseguire misure equivalenti nei topi e soggetti umani possono facilitare la traduzione dei risultati in modelli murini di patologie umane. Una delle misure più comuni e facilmente realizzati in soggetti umani è la capacità di diffusione del monossido di carbonio (DLCO) 1,2, ma questa misura è stato raramente fatto solo in modelli murini. In questi studi in cui è stato segnalato 3-7, non ci sono stati studi di follow-up, in parte perché le procedure sono spesso ingombranti o possono REQuire attrezzature complesse. Un altro approccio è quello di utilizzare un metodo di CO rirespirazione in un sistema di stato stazionario, che ha il vantaggio di essere in grado di misurare CO diffusione in topi coscienti. Tuttavia questo metodo è molto ingombrante, e risultati può variare con il livello di ventilazione del topo e O 2 e CO 2 concentrazioni 8,9. Queste difficoltà sembrano essere precluso l&#39;uso di routine di capacità di individuare patologie polmonari nei topi diffusione, nonostante i suoi numerosi vantaggi. Per aggirare i problemi con la misurazione della capacità nei topi diffusione, dettagli di un semplice mezzo per misurare in topi sono stati recentemente segnalati 10. La procedura elimina il difficile problema di campionamento incontaminata gas alveolare campionando rapidamente un volume pari a tutto il gas ispirato. Questa procedura comporta una misurazione molto riproducibili, definito il fattore di diffusione per il monossido di carbonio (DFCO), che è sensibile a un host di pacambiamenti thologic del fenotipo polmonare. Il DFCO è quindi calcolato come 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), dove c e 9 pedici riferiscono alle concentrazioni dei gas di taratura iniettati e gas rimossi dopo un tempo 9 sec apnea, rispettivamente. DFCO è una variabile adimensionale, che varia tra 0 e 1, con 1 riflettendo completo assorbimento di tutti CO, e 0 riflettendo nessun assorbimento di CO. In questa presentazione vi mostriamo come fare questa misura la capacità di diffusione, e in che modo può essere utilizzato per documentare i cambiamenti in quasi tutti i modelli di malattia del mouse polmone esistenti, tra cui l&#39;enfisema, la fibrosi, danno polmonare acuto, e le infezioni virali e fungine.

<table><tbody><tr><td>Gas Chromatograph</td><td>Inficon</td><td>Micro GC Model 3000A</td><td>Agilent makes a comparable model</td></tr><tr><td>18 G Luer stub needle</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td>Several other possible vendors</td></tr><tr><td>3 ml plastic syringe</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td>Several other possible vendors</td></tr><tr><td>Polypropylene gas sample bags</td><td>SKC</td><td>1 or 2 L capacity works well</td><td>Other gas tight bags will work well</td></tr><tr><td>Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)</td><td>Airgas, Inc</td><td>Z04 NI785ME3012</td><td>This is the standard mixture used for DLCO in humans</td></tr><tr><td>25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porcine pancreatic elastase</td><td>Elastin Products, Owensville, MO</td><td></td><td>5.4 U</td></tr><tr><td>Bleomycin</td><td>APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL</td><td></td><td>0.25 U</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; LPS</td><td>Sigma L2880</td><td></td><td>3 &amp;mu;g/g body weight; O55:B5</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Aspergillus fumigatus &lt;/i&gt; (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

phenotyping mouse pulmonary function in vivo with the lung diffusing capacity

Il mouse è ora l&#39;animale principale utilizzato per modellare una varietà di malattie polmonari. Per studiare i meccanismi che sono alla base di tali patologie, sono necessari metodi fenotipici in grado di quantificare i cambiamenti patologici. Inoltre, per fornire rilevanza traslazionale ai modelli murini, tali misure devono essere prove che possono essere facilmente fatto in entrambi gli esseri umani e topi. Sfortunatamente, nella presente letteratura alcune misurazioni fenotipiche della funzione polmonare hanno applicazione diretta agli esseri umani. Un&#39;eccezione è la capacità di diffusione del monossido di carbonio, che è una misura che viene normalmente fatto in esseri umani. Nella presente relazione, descriviamo un mezzo per misurare rapidamente e semplicemente questo capacità di diffusione nei topi. La procedura implica breve gonfiaggio polmonare con gas traccianti in un mouse anestetizzato, seguito da un tempo di analisi gas 1 min. Abbiamo testato la capacità di questo metodo per individuare varie patologie polmonari, tra cui l&#39;enfisema, la fibrosi, danno polmonare acuto, e l&#39;influenza einfezioni polmonari fungine, così come il monitoraggio la maturazione polmonare in giovani cuccioli. I risultati mostrano una significativa diminuzione di tutte le patologie polmonari, nonché un aumento della capacità di diffusione con la maturazione polmonare. Questa misura di capacità di diffusione polmonare fornisce quindi un test di funzionalità polmonare, che ha una vasta applicazione con la sua capacità di rilevare i cambiamenti strutturali fenotipiche con la maggior parte dei modelli di polmone patologiche esistenti.

La figura 1 mostra le misurazioni DFCO dai topi adulti in gruppi A, B, C, D, E e F. c&#39;erano diminuzioni significative con entrambe le infezioni da Aspergillus e influenza, nonché riduzioni significative del fibrotico, enfisematosa, e acuta modelli danno polmonare. La figura 2 mostra il gruppo G alterazioni dello sviluppo DFCO nel tempo come l&#39;età topi 2-6 settimane. C&#39;è stato un lieve ma significativo aumento con lo sviluppo polmonare nel corso del tempo. L&#39;effetto di utilizzare un volume più piccolo di gonfiaggio è anche abbastanza evidente al punto di tempo di 6 settimane. C&#39;era una tendenza per le donne avere un DFCO leggermente superiore, ma questo era solo significativo al punto di tempo cinque settimane. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:40px;"> Gruppo </td><td> Patologia o Condition </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> La </td><td> C57BL / 6 controlli (8-10 settimane), n = 6 </td><td> Topi sani &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> B </td><td> C57BL / 6 topi data 25 TCID50 di virus influenzale A (PR8) intranasale, n = 10 </td><td> Modello Influenza, studiato 6 e 8 giorni dopo l&#39;infezione </td></tr><tr><td> C </td><td> C57BL / 6 topi dato 5.4 U elastasi pancreatica tracheale, n = 6 </td><td> Modello di enfisema 10,13 studiato 21 giorni dopo sfida elastasi </td></tr><tr><td> D </td><td> C57BL / 6 topi dato 0,05 U bleomicina tracheale, n = 6 </td><td> Modello Fibrosi 14 studiato 14 giorni dopo la sfida bleomicina </td></tr><tr><td> E </td><td> CFTR controlli nulli e quelli infettati con aerosol inalazione di Aspergillus fumigatus (ceppo AF293), n = 6 </td><td> Modello di infezione fungina 11,17 studiato 12 giorni dopo l&#39;infezione fungina </td></tr><tr><td> F </td><td> C57BL / 6 topi data 3 mcg LPS / g BW (Escherichia coli) tracheale, n = 6 </td><td> Acute Lung Injury (ALI) del modello 15 ha studiatonei giorni 1 e 4, dopo l&#39;insulto LPS </td></tr><tr><td> Sol </td><td> C57BL / 6 topi maschi a 2 a 6 settimane di età, n = 5 a ogni età </td><td> Modello di sviluppo del polmone </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Elenco dei diversi modelli murini in cui è stata misurata la DFCO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52216/52216fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Misurazione della DFCO nel controllo C57BL / 6 topi (gruppo A) e in ciascuno dei 5 diversi modelli patologici sono riportati risultati 6 e 8 giorni dopo l&#39;influenza PR8 (Gruppo B), 21 giorni dopo elastasi intratracheale (Group C), 14 giorni dopo la bleomicina endotracheale (Gruppo D), 12 giorni dopo l&#39;infezione Aspergillus nei topi CFTR nulli (Gruppo E), e 1 e 4 giorni dopo l&#39;instillazione LPS (Gruppo F). Il simbolo * indica P &lt;0,01 vs. controllo, il # indica P &lt;0.01 tra il 6 e8 topi influenzali giorno e topi 1 e 4 giorni LPS, e il + indica P &lt;0.05 vs controllo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52216/52216fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2: Misura della DFCO in maschi C57BL / 6 topi da 2 a 6 settimane di età (gruppo G) Le misurazioni sono state effettuate in tutti i topi con un volume di 0,4 ml di gonfiaggio, e in 6 settimane di età topi una seconda misura era. realizzato con 0,8 ml. Con il volume 0,4 ml, c&#39;erano aumenti significativi DFCO tra il maschio di 2 settimane e quelli a 4, 5, e 6 settimane (P &lt;0.05).

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Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Fenotipizzazione mouse Pulmonary Function<em&gt; In Vivo</em&gt; Con la capacità polmonare Diffusione

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

10.6K Views.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Video: Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Ricerca

Medicina

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

Misura della curva di pressione-volume in mouse polmoni

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Immunologia e infezioni

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Biologia

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Valutazione della funzione respiratoria in topi cosciente da doppia camera pletismografia

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Hyperpolarized 129Xe Lung MRI and Spectroscopy in Mechanically Ventilated Mice

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can be exploited to quantify pulmonary physiology, including ventilation, restricted diffusion (alveolar-airspace size), and gas exchange. In humans, it has been used to evaluate disease severity and progression in a variety of pulmonary disorders and is approved for clinical use in the United States and United Kingdom. Beyond its clinical applications, the ability of 129Xe MRI to noninvasively assess pulmonary pathophysiology and provide spatially resolved information is valuable for preclinical research. Among animal models, mice are the most widely used due to the accessibility of genetically modified disease models. Here, 129Xe MRI is promising as a minimally invasive, radiation-free, and sensitive technique to longitudinally monitor lung disease progression and therapy response (e.g., in drug discovery). This technique can extend to preclinical applications by incorporating an MRI-triggered, free-breathing apparatus or mechanical ventilator to deliver gas. Here, we describe the steps and provide checklists to ensure robust data collection and analysis, including creating a thermally polarized xenon gas phantom for quality control, optimizing polarization, animal handling (sedation, intubation, ventilation, and care for mice), and protocols for ventilation, restricted diffusion, and gas exchange data. While preclinical 129Xe MRI can be applied in various animal models (e.g., rats, pigs, sheep), this protocol focuses on mice due to the challenges posed by their small anatomy, which are balanced by their affordability and the availability of many disease models.

Hyperpolarized xenon MRI can quantify regional lung microstructure (air-space dimensions) and physiology (ventilation and gas exchange) in translational research and clinical care. Although challenging, it can provide comparable pulmonary insights in preclinical studies. This protocol describes the infrastructure and procedures needed to perform routine xenon lung MRI in mice.

Risonanza magnetica polmonare iperpolarizzata 129Xe e spettroscopia in topi ventilati meccanicamente

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can ...

Bioingegneria

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative assessment of lung function in rodent models is an important tool in the development of future therapies. Commonly used techniques for assessing respiratory function including invasive plethysmography and forced oscillation. While these techniques provide valuable information, data collection can be fraught with artefacts and experimental variability due to the need for anesthesia and/or invasive instrumentation of the animal. In contrast, unrestrained whole-body plethysmography (UWBP) offers a precise, non-invasive, quantitative way by which to analyze respiratory parameters. This technique avoids the use of anesthesia and restraints, which is common to traditional plethysmography techniques. This video will demonstrate the UWBP procedure including the equipment set up, calibration and lung function recording. It will explain how to analyze the collected data, as well as identify experimental outliers and artefacts that results from animal movement. The respiratory parameters obtained using this technique include tidal volume, minute volume, inspiratory duty cycle, inspiratory flow rate and the ratio of inspiration time to expiration time. UWBP does not rely on specialized skills and is inexpensive to perform. A key feature of UWBP, and most appealing to potential users, is the ability to perform repeated measures of lung function on the same animal.

The assessment of respiratory physiology has traditionally relied upon techniques, which require restraint or sedation of the animal. Unrestrained whole-body plethysmography, however, provides precise, non-invasive, quantitative analysis of respiratory physiology in animal models. In addition, the technique allows repeated respiratory assessment of mice allowing for longitudinal studies.

Misurare funzione respiratoria nei topi mediante sfrenato Pletismografia corpo intero

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a metachronal, synchronal fashion, these multiple, motile, actin-based organelles generate a cephalad fluid flow clearing the respiratory tract of inhaled pollutants and pathogens. With increasing environmental pollution, novel viral pathogens and emerging multi-drug resistant bacteria, cilia generated mucociliary clearance (MCC) is essential for maintaining lung health. MCC is also depressed in multiple congenital disorders like primary ciliary dyskinesia, cystic fibrosis as well as acquired disorders like chronic obstructive pulmonary disease. All these disorders have established, in some case multiple, mouse models. In this publication, we detail a method using a small amount of radioactivity and dual-modality SPECT/CT imaging to accurately and reproducibly measure MCC in mice in vivo. The method allows for recovery of mice after imaging, making serial measurements possible, and testing potential therapeutics longitudinally over time. The data in wild-type mice demonstrates the reproducibility of the MCC measurement as long as adequate attention to detail is paid, and the protocol strictly adhered to.

In this publication, we describe protocols for assessing airway mucociliary clearance (MCC) in mice in vivo utilizing dual-modality radionuclide imaging. This protocol is designed for a single photon emission computed tomography (SPECT) and computed tomography (CT) acquisition protocol using mouse whole body (MWB) collimators in a dual SPECT/CT system.

Valutazione in vivo del nulla osta mucociliario nei topi

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

Evaluation of Lung Function in an Ex vivo Murine Model

Respiratory mechanics are a key area of study in defining and treating lung pathologies by assessing functional lung capacity. Lung mechanics can be evaluated through various lung maneuvers that involve different oscillatory waveforms. When applied to the lungs, these maneuvers measure multiple variables, such as pressure, volume, and flow, based on the response to the waveforms. These signals are then computed and analyzed to determine parameters such as hysterisivity, resistance, compliance, tissue damping, and tissue elastance, providing a detailed assessment of overall lung function. The analysis of respiratory mechanics is particularly important in evaluating donor lungs for lung transplantation. The present protocol is the first of its kind, offering a comprehensive and reproducible stepwise method for assessing respiratory mechanics using an ex vivo murine model. It includes details on the selected animal model, lung recovery, storage and preservation, and experimentation using a forced oscillation technique-based system. Additionally, it outlines data analysis, clinical significance, and the applications of the forced oscillation technique in studying an ex vivo model.

The present protocol describes a stepwise method for analyzing the respiratory mechanics of an ex vivo murine model using the forced oscillation technique (FOT).

Valutazione della funzione polmonare in un modello murino ex vivo

Respiratory mechanics are a key area of study in defining and treating lung pathologies by assessing functional lung capacity. Lung mechanics can be ...

Fenotipizzazione mouse Pulmonary Function

Riepilogo

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