Vorremmo ringraziare Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui per i loro sostanziali contributi allo sviluppo iniziale di questo protocollo. Gli autori sono grati alla comunità delle mosche per la loro generosità con i reagenti, e in particolare a Ruth Lehmann e Benjamin Lin per il loro dono della linea nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' prima della sua pubblicazione. In questo studio sono state utilizzate le scorte ottenute dal Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Questo lavoro è stato supportato da NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D) e dalle borse di formazione T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).

1. Preparazione del giorno prima della dissezione
<ol><li>Affilare elettroliticamente un ago di tungsteno24 in modo che il diametro risultante sia di circa 0,03 mm. Regolare la tensione fornita a circa 14 V e utilizzare 3,3 M NaOH. L'affilatura non dovrebbe richiedere più di 1 o 2 minuti. ATTENZIONE: NaOH è altamente corrosivo e causerà ustioni a contatto con la pelle. Indossare guanti e occhiali durante la manipolazione e lavorare all'interno di un cappuccio fumi. NOTA: Dopo l'uso, conservare NaOH in un tubo Falcon in polipropilene.</li>
	<li>Creare il supporto di imaging preparato. In un tubo conico da 15 mL, combinare 4,25 mL di mezzi di Schneider con 750 μL di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale del 15%) e 27,5 μL di penicillina-streptomicina (0,05 U/μL di penicillina, 0,05 μg/μL di concentrazione finale). Conservare questo supporto di imaging preparato a 4 °C.</li>
	<li>Fare la soluzione eptano-colla. Aggiungere circa 0,5 mL di eptano a un flaconcino sigillabile da 20 mL farcito con nastro biadesivo di circa 20 cm. Cullare su un nutatore per circa un'ora o mescolare con una punta di pipetta fino a raggiungere una consistenza tra quella di acqua e glicerolo. Questa soluzione di colla disciolta durerà per diversi giorni prima che l'eptano evapori. Per rinfrescare la soluzione, aggiungere altri 0,5 ml di eptano e roccia. NOTA: Una soluzione efficace di eptano-colla può essere preparata utilizzando vari rapporti tra eptano e nastro adesivo, nonché durate variabili di oscillazione / agitazione. Le specifiche di cui sopra sono solo suggerimenti per preparare o rinfrescare una di queste soluzioni adeguate.</li>
</ol>2. Raccolta degli embrioni: 15-17 ore prima della dissezione
<ol><li>Aggiungere la pasta di lievito fresco a un piatto di agar di succo di mela25. Allestire una gabbia per la raccolta degli embrioni aggiungendo mosche adulte (meno di 10 giorni) a una bottiglia di cibo vuota, perforata con piccoli fori26. Tappare la gabbia di raccolta utilizzando la piastra di agar lievitato, fissata alla bottiglia, e posizionare la gabbia con il lato della piastra verso il basso in un'incubatrice scura a 25 °C per 1 ora. NOTA: Le mosche devono esprimere un transgene che segnerà fluorescentemente la gonade, ad esempio six4-eGFP::Moesin20, perché la dissezione degli embrioni avverrà sotto un microscopio stereo-fluorescente. Vedere Tabella dei materiali per un elenco dei genotipi utilizzati per contrassegnare la gonade.</li>
	<li>Rimuovere la gabbia dall'incubatrice e scartare questa prima raccolta. Sostituirlo con una piastra di agar appena lievitato e riposizionare la gabbia nell'incubatrice per 2 ore. NOTA: La prima raccolta di embrioni viene utilizzata per liberare le femmine dagli embrioni fecondati e in via di sviluppo, per ottenere una seconda raccolta di embrioni strettamente programmata.</li>
	<li>Rimuovere la piastra di agar dalla gabbia e posizionarla (con il lato lievitato rivolto verso l'alto) su un tovagliolo di carta umido all'interno di un contenitore di plastica sigillabile. Posizionare questa camera umida in un'incubatrice a 25 °C per invecchiare gli embrioni per 14,5 ore (età finale, 14,5-16,5 ore dopo la deposizione delle uova). NOTA: immediatamente prima di iniziare il passaggio 2.4, completare i passaggi 3.1 e 3.2.</li>
	<li>Rimuovere la piastra di agar dall'incubatrice e, usando una bottiglia di schizzo, aggiungere abbastanza acqua alla piastra di agar per sciogliere la pasta di lievito spazzolando leggermente con un pennello. Risciacquare gli embrioni e il lievito disciolto in un piccolo cestello a rete seduto all'interno di una barca di pesatura. Risciacquare il cestello con la bottiglia di spruzzo d'acqua fino a quando la maggior parte della pasta di lievito non è filtrata attraverso la rete.</li>
	<li>Rimuovere l'acqua dalla barca di pesatura e riposizionare il cestello all'interno. Decorionare gli embrioni immergendoli in una soluzione di candeggina al 50%, utilizzando un flacone di schizzo. La soluzione di candeggina dovrebbe avere una profondità di 3-5 mm. Tenere gli embrioni immersi nella candeggina per ~ 2 minuti, con vortici occasionali. ATTENZIONE: La candeggina è corrosiva e può irritare o danneggiare gli occhi e le vie respiratorie. Indossare guanti e occhiali mentre si maneggia la candeggina. NOTA: durante questo periodo, completare il più possibile il passaggio 3.3. L'avanzamento della decorionazione può essere controllato posizionando il cestello sotto uno stereomicroscopio e controllando l'assenza delle appendici dorsali. Immergere gli embrioni nella soluzione di candeggina per un ulteriore tempo, se necessario.</li>
	<li>Scartare la candeggina e risciacquare accuratamente gli embrioni all'interno del cestello con acqua da una bottiglia di schizzo (per ~ 3 s, tamponando il cestello a rete con carta assorbente; ripetere 2-3 volte).</li>
</ol>3. Preparazione del giorno di dissezione
<ol><li>Aggiungere 30 μL di insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL di imaging preparato (vedere fase 1.2) in un tubo di Eppendorf da 1,5 mL (concentrazione finale di 0,2 mg/mL). Mescolare bene e lasciare il tubo sul banco per equilibrare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare strisce di coverslip rivestite con colla.<ol>
<li>Utilizzare un coltello con punta di diamante per tagliare un coverslip di 22 mm x 22 mm in quattro strisce di dimensioni uguali (Figura 1A).</li>
		<li>Utilizzare una pinza per raccogliere una striscia e distribuire un totale di circa 30 μL di soluzione di eptano-colla su entrambi i lati della striscia (Figura 1B). Per ottenere uno strato uniforme di residui di colla, inclinare la striscia a varie angolazioni mentre l'eptano evapora.</li>
		<li>Conservare la striscia ricoperta di colla in una fessura vuota di una scatola di coverslip; per mantenere la sua viscosità, posizionare la striscia in posizione inclinata, ma verticale, appoggiandosi ai bordi della scatola per ridurre al minimo il contatto con le superfici della scatola (Figura 1C). Chiudere la scatola in modo che le particelle nell'aria non rivestano la colla e ne riducano la viscosità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare i seguenti elementi sul banco: una pipetta Pasteur in vetro da 6 pollici, un vetrino per microscopio, un pipettaman P200 e P1000 con le punte appropriate per pipette, la soluzione27 di Ringer (pH regolato a 7,3 con NaOH) e una parabola di imaging da 35 mm rivestita in Poli-D-lisina scoperta.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni dal cestello dello schermo a rete a un piccolo vetro dell'orologio riempito con 500-750 μL di eptano.<ol>
<li>Asciugare i lati e il fondo del cestello con una salvietta di tessuto. Inumidire un pennello nell'eptano, toccare il pennello agli embrioni (la membrana vitellina idrofobica dovrebbe aderire alle setole) e immergere nuovamente il pennello nell'eptano nel vetro dell'orologio (gli embrioni dovrebbero affondare sul fondo). NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per evitare che gli embrioni si secchino. Gli embrioni non devono essere esposti all'aria per più di 20 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire gli embrioni sul vetrino del microscopio utilizzando una pipetta Pasteur (Figura 1D). Aspirare lentamente gli embrioni nella pipetta e limitarli alla porzione stretta della pipetta. Gli embrioni di pipetta sul vetrino lentamente, in modo tale che si aggregano appena all'interno della punta della pipetta prima di fluire sul vetrino. Ruotare l'angolo di una salvietta di tessuto in una punta fine e allontanare l'eptano dagli embrioni sul vetrino. Si aggregano e coprono un'area più piccola, rendendo più facile catturarli su una striscia ricoperta di colla nella fase successiva.</li>
	<li>Con la pinza, raccogliere una striscia ricoperta di colla e toccarla delicatamente agli embrioni (Figura 1E). Posizionare la striscia nel piatto di imaging, nell'embrione lateralmente e appena fuori dal centro rivestito di poli-D-lisina. Premere la striscia sul piatto usando una pinza, per assicurarsi che sia fissata in posizione. Inondare immediatamente il piatto con 2-3,5 ml di soluzione di Ringer; immergere prima gli embrioni per evitare che si secchino (Figura 1F).</li>
</ol>4. Dissezione
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti al microscopio stereofluorescenza.
<ol><li>Devitellinizzare 10-15 embrioni. NOTA: Questo può variare da due embrioni, per principianti, a quindici embrioni, per esperti.<ol>
<li>Selezionare gli embrioni di stadio 16 in base alla morfologia intestinale (Figura 2). In questa fase, gli embrioni hanno tre costrizioni intestinali che creano quattro segmenti intestinali impilati (Figura 2B,B'). Per iniziare la devitellinizzazione, perforare l'embrione selezionato a un'estremità, preferibilmente quella anteriore, con l'ago di tungsteno. L'embrione può uscire dalla sua membrana vitellina, ma in caso contrario, staccare la membrana dall'embrione. NOTA: Gli embrioni troppo giovani per essere sezionati hanno un intestino non regionalizzato (Figura 2C). La dissezione degli embrioni di stadio 17 è possibile, ma più impegnativa della dissezione di embrioni di stadio 16 perché la cuticola sta iniziando a svilupparsi in questa fase. Gli embrioni di stadio 17 precoce presentano quattro segmenti intestinali che sono spostati l'uno rispetto all'altro (Figura 2D,D').</li>
		<li>Aggancia l'ago attraverso l'embrione in una regione lontana dalle gonadi. Trasferire l'embrione uncinato nella regione rivestita di polilisina del piatto (da qui in poi indicato semplicemente come "cover slip") e trascinarlo contro il fondo fino a quando non aderisce. Ripeti questi passaggi e disponi gli embrioni devitellinizzati in fila lungo la parte superiore dello slip di copertura rivestito di polilisina (Figura 3A), lasciando molto spazio sotto per un'ulteriore dissezione. NOTA: Le gonadi appaiono come piccoli aggregati sferici di cellule che dovrebbero fluorescere brillantemente, a seconda del marcatore specifico utilizzato e del numero di copia transgenica. In questa fase, le gonadi si trovano lateralmente nel segmento A5, a circa il 70%-80% della lunghezza dell'embrione dall'anteriore. Durante tutto il protocollo di dissezione, il tessuto può attaccarsi all'ago. Per liberare l'ago dai detriti, sollevarlo appena sopra la superficie della soluzione del Ringer. La devitellinizzazione può essere disordinata finché la gonade vera e propria è disturbata il meno possibile.</li>
	</ol></li>
	<li>Finezza le gonadi fuori dall'embrione e sul piatto (Figura 3C,D).<ol>
<li>In primo luogo, filettare l'embrione per esporre il suo interno (Figura 3C). Taglia l'embrione dal suo centro, muovendo l'ago posteriormente, tra le gonadi. Stuzzicare un po 'di tessuto interno, in quanto questo si attaccherà al piatto molto meglio della cuticola esterna. La viscosità del tessuto consentirà alle successive manipolazioni di rivelare la gonade e consentirle di aderire allo slittamento del coperchio. NOTA: se il tessuto non si attacca al piatto, prova a convincerlo in una regione incontaminata dello slip di copertura rivestito; le regioni esterne dello slittamento del coperchio saranno particolarmente appiccicose. Come indicato nel passaggio 4.1.2, non importa se le manipolazioni di dissezione provocano una carcassa embrionale maciullata, purché le gonadi rimangano indenni.</li>
		<li>Usa l'ago per affettare una gonade fino a quando un pezzo di tessuto, compresa la gonade, è separato dalla carcassa rimanente. Con l'ago, disegnare questo tessuto in una regione fresca di copertura rivestita e convincerlo contro il fondo fino a quando non aderisce al piatto. NOTA: La migliore immagine sarà ottenuta per quei casi in cui la gonade stessa si attacca direttamente allo slittamento del coperchio, piuttosto che all'attacco indiretto tramite tessuto sovrastante. Pertanto, mentre il tessuto viene guidato lontano dalla carcassa, tentare di far scivolare prima la gonade sul coperchio, piuttosto che il tessuto estraneo.</li>
		<li>Rimuovere il più possibile il tessuto circostante dalla gonade (Figura 3D) trascinando delicatamente il tessuto aderente lontano dalla gonade con l'ago. Evitare di toccare direttamente la gonade, che la danneggerebbe (Figura 4E). Per assicurarti che la gonade sia sufficientemente aderente al piatto, sposta l'ago con un delicato movimento circolare attorno alla gonade, se si muove, tocca l'ago sul tessuto aderente rimanente e dirigi la gonade verso una regione fresca di scivolamento appiccicoso della copertura. Ripeti questo processo fino a quando non c'è alcun movimento rilevabile della gonade.</li>
		<li>Ritorna alla carcassa dell'embrione e seziona la seconda gonade. Ripeti questo processo sul maggior numero possibile di embrioni ma NON superare i 25 minuti. La vitalità tissutale sarà compromessa nella soluzione di Ringer dopo più di ~ 40-45 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta completate le dissezioni, utilizzare un marcatore indelebile per aggiungere segni di registrazione al bordo esterno della parabola di imaging per registrarne l'orientamento durante la dissezione.</li>
	<li>Rimuovere la striscia rivestita di colla dal piatto.<ol>
<li>Inserire delicatamente la punta inferiore di un paio di pinze sotto la striscia, stringere e inclinare lentamente la striscia verso l'alto per liberarla dal piatto con il minor scorrimento possibile della soluzione di Ringer per ridurre al minimo il disturbo delle gonadi aderenti. NOTA: la striscia deve essere inclinata lontano dalle gonadi sezionate.</li>
	</ol></li>
	<li>Portare delicatamente il piatto al microscopio per immagini in modo da evitare lo slittamento della soluzione di Ringer.</li>
</ol>5. Imaging
<ol><li>Posizionare la parabola di imaging nel supporto del palco, utilizzando i segni di registrazione per posizionare la parabola nell'orientamento approssimativo come durante la dissezione. Utilizzando la microscopia a campo luminoso e un obiettivo a bassa potenza (~ 10x), identificare e mettere a fuoco qualsiasi pezzo di tessuto che aderisce al coperchio. Cambia le impostazioni dell'oculare per rivelare la fluorescenza e, utilizzando gli oculari binoculari, scansiona sistematicamente il piatto, contrassegnando la posizione di ciascuna gonade all'interno del software di imaging (vedi Tabella dei materiali). NOTA: assicurarsi che le gonadi siano centrate nel campo visivo prima di contrassegnare le posizioni.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente l'intero gruppo portastadio, con la parabola di imaging nel supporto, e posizionare l'assemblaggio sul banco di lavoro.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di Ringer con il mezzo di imaging preparato contenente insulina (vedere i passaggi 1.2 e 3.1).<ol>
<li>Utilizzare un P1000 per rimuovere tutta la soluzione di Ringer dalla sporgenza superiore interna della parabola di imaging (non pipettare Ringer dalla regione di scorrimento del coperchio centrale). Quindi, passa a un P200 e posiziona la sua punta appena sotto la superficie dei Ringer rimanenti nella regione centrale. Rimuovere con attenzione 50-100 μL di Ringer; NON rimuovere l'intera soluzione.</li>
		<li>Aspirare ~ 200 μL di supporti di imaging e, posizionando nuovamente la punta P200 appena sotto la superficie della suoneria rimanente, aggiungere lentamente questo supporto di imaging. Quindi, aggiungere il supporto di imaging rimanente (~ 1.300 μL) al piatto, a partire dal bordo più esterno della sporgenza superiore. Durante il pipettaggio, spostati verso la cupola centrale del fluido e alla fine unisci i due spazzolando la punta della pipetta su entrambi. Posizionare il coperchio sul piatto. NOTA: il supporto di imaging deve coprire l'intero diametro interno del piatto, con una profondità di circa 2 mm, per evitare l'evaporazione (Figura 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passare il microscopio a un obiettivo di potenza superiore (63x, 1,2 NA), applicare il fluido di immersione appropriato in base all'obiettivo utilizzato (tipo di fluido ad immersione e indice di rifrazione richiesto dall'obiettivo) e quindi sostituire l'assieme portastadio. Utilizzare la microscopia a campo luminoso per concentrarsi sul tessuto aderente al fondo della parabola di imaging. NOTA: se il palco non è stato spostato, l'ultima gonade dovrebbe essere visualizzata una volta che l'obiettivo è focalizzato.</li>
	<li>Passa attraverso ogni posizione della gonade contrassegnata e regola quella posizione, se necessario. Seleziona quali gonadi visualizzare in base alla chiarezza dell'immagine, al sesso delle gonadi, ecc. Personalizza le impostazioni di imaging (multicanale, tempi di esposizione, intensità laser, incrementi della serie Z, time-lapse con intervalli appropriati, ecc.). Inizia l'imaging. NOTA: Le gonadi maschili possono essere identificate dalla presenza sia di una nicchia, sia all'estremità opposta della gonade, un gruppo di piccole cellule somatiche altamente circolari chiamate precursori gonadici somatici maschili-specifici (msSGP). Se viene utilizzato il marcatore fluorescente six4-eGFP::moesin, le cellule di nicchia sono le seconde cellule più luminose nella gonade, la più luminosa è la msSGP. In questa fase, le gonadi femminili non hanno né una nicchia né msSGP.</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Durante la gonadogenesi, la gonade embrionale, e in particolare la nicchia delle cellule staminali all'interno della gonade maschile15, subisce rapidi cambiamenti morfologici. I meccanismi di sviluppo che sono alla base di questi cambiamenti dinamici sono meglio compresi attraverso tecniche di live-imaging. Tuttavia, allo stadio embrionale 17, l'imaging in vivo della gonade è reso impossibile dall'insorgenza di contrazioni muscolari su larga scala17. Con questo protocollo, forniamo un'alternativa di successo: la dissezione delle gonadi direttamente su una parabola di imaging per l'imaging live ex vivo . Questo protocollo presenta l'unico metodo disponibile per realizzare l'imaging dal vivo della gonade embrionale in fase avanzata.
I passaggi critici del protocollo devono essere eseguiti con un'attenzione acuta alla destrezza e alla tempistica. Prima della dissezione, il rapido montaggio degli embrioni è fondamentale per garantire che gli embrioni non si disidratino e rimangano sani e turgidi, il che facilita la devitellinizzazione e la dissezione. Durante la dissezione, è fondamentale evitare l'interruzione della matrice extracellulare gonadica, che viene eseguita utilizzando solo manipolazioni delicate e precise. L'uso di tale destrezza garantirà anche che la gonade sia in contatto diretto con la parabola di imaging, consentendo così un'immagine chiara direttamente attraverso il coverslip. Dopo la dissezione, la soluzione di Ringer deve essere commutata per i mezzi di imaging utilizzando solo un'aspirazione e un'espulsione delicate con una pipetta per evitare lo spostamento delle gonadi. Infine, è importante limitare il tempo complessivo di dissezione a 25 min. Ciò garantisce che la quantità di tempo trascorso nella soluzione di Ringer durante la dissezione e la posizione del tessuto nella confocale siano limitate a un'esposizione non tossica. Con l'aumento della pratica, la velocità di dissezione migliorerà e si verificherà la personalizzazione della sequenza di dissezione. Nella nostra esperienza, una dissezione sufficiente può essere raggiunta dopo circa una settimana di pratica regolare, con piena padronanza della dissezione raggiungibile in circa 1 mese. Per facilitare l'apprendimento, ti consigliamo di praticare i singoli passaggi prima di eseguire l'intero protocollo.
Esistono una serie di buone pratiche che migliorano le sfide associate a questo protocollo, a partire dal genotipo degli embrioni utilizzati per la dissezione. L'incorporazione di più copie del transgene utilizzato per contrassegnare la gonade renderà la gonade più luminosa e quindi più facile da visualizzare e sezionare. La dissezione stessa funziona meglio con un ago affilato, anche se non dovrebbe essere eccessivamente affilata, in quanto si piegherà contro il fondo del piatto di imaging e diventerà gravata da tessuto estraneo. I mezzi di imaging di Schneider si auto-fluoresceno nello spettro delle emissioni verdi, il che rende difficile individuare le gonadi contrassegnate con GFP una volta aggiunto il supporto. Pertanto, è fondamentale utilizzare il software di imaging confocale per contrassegnare la posizione delle gonadi mentre sono ancora nella soluzione della suoneria. Se localizzare le gonadi alla confocale rimane difficile, dopo la dissezione successiva suggeriamo di abbozzare o scattare un'immagine del posizionamento relativo delle gonadi nel piatto mentre si è ancora al microscopio di dissezione. Quindi, contrassegnare l'esterno del piatto per indicare il suo orientamento durante la dissezione e abbinare questo orientamento quando si passa al microscopio confocale. Una volta localizzato alla confocale, se una gonade appare interrotta o maciullata, nella dissezione successiva prova a lasciare più tessuto aderente che circonda la gonade. Al contrario, se una gonade è presente ma appare sfocata su tutti i piani, è probabile che ci sia tessuto tra il coverslip e la gonade, e le dissezioni future dovrebbero sforzarsi di un migliore isolamento della gonade dal tessuto aderente. Nella nostra esperienza, l'adozione di queste pratiche ha facilitato l'apprendimento e l'esecuzione di questo protocollo.
Durante la formazione di questo protocollo, abbiamo identificato diverse alterazioni che potrebbero essere applicate. Per gli studi di compattazione di nicchia, miriamo a sezionare gli embrioni allo stadio 16. In questa fase, l'embrione non ha ancora sviluppato quantità significative di cuticola e si attacca facilmente al piatto rivestito di polilisina. Tuttavia, questa tecnica può essere modificata per sezionare embrioni più vecchi con cuticola attaccandoli alla parete interna della regione rivestita di poli-lisina per la prima incisione. Una volta esposti i tessuti interni, la carcassa dell'embrione si attaccherà alla polilisina e la dissezione può procedere normalmente. Oltre agli aggiustamenti per l'età embrionale, abbiamo adattato con successo questa tecnica per sezionare più genotipi nello stesso piatto. Ad esempio, i mutanti omozigoti possono essere separati dagli eterozigoti fratelli mediante l'uso di un marcatore facilmente distinguibile come YFP deformato sul cromosoma bilanciatore. Dopo la devitellinizzazione, gli embrioni devono essere trasferiti su entrambi i lati del coverslip in base alla presenza o all'assenza del marcatore. La dissezione dovrebbe procedere verso il basso nel piatto come descritto nel protocollo, con particolare attenzione per mantenere la segregazione dei diversi genotipi. Inoltre, questo protocollo potrebbe potenzialmente essere modificato per utilizzare terreni di coltura diversi da quello di Schneider, anche se un'indagine superficiale su Shields e Sang M3 Insect Media ha prodotto gonadi non praticabili (dati non mostrati). Inoltre, questo protocollo si abbina bene con le manipolazioni farmacologiche semplicemente combinando il farmaco con i mezzi di imaging. Per un periodo di imaging di 5 ore, potrebbe essere necessaria la re-aggiunta del farmaco per mantenere una concentrazione efficace. Infine, sebbene questo protocollo sia stato sviluppato con l'intenzione di visualizzare la compattazione di nicchia, un fenomeno specifico delle gonadi maschili, in teoria questo protocollo potrebbe anche essere implementato per l'immagine dal vivo dell'ovaio in via di sviluppo semplicemente sezionando e immaginando gonadi che mancano di una nicchia e msSGP.
Le limitazioni associate a questa tecnica riguardano la durata del tempo di coltura e la natura ex vivo della coltura. Come nel caso delle camere uovo Drosophila 30 allo stadio intermedio, le gonadi coltivate iniziano a morire dopo circa 5 ore di live-imaging ex vivo , evidenziato dalla perdita di integrità dei tessuti (i nuclei diventano picnotici e le membrane cellulari si avvizziscono). Quindi, se si desiderassero esplorare eventi in fase successiva nella gonade maschile, sarebbe necessario sezionare le gonadi dal 1 ° instar o dalle larve più vecchie apportando modifiche al protocollo presentato qui, e quindi immaginarle in condizioni simili a quelle presentate qui. Tuttavia, non escludiamo la possibilità di live-imaging ex vivo oltre le cinque ore se si sviluppano migliori condizioni di coltura, anche se potrebbe esserci un limite se sono necessari segnali meccanici dall'interno dell'embrione per lo sviluppo delle gonadi. Forse lo svantaggio più grave della tecnica è dovuto alla sua intrinseca natura ex vivo . Se coltivate ex vivo, le cellule possono avere un potenziale innaturale che non è rappresentativo della biologia in vivo 31. Inoltre, le sottigliezze degli ambienti di coltivazione, tra cui il contenuto dei media e la rigidità della matrice, possono avere un'influenza drastica sul comportamento cellulare32. Con questa sensibilità in mente, è fondamentale garantire che le condizioni di coltivazione riflettano accuratamente la biologia in vivo . Abbiamo adottato misure per attestare che lo sviluppo e la segnalazione di nicchia in vivo sono ricapitolati ex vivo17. In breve, abbiamo accertato che il destino delle cellule di nicchia viene mantenuto e il numero di cellule di nicchia è invariato utilizzando i marcatori Fasciclin-III ed E-caderina. Inoltre, la segnalazione STAT è presente e le cellule staminali germinali si dividono ortogonalmente, suggerendo che la funzionalità di nicchia viene mantenuta. Tuttavia, non abbiamo verificato che la biologia in vivo pertinente rimanga intatta in altri tessuti non di nicchia all'interno della gonade. Le future indagini ex vivo su questi altri tessuti dovrebbero includere un'analisi completa per garantire che ciò avvenga effettivamente.
Una direzione futura che si potrebbe prendere con questo protocollo includerebbe l'incorporazione di una barriera all'interno del piatto di imaging, in modo tale che una sessione di dissezione possa contenere sia un gruppo di controllo che un gruppo di trattamento farmacologico. Questo miglioramento consentirebbe di ridurre al minimo l'errore tra le repliche tecniche, migliorando così il rigore scientifico.
Non ci sono altre vere alternative a questo protocollo, in quanto è l'unico metodo disponibile per esaminare gli eventi vivi di questo organo durante lo sviluppo embrionale tardivo. Come tale, le domande precedentemente senza risposta sulla morfogenesi delle gonadi sono ora accessibili con questo progresso. Queste domande includono la complessità delle divisioni cellulari, i cambiamenti citoscheletrici e gli eventi di intercalazione cellulare che governano la formazione di nicchia delle cellule staminali e la gonadogenesi. Nessuno di questi eventi è rilevabile nelle immagini fisse di questi processi acquisiti utilizzando una tecnica fix-and-stain. Nel complesso, questo metodo sblocca la possibilità di studiare le dinamiche nella Drosophila gonad embrionale tardiva, e una tale svolta ha forti implicazioni per il progresso di una miriade di campi biologici, tra cui la biologia di nicchia delle cellule staminali, la biologia dei piRNA e l'organogenesi.

Il testicolo della Drosophila melanogaster è servito come paradigma per la nostra comprensione di molti processi cellulari dinamici. Gli studi di questo modello hanno fatto luce sulla regolazione della divisione delle cellule staminali 1,2,3, sullo sviluppo delle cellule germinali 4,5, sulla biologia del piRNA 6,7,8 e sugli eventi di segnalazione delle cellule staminali di nicchia 9,10,11,12,13. Questo modello è vantaggioso perché è geneticamente trattabile14,15 ed è uno dei pochi in cui possiamo vivere le cellule staminali nel loro ambiente naturale 3,16,17,18. Tuttavia, l'imaging dal vivo di questo modello è stato limitato al tessuto adulto e ai primi stadi embrionali, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza della dinamica gonadica nell'embrione tardivo, lo stadio preciso in cui la nicchia si sta formando per la prima volta e inizia a funzionare.
La gonade embrionale in stadio avanzato è una sfera, costituita da cellule di nicchia somatiche nella parte anteriore e cellule germinali incistate da cellule gonadiche somatiche in più regioni posteriori19. Questo organo può essere ripreso vivo fino allo stadio embrionale precoce 17 17,20,21. Ulteriori immagini sono prevenute a causa dell'inizio di contrazioni muscolari su larga scala. Queste contrazioni sono così gravi che spingono la gonade fuori dal fotogramma di imaging e tale movimento non può essere corretto con un software di imaging. Il nostro laboratorio è interessato a svelare i meccanismi della formazione di nicchia, che si verifica durante questo periodo sfuggente per l'imaging dal vivo. Pertanto, abbiamo generato un approccio ex vivo per l'immagine dal vivo della gonade a partire dallo stadio embrionale 16, facilitando lo studio della dinamica cellulare durante questo periodo cruciale di sviluppo delle gonadi. Precedenti lavori del nostro laboratorio mostrano che questa imaging ex vivo ricapitola fedelmente lo sviluppo delle gonadi in vivo 17. Questa tecnica è la prima e unica del suo genere per la gonade embrionale drosophila.
Qui presentiamo il protocollo di dissezione richiesto per l'imaging live ex vivo della gonade durante le fasi embrionali tardive. Questo protocollo può essere combinato con trattamenti farmacologici o manipolazione transgenica di specifici lignaggi cellulari all'interno della gonade. Usando questa tecnica, abbiamo ripreso con successo le fasi della formazione di nicchia delle cellule staminali17. Questo approccio di imaging è quindi strumentale per il campo della biologia delle cellule staminali, in quanto consentirà la visualizzazione delle fasi iniziali della formazione di nicchia in tempo reale all'interno del suo ambiente naturale15,17. Mentre questo metodo è utile per il campo della biologia delle cellule staminali, è inoltre applicabile per visualizzare eventuali processi dinamici che si verificano nella gonade durante questo punto temporale di sviluppo, compresi i riarrangiamenti cellulari22, l'adesione cellulare 2,12,23 e la migrazione cellulare23. Questo protocollo di dissezione migliorerà così la nostra comprensione di molti processi biologici cellulari fondamentali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar&#160;Tungsten wire</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA10408G6</td>
			<td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: His2Av::mRFP1</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>FBtp0056035</td>
			<td>Schuh, Lehner, &#38; Heidmann, Current Biology, 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato</td>
			<td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td>
			<td></td>
			<td>Lin, Luo, &#38; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#39;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin</td>
			<td></td>
			<td>FBtp0083398</td>
			<td>Sano et al., PLoS One, 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l0516</td>
			<td>Store aliquots at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nytex basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&#8217;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

La gonade embrionale maschile Drosophila melanogaster è un modello vantaggioso per studiare vari aspetti della biologia dello sviluppo tra cui, ma non solo, lo sviluppo delle cellule germinali, la biologia del piRNA e la formazione di nicchia. Qui, presentiamo una tecnica di dissezione per l'immagine dal vivo della gonade ex vivo durante un periodo in cui l'imaging dal vivo dal vivo è altamente inefficace. Questo protocollo delinea come trasferire gli embrioni in un piatto di imaging, scegliere embrioni maschili opportunamente messi in scena e sezionare la gonade dal tessuto circostante pur mantenendo la sua integrità strutturale. Dopo la dissezione, le gonadi possono essere fotografate utilizzando un microscopio confocale per visualizzare i processi cellulari dinamici. La procedura di dissezione richiede tempi e destrezza precisi, ma forniamo informazioni su come prevenire errori comuni e su come superare queste sfide. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo di dissezione per la gonade embrionale Drosophila e consentirà l'imaging dal vivo durante una finestra di tempo altrimenti inaccessibile. Questa tecnica può essere combinata con manipolazioni transgeniche farmacologiche o specifiche del tipo cellulare per studiare eventuali processi dinamici che si verificano all'interno o tra le cellule nel loro ambiente gonadico naturale.

Illustriamo la preparazione del piatto di imaging nella Figura 1, come descritto in "Preparazione del giorno della dissezione". Questi metodi dovrebbero alla fine portare a embrioni ben idratati aderenti a una striscia di copertura, che viene temporaneamente fissata al fondo del piatto e immersa nella soluzione di Ringer (Figura 1F). Un coltello con punta di diamante consente di tagliare in modo pulito un coperchio di 22 x 22 mm in tre o quattro strisce più piccole (Figura 1A). Durante la manipolazione di queste strisce con una pinza, utilizziamo una pipetta per trasferire abbastanza colla eptanica per rivestire queste strisce, il che conferisce loro una superficie adesiva e strutturata (Figura 1B). Le strisce rivestite sono facilmente ripotegabili in una scatola di copertura vuota per mantenere pulite le superfici adesive fino a 2 ore (Figura 1C). Una volta realizzate queste strisce rivestite, l'obiettivo è quello di far aderire gli embrioni alla striscia in un aggregato, vicino al bordo lungo della striscia (Figura 1E). È necessario prima trasferire alcuni embrioni dal vetro dell'orologio su un vetrino pulito e asciugarli (Figura 1D). Quindi, utilizzare rapidamente una pinza per toccare delicatamente la striscia rivestita agli embrioni in modo che aderiscano (Figura 1E). Quindi premiamo immediatamente la striscia sul fondo del piatto di dissezione con gli embrioni rivolti verso l'alto e copriamo gli embrioni con la soluzione di Ringer (Figura 1F). Se questo obiettivo viene raggiunto, la visualizzazione degli embrioni sotto uno stereomicroscopio tradizionale a campo luminoso rivelerà embrioni completamente idratati e sani all'interno delle loro membrane vitelline (Figura 1G). Se, invece, il processo di trasferimento di questi embrioni sulla striscia e di copertura con la soluzione richiede più di circa 30 s, gli embrioni si disidratano e diventano flaccidi (Figura 1G'). Gli embrioni flaccidi non sono sani e sono incredibilmente difficili da sezionare, quindi lavorare in modo efficiente durante questo processo è vitale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61872/61872fig01.jpg"> Figura 1: Montaggio e idratazione degli embrioni prima della dissezione. (A–F) Passaggi per aderire gli embrioni a una striscia di copertura rivestita di colla e fissare la striscia a un piatto di imaging. (A) Coverslip segnato una volta dal coltello a punta di diamante (coltello indicato dalla punta di freccia) per creare una striscia. (B) Applicazione di colla eptanica su una striscia di copertura mozzata, tenuta con un paio di pinze. (C) Quattro strisce rivestite di colla che si asciugano in una scatola di copertura. (D–E) Le frecce indicano gli embrioni. (D) Embrioni decorionati che sono stati raccolti in eptano ed espulsi sul bordo di un vetrino per microscopio. L'eccesso di eptano è stato rimosso con un kimwipe. E) Striscia rivestita di colla con embrioni attaccati. (F) La configurazione finale del piatto immediatamente prima della dissezione. Si noti lo strato superficiale della soluzione di Ringer (punta di freccia) e il posizionamento della striscia (freccia) sopra il cerchio di dissezione interno. (G–G') Gli embrioni hanno aderito alla striscia nel piatto. G) Embrioni turgidi adeguatamente idratati. (G') Embrioni che sono diventati disidratati a causa dell'esposizione prolungata all'aria, evidente dalle membrane vitelline collassate. Gli asterischi indicano embrioni flaccidi. Le barre della scala sono di 0,5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61872/61872fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La visualizzazione di un embrione sotto un microscopio stereo-fluorescente consente una chiara visualizzazione dell'intestino, che si auto-fluoresce nel canale GFP. La morfologia intestinale funge da proxy per l'età embrionale quando si scelgono gli embrioni da sezionare. Poiché gli embrioni aderenti alla striscia di copertura variano leggermente in età, presenteranno una vasta gamma di morfologie intestinali (Figura 2A). Per la morfogenesi di nicchia delle gonadi a immagine viva, sezioniamo gli embrioni di stadio 16 precoce. Questi embrioni presentano quattro sezioni intestinali regionalizzate che sono impilate in una fila uniforme (Figura 2B', linee tratteggiate). Gli embrioni più giovani presentano un intestino non regionalizzato simile a un sacco (Figura 2C) e non hanno ancora una matrice extracellulare (ECM) sufficiente attorno alle loro gonadi per consentire una coltura efficiente dell'organo intatto. Gli embrioni più anziani che hanno già iniziato la compattazione di nicchia presentano quattro regioni intestinali che non sono impilate uniformemente e sono invece spostate l'una rispetto all'altra (Figura 2D', linee tratteggiate). Questi embrioni hanno una cuticola più spessa, il che rende il processo di dissezione più impegnativo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61872/61872fig02.jpg"> Figura 2: Selezione di embrioni opportunamente invecchiati per la dissezione delle gonadi. Gli embrioni hanno aderito a una copertura rivestita di colla prima della dissezione. Gli embrioni esprimono six4-eGFP::moesin (verde), che segna le gonadi e le cellule adipose del corpo. Si noti che l'intestino auto-fluoresce in verde. Le frecce indicano gonadi maschili (distinte dalla presenza di msSGP a fluorescenza brillante) che sono visibili in ogni pannello. Le barre della scala indicano 0,25 mm. (A) Embrioni di vari stadi. (B–D) Embrioni di stadi distinti al centro dell'immagine, orientati con anteriore a sinistra e dorsale verso l'alto. (B) Un embrione di stadio 16 precoce che viene invecchiato in modo appropriato per la dissezione. (B.) Le quattro regioni intestinali impilate sono indicate con linee bianche tratteggiate. (C) Un embrione di stadio 15 che è troppo giovane per essere sezionato (embrione inferiore). Si noti che il sacco intestinale fluorescente appena anteriore alla gonade non ha ancora regioni discrete. (D) Un embrione di stadio 16 tardivo che è difficile da sezionare a causa dello sviluppo della cuticola. Si noti che le quattro regioni intestinali hanno iniziato a ruotare l'una rispetto all'altra in preparazione per il looping intestinale. (D') Le quattro regioni intestinali sono delineate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61872/61872fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
È importante sezionare embrioni che esprimono un marcatore fluorescente indelebile nella gonade, e questo marcatore deve essere visibile sotto un microscopio stereo-fluorescente. Qui, abbiamo scelto di utilizzare six4-eGFP::moesin20 per contrassegnare la gonade (Figura 2 e Figura 3, frecce) per la visualizzazione durante la dissezione.
Illustriamo il processo di dissezione delle gonadi nella Figura 3. La dissezione di embrioni opportunamente messi in scena sul piatto rivestito di polilisina consente un isolamento pulito delle gonadi da questi embrioni (Figura 3D). Gli embrioni devitellinizzati aderiranno al piatto e possono essere disposti in una fila conveniente prima della dissezione (Figura 3A). La devitellinizzazione e il trasferimento dell'embrione alla polilisina è un processo impreciso tale che il tessuto può essere estruso dai confini del corpo dell'embrione (vedi pezzo di tessuto tra l'embrione 1 e l'embrione 2 e l'embrione maciullato 4; Figura 3A). Questa imprecisione non ha importanza, finché le gonadi rimangono indenni. Un microscopio stereofluorescenza standard consente l'identificazione della gonade all'interno del corpo embrionale devitellinizzato (Figura 3B, freccia). Le prime manipolazioni con un ago di dissezione affilato dovrebbero separare le gonadi dalla carcassa dell'embrione, anche se alcuni tessuti autofluorescenti rimarranno aderenti (Figura 3C). Ulteriori manipolazioni provocano gonadi isolate che aderiscono direttamente al piatto rivestito (Figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61872/61872fig03.jpg"> Figura 3: Il processo di dissezione. (A–D) Embrioni che esprimono six4-eGFP::moesin (verde) in fasi sequenziali del protocollo di dissezione. (A) Quattro embrioni devitellinizzati che sono stati trasferiti nella regione di dissezione rivestita di polilisina del piatto. Si noti come gli embrioni sono allineati in una fila ordinata per facilitare le successive dissezioni verso il basso nel piatto. Il piccolo pezzo di tessuto tra gli embrioni 1 e 2 fa parte dell'intestino dell'embrione 2, estruso durante la devitellinizzazione della mano. (B) Maggiore ingrandimento dell'embrione da (A), indicato dall'asterisco. C) la carcassa rimanente di un embrione che è stato sfilettato lungo la linea mediana. La punta della freccia indica una gonade occlusa, ancora pesantemente incorporata nei tessuti embrionali. (D) Una gonade completamente sezionata. Si noti che solo un minimo di tessuto estraneo (punta di freccia) rimane vicino alla gonade. Le frecce puntano alle gonadi maschili. Le barre della scala sono di 0,25 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61872/61872fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Una volta sezionate le gonadi, è possibile sostituire la soluzione della suoneria con mezzi di imaging e gonadi coltivate a immagine direttamente nello stesso piatto utilizzato per la dissezione. Usiamo un microscopio confocale a disco rotante. La visualizzazione a campo luminoso di una gonade isolata su un microscopio confocale rivela un'ombra scura che circonda la periferia della gonade (Figura 4A-B, frecce), che è l'ECM che mantiene l'integrità della gonade durante l'imaging. Presentiamo un esempio di una gonade sana e ben coltivata che esprime F-actina marcata con GFP nelle cellule gonadiche somatiche20 e un marcatore istone marcato RFP per visualizzare tutti i nuclei28 (Figura 4C-C'). Poiché tutte le cellule di questo embrione esprimono il marcatore istonico RFP, sia le cellule gonadiche che le cellule di altri tessuti aderenti sono osservate nella visualizzazione dell'emissione rossa. Discerniamo i confini della gonade usando il marcatore GFP specifico per le gonadi (Figura 4C', contorno). È chiaro che questa gonade coltivata è sana perché il confine della gonade è liscio e rotondo (Figura 4C', contorno), e perché le cellule gonadiche hanno livelli uniformi di fluorescenza dell'istone RFP in tutti i nuclei (Figura 4C', freccia). Se, invece, le gonadi non sono sufficientemente idratate durante l'imaging, i nuclei e la fluorescenza della moesina six4-eGFP::possono diventare puntinati (Figura 4D, freccia) man mano che il tessuto gondico si avvizzisce. Inoltre, se la gonade ECM viene danneggiata eccessivamente durante la dissezione, il confine della gonade è compromesso, il che è evidente dalla presenza di cellule specifiche della gonade (Figura 4E, asterischi) al di fuori dei confini della gonade (Figura 4E, freccia).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61872/61872fig04.jpg"> Figura 4: Individuazione di gonadi sane durante l'imaging dal vivo. (A) Viste a campo luminoso a basso e (B) alto ingrandimento di due gonadi sezionate aderivano al coperchio. (C–C') Un fotogramma di film dall'imaging ex vivo della compattazione di nicchia in una gonade sana. Le cellule gonadiche somatiche esprimono sei4-eGFP::moesina (verde) e tutte le cellule esprimono His2Av-mRFP (rosso). (C') Confine gonadi segnato da una linea tratteggiata bianca. His2Av-mRFP visibile al di fuori del confine della gonade è probabilmente un corpo grasso che è ancora attaccato alla gonade sezionata. La freccia indica un nucleo di cellule germinali con segnale His2Av-mRFP uniforme, indicando che la gonade è sana. (D–E) Esiti negativi rappresentativi del protocollo di dissezione ex vivo . (D) Un fotogramma di una sessione di imaging in cui la gonade si è disidratata a causa dell'evaporazione dei media. Si notino i nuclei picnotici come His2Av-mRFP condensa (freccia) e le macchie discontinue di six4-eGFP::moesin lungo il confine delle gonadi. (E) Quadro di imaging ex vivo in cui la matrice extracellulare è stata compromessa durante la dissezione. Si noti che alcune cellule germinali (asterischi) escono dal confine della gonade (freccia). Le cellule germinali sono etichettate con nos-lifeact::tdtomato (magenta) e le cellule gonadiche somatiche con six4-eGFP::moesin (verde). Le barre della scala mostrano 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61872/61872fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le gonadi possono essere coltivate per circa 5 ore utilizzando questo metodo di imaging ex vivo , consentendo l'acquisizione di immagini degli eventi di morfogenesi dinamica che si verificano nello sviluppo tardivo delle gonadi embrionali. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per visualizzare la compattazione della nicchia di cellule staminaliin formazione 17 (Figura 5). Prima della compattazione, la nicchia è un aggregato sciolto di cellule somatiche alla gonade anteriore (Figura 5A, verde), circondato da cellule germinali etichettate con nos-lifeact::tdtomato29 (vedi Tabella dei materiali), il cui primo livello saranno cellule staminali germinali (Figura 5A, magenta). Questo aggregato di nicchia si presenta inizialmente con un confine irregolare (Figura 5A', linea tratteggiata). Nel corso dell'imaging, osserviamo singole cellule di nicchia riorganizzare le loro posizioni mentre l'aggregato di nicchia acquisisce bordi più lisci. Questi riarrangiamenti cellulari comportano anche una diminuzione dell'area di nicchia (Figura 5C). Le nostre osservazioni dei riarrangiamenti cellulari e delle divisioni di cellule germinali vicine che si verificano in concomitanza con questa fase di sviluppo hanno informato la nostra comprensione dei meccanismi alla base della compattazione di nicchia17. Questo protocollo offre quindi la possibilità di visualizzare riarrangiamenti cellulari, cambiamenti di forma, divisioni e altri eventi cellulari con la risoluzione necessaria per analizzare gli eventi morfogenetici nelle gonadi in fase avanzata.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61872/61872fig05.jpg"> Figura 5: Una gonade coltivata ex vivo sottoposta a compattazione di nicchia. Immagini fisse di una serie di immagini acquisite immediatamente dopo la dissezione di gonadi da embrioni di stadio 16. (A–C) Le cellule germinali (magenta) sono etichettate da nos-lifeact::tdtomato e le cellule gonadiche somatiche (verdi) sono etichettate da six4-eGFP::moesin. La nicchia (linea bianca tratteggiata) è delineata in A'-C'. Le barre della scala mostrano 10 μm. Anteriore è a sinistra e posteriore è a destra. (A) Al primo timepoint (t = 0 min) della serie di imaging, le cellule di nicchia hanno terminato l'assemblaggio nella gonade anteriore e si trovano in una fase iniziale di compattazione. (B) A metà della serie di immagini e del processo di compattazione (t = 1 h 48 min), la nicchia ha iniziato a circolarizzare, ma il suo bordo rimane irregolare. (C) Verso la fine della serie di immagini (t = 4 h 21 min), la nicchia ha un confine circolare altamente levigato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61872/61872fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.1K Views.  University of Pennsylvania. Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l&#39;analisi trascrizionale

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...