The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Etica dichiarazione: Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo si riferiscono a lavori esclusivamente con Drosophila melanogaster e non sono soggetti alle leggi sul benessere degli animali in Germania. 1 Preparazione di media, strumenti, e Flies <ol><li> Preparare modificato disponibile in commercio in polvere mezzo di crescita di M3 senza bicarbonato di potassio 17. ATTENZIONE: Irritante per gli occhi e la pelle. Supplemento del mezzo con siero fetale bovino al 10%, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Utilizzare siero testato insetto-cultura-inattivato al calore e fetale bovino per i migliori risultati. Filtrare il terreno completo (di seguito come mezzo) con un 0,2 micron unità filtrante per bottiglia e conservare in aliquote a -20 ° C. Prima dell&#39;uso, il filtro (0,2 micron punta filtro siringa) il mezzo di nuovo per rimuovere precipitati. </li><li> Preparare soluzioni inibitore azionari per i saggi farmacologici. Dissolve le sostanze chimiche nel solvente e conservare adeguata in aliquote. Ad esempio, preparare una soluzione madre di 28.69 mM acido anacardic (ATTENZIONE: Irritante per gli occhi e la pelle) in dimetilsolfossido. </li><li> Preparare gli strumenti per l&#39;interruzione dei testicoli pupa sezionati e dissezione dei singoli cisti. Usare due aghi appuntiti e rigidi, piuttosto che un paio di pinze. La forza capillare che si sviluppa tra i due rami di un paio di pinze rende la dissezione dei singoli cisti in piccole quantità di mezzo molto difficile. Ad esempio, utilizzare la punta di uno spillo insetto acciaio inox inserita in un supporto ad anello inoculazione. </li><li> Al fine di ottenere pupe opportunamente invecchiato, semi di circa 10 grandi flaconi di coltura (tubi con diametro 4 cm), con un numero sufficiente di mosche adulte (circa 40-60 mosche). Per analizzare l&#39;interruttore HP, utilizzare le mosche che esprimono H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP nel loro modello endogeno 12,16,22. Incubare le fiale in condizioni standard a 25; ° C per circa 4-5 giorni fino terze larve instar strisciare su e iniziare a impupamento sulle pareti dei flaconcini 25. </li></ol> 2 Marcatura o Raccolta Bianco Pre-pupe ottenere 24-hr-old Pupae per dissezione <ol><li> Per verificare l&#39;influenza di alcune sostanze chimiche sullo switch HP, sezionare testicoli pupa a circa 24 ore APF 12. Per ottenere pupe in scena, prendere i flaconi di coltura fly preparati con pupating larve (vedere paragrafo 1.4) e identificare il maggior numero bianco pre-pupe possibile. Pre-pupe durante il primo passo in impupamento appaiono come immobile, non l&#39;alimentazione, larve piuttosto accorciato con spiracoli estroflessi e puparium di colore bianco. Il puparium diventa tan-marrone all&#39;interno di 30 a 60 minuti, che indica la prossima fase di sviluppo pupa 26. </li><li> Segnare le posizioni del pre-pupe con un pennarello indelebile sulla parte esterna delle fiale. Incubare le fiale a 25 ° C per circa 24 ore. <ol><li> Alternativamente,accompagnamento pre-pupe dal lato delle fiale con un pennellino inumidito con tampone PBS. Poi il trasferimento pre-pupe al lato di un tubo di reazione 50 ml fresco e incubare a 25 ° C per circa 24 ore. </li></ol></li></ol> 3. dissezione di pupa testicoli a circa 24 ore dopo puparium Formazione <ol><li> Distribuire alcune gocce (circa 80 ml ​​ciascuna) di media su un 10 centimetri di coltura cellulare di plastica o una scatola Petri. Utilizzando una vasta paio di pinze o un pennello inumidito con il mezzo, prendere le pupe in fase di APF 24 ore dai flaconcini incubate (vedere paragrafo 2). Trasferire una pupa ad ogni goccia di terreno sul piatto. </li><li> Per la dissezione, utilizzare uno stereo-microscopio equipaggiato con un illuminatore a fibre ottiche. Non riscaldare i testicoli sopra RT durante la dissezione in quanto ciò potrebbe impedire un corretto sviluppo della cultura. <ol><li> Sezionare pupe con due coppie di n ° 5 pinze. Con una coppia, afferrare la pupa al suo più posterioreparte (i spiracoli posteriori) e tenerlo in posizione. </li><li> Prendete le spiracoli anteriori con l&#39;altra coppia di pinze e aprire l&#39;opercolo pupa alla sua estremità anteriore. Staccare il caso pupa fino a quando almeno una parte del torace è esposto. </li><li> Continuare a tenere la pupa in posizione per la sua fine più posteriore. Per rilasciare la pressione interna della pupa, inserire entrambe le braccia di un paio di pinze nella regione della testa della pupa. </li><li> Strappare la pupa aperta aprendo la pinza e muovendo la pinza nella direzione anteriore. Assicurarsi che l&#39;apertura generata con questo movimento è il più grande possibile nel primo tentativo. Evitare di danneggiare la pupa alla sua estremità posteriore, prima che la pressione è stata rilasciata in quanto ciò potrebbe comportare testicoli spinti direttamente attraverso la piccola apertura e più spesso di essere interrotti. </li><li> Si osservi che una volta che la pupa è aperto, la pressione interna liberato della pupa preme fuori agglomerati di cellule di grasso e tessuto attraverso il laapertura rge nella regione della testa. Controllare se i testicoli pupe sono già stati spinti fuori dalla pupa con questo materiale; ciò si verifica in alcuni casi. I testicoli non sono collegati a qualsiasi altro tessuto a 24 ore APF e, pertanto, potrebbero essere espulsi facilmente dalla pupa 23. </li><li> Evitare di schiacciare la pupa con le pinze in quanto questo potrebbe danneggiare i testicoli se rimangono in pupa. Aumentare la dimensione dell&#39;apertura utilizzando un paio di pinze. </li><li> Quindi tenere la pupa alla sua estremità più posteriore. Chiudere l&#39;altra coppia di pinze e delicatamente striscia fuori il contenuto della pupa da posteriore a anteriore a rilasciare i testicoli dalla pupa. </li></ol></li><li> Raccogliere i testicoli tirandoli in una punta di pipetta 200 microlitri pre-tagliati. Provate a trasferire solo una piccola quantità di mezzo per ridurre il numero delle cellule del corpo grasso trasferiti con i testicoli. Posizionare i testicoli in media in un piatto di coltura fresco. Lavare i testicoli più volte con mezzo fino a che solo poche cellule di grasso corporeos rimangono. </li><li> Per l&#39;imaging dal vivo, trasferire testicoli a un piatto di cultura con fondo di vetro con i media e utilizzare un microscopio invertito di imaging. Per i saggi farmacologici, continuare con il passaggio 5. </li></ol> 4 dissezione Maschile cisti Germ-line e dal vivo Imaging <ol><li> Trasferire uno o più testicolo pupa ad un piatto di cultura con fondo di vetro. </li><li> Utilizzare un impianto stereo-microscopio con illuminazione a fibre ottiche e due aghi di acciaio inossidabile (vedi sezione 1.3) per la dissezione dei maschi cisti germinali. <ol><li> Con un ago, cercare con attenzione da definire un testicolo al suo anteriore o estremità posteriore. Tenerlo in posizione. Inserire l&#39;altro ago nel testicolo e disturbare la guaina testicolo spostando l&#39;ago lateralmente. Molte delle cisti sarà rilasciato dal testicolo da questo movimento. </li><li> Continuare a tenere il testicolo in posizione con un ago. Striscia delicatamente i restanti cisti del testicolo con l&#39;altro ago. </li><li> Cisti aggregati separati sia da gently lo spostamento di un ago lateralmente attraverso il cluster di cisti o trasferendo le cisti ad un piatto di coltura fresco con supporto utilizzando un puntale 200 microlitri. </li></ol></li><li> Spostare il piatto cultura di un microscopio invertito di imaging per l&#39;imaging dal vivo di singole cisti. Disperse nuovamente cisti con un ago, se necessario. <ol><li> Identificare la fase delle cisti mediante contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. </li><li> Concentrarsi su una cisti del palco desiderato. Confermare la messa a fuoco e la posizione della cisti frequentemente durante gli esperimenti di imaging più lunghi, come le cisti non aderiscono al fondo del piatto cultura e quindi tendono a galleggiare fuori fuoco. NOTA: Rivestimento il piatto con poli-L-lisina per immobilizzazione è dannosa per lo sviluppo dei primi cisti germinali. Al contrario, le singole cisti possono essere isolati. Con una certa pratica, è possibile individuare una particolare cisti spingendo molto delicatamente con l&#39;ago. Ciò consentirà il trasferimento di singole cisti al culto separatopiatti ure con una pipetta Pasteur di vetro con una punta protratta che si inserisce nel campo visivo del microscopio. Le cisti isolate quindi possono essere facilmente trasferiti nelle piastre di coltura anche dopo incubazione a lungo termine. </li></ol></li></ol> 5. farmacologica Assay con Intact pupa Testicoli <ol><li> Riempire ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti con 500 ml di mezzo per un esperimento di 12 repliche. Trasferimento di una pupa testicolo in ogni pozzetto, usando un puntale 200 microlitri pre-tagliati. <ol><li> Verificare la presenza di protamine nei testicoli isolate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. I testicoli dovrebbero essere liberi di segnale ProtamineB-eGFP, che indica che l&#39;interruttore HP non ha avuto luogo in una delle cisti. Sostituire testicoli che mostrano già cisti ProtamineB-eGFP-positivi. </li><li> Per i primi 12 pozzetti, aggiungere 500 ml di terreno contenente composto inibitore diluito (acido anacardic) per raggiungere la concentrazione finale desiderata(150 mM) in 1 ml di terreno per pozzetto. Utilizzare i restanti pozzi come controlli non trattati; aggiungere 500 ml di terreno con la stessa quantità di solvente utilizzato come con i composti inibitori. Nota: Se si utilizzano molti composti e solventi diversi, potrebbe essere più efficace utilizzare solo come mezzo di controllo e di testare l&#39;influenza di concentrazioni crescenti di solventi in esperimenti separati. </li></ol></li><li> Incubare la piastra a 25 ° C per 24 ore al buio. </li><li> Verificare nuovamente la presenza di protamine nei testicoli incubati come descritto sopra. I testicoli di controllo dovrebbero ora mostrare cisti uno o più ProtamineB-eGFP-positivi, che indica il passaggio attraverso lo switch HP. </li><li> Usando una pipetta con una punta di 200 microlitri, trasferire i testicoli per vetrini poli-L-lisina rivestite, fare i preparativi da squash e macchia con anticorpi fluorescenti appropriate come descritto altrove 12,27,28. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi in competizione.

Il protocollo presentato descrive due diverse applicazioni basate sia sulla capacità di sezionare testicoli Drosophila e cisti singola linea germinale in un determinato stadio di sviluppo e sulla ex vivo sviluppo di queste cellule e tessuti in un piatto di cultura. Una applicazione è la manipolazione farmacologica dei processi vitali durante lo sviluppo dello sperma. È importante sottolineare che, questo permette l&#39;accesso alla spermatogenesi post-meiotico che non è facilmente ottenuto con analisi funzionali basate sulla genetica mosca. L&#39;altra applicazione è l&#39;osservazione microscopica di vivere e sviluppare le cellule germinali e testicoli. Soprattutto questa applicazione beneficia la capacità delle cellule di Drosophila e organi nella cultura di sopravvivere e sviluppare a temperatura ambiente e sotto atmosfera normale. Quindi, un microscopio invertito di imaging dotato di uno stadio riscaldato (riscaldamento alla temperatura di allevamento standard di 25 ° C) è sufficiente per ottenere risultati significativi in ​​esperimenti di live-imaging. Ulteriormenteesistono più, molti ceppi mosca transgenici che esprimono proteine ​​proteine ​​fluorescenti-tag per l&#39;imaging dal vivo o possono essere facilmente stabilite. Per ottenere testicoli pupa o cisti linea germinale di una fase di sviluppo specifico, è fondamentale che si ha familiarità con i tempi di sviluppo di Drosophila. La tempistica esatta per ogni fase può variare tra laboratori, condizioni di coltura, e volare ceppi e deve essere stabilita empiricamente. Come indicato in precedenza, questo è particolarmente importante per i saggi farmacologici che, per esempio, prendono di mira l&#39;interruttore HP. Per tali esperimenti, si consiglia di verificare sempre di spermatidi con un segnale ProtamineB-eGFP prima della prova reale inibitore perché il momento può variare leggermente anche all&#39;interno di una popolazione. A seguito del protocollo di cui sopra dovrebbe consentire lo sperimentatore di sezionare testicoli da stadi precoci pupa come organi intatti gratuiti di tessuto grasso corporeo in allegato. Questi testicoli e, ancor più, isolati gecisti rm-linea sono molto fragili. Quindi, è fondamentale sviluppare la manualità e l&#39;esperienza necessarie per la gestione e il trasferimento di testicoli e cisti usando pinze, aghi, e pipette. Soprattutto studi mirati allo sviluppo di germi-cellula post-meiotico meiotica e l&#39;inizio trarrebbero beneficio da questo. Mentre è relativamente facile da sezionare cisti di spermatidi in ritardo con lunghi flagelli da testicoli adulti, è difficile ottenere fasi precedenti. Dissezione queste cisti dai primi testicoli pupa che seguono questo protocollo è molto più efficiente. Tenete a mente che in un ceppo mosca al solito, solo circa il 50% delle pupe sarà maschio. Pertanto, si preparano a sezionare almeno il doppio di pupe come il numero di testicoli richiesti. In alternativa, è possibile identificare maschio larve L3 utilizzando uno stereo-microscopio, come i testicoli possono essere identificati organi rotondi come traslucide incorporati nei tessuti del corpo grasso laterali della larva intatto 23,34, e di raccoglierle in flaconi di coltura fresco che lattinaessere utilizzato per raccogliere pre-pupe per la stadiazione e dissezioni. È anche possibile identificare maschio pre-pupe 35. Abbiamo notato che sia le cisti isolate linea germinale e testicoli pupa intatti nella cultura sono sensibili alla luce, come è stato anche segnalato in precedenza 18. Questa sensibilità alla luce potrebbe anche tenere premuto per alcuni composti chimici utilizzati nei test farmacologici. Pertanto, è meglio tenere i piatti della cultura di un test al buio durante l&#39;incubazione. Allo stesso modo, quando si pianifica esperimenti di imaging time-lapse con testicoli in via di sviluppo e, in particolare, le cisti isolate, tenere presente che i tempi di esposizione troppo lungo e / o troppo alti tassi di campionamento possono inibire ex vivo sviluppo. La frequenza di campionamento appropriata deve essere determinata sperimentalmente. Infezioni batteriche e / o fungine e over-crescita nei piatti della cultura pone un problema grave. Piatti della cultura infettati con troppi batteri non supportano ex vivo sviluppo dei testicoli e cisti. Pertanto, il mezzo di coltura descritto contiene penicillina e streptomicina (vedi punto 1.1), ma durante l&#39;incubazione a lungo termine, questi antibiotici possono essere degradati e la loro attività potrebbero diminuire. Questo potrebbe essere uno dei motivi per il tempo limitato di sopravvivenza (max. 72 ore) di cisti in coltura osservate quando si utilizza il protocollo di cui sopra. Eppure, questo lasso di tempo non può essere esteso da regolare sostituzione del terreno di coltura nei piatti. Concludiamo che altri fattori potrebbero influenzare la sopravvivenza della cultura, come la mancanza di segnali di crescita provenienti da altri tessuti del tratto genitale. D&#39;altra parte, lo sviluppo post-meiotica è più veloce in Drosophila che nei mammiferi. In Drosophila, spermiogenesi richiede circa 90 ore, e l&#39;interruttore HP si svolge tra 50 e 60 ore dopo la meiosi 9,12. Così, alla solita ora sopravvivenza di circa 48 ore si ottiene con questo protocollo si adatta bene a seguire i processi di sviluppo cardine in spermatogenesis, come ad esempio le divisioni meiotica o lo switch HP. Anche se la contaminazione batterica o fungina può essere evitato utilizzando strumenti puliti e media, il protocollo presentato non fa uso di condizioni di lavoro rigorosamente sterili perché le mosche e volare testicoli già contengono batteri quando sollevato in condizioni standard. Tuttavia, alcune applicazioni di questa tecnica di coltura possono beneficiare di mosche sezionati o addirittura allevati in condizioni asettiche (per i protocolli, vedere 17,36,37). Saggi farmacologici dipendono dall&#39;uso di composti chimici che agiscono come inibitori o attivatori di vari enzimi. I composti comunemente utilizzati in tali esperimenti spesso sono molto diverse nella loro specificità di destinazione. Come un vantaggio, questo offre la possibilità di colpire intere classi di enzimi, per esempio, con acido anacardic p300 inibitori / CBP, PCAF, e membri della famiglia MYST di cappelli 38. L&#39;aspetto negativo di questo potrebbe essere il potenziale off-bersaglio o effetti citotossici Induccato da tali composti. Pertanto, ogni composto usato in un test con testicoli pupa o cisti dovrebbe essere testato per la sua citotossicità e l&#39;effetto specifico a diverse concentrazioni. Inoltre, piccole variazioni nelle condizioni di coltura, concentrazione di composti o di attività, e variazioni nella permeabilità cellulare potrebbe portare alla variabilità degli effetti indotti. Pertanto, è necessario monitorare il successo del trattamento in ogni esperimento. Ad esempio, quando abbiamo usato l&#39;acido anacardic a 150 micron, abbiamo osservato una leggera variabilità nella forza del fenotipo condensazione della cromatina tra e talvolta all&#39;interno di alcuni testicoli, mentre acetilazione dell&#39;istone H4 è diminuita consistentemente. Test farmacologici con testicoli di Drosophila della cultura sono stati utilizzati per analizzare i meccanismi di pre e post-meiotici della spermatogenesi 4,12,14,21. Dal momento che è difficile accedere spermatogenesi post-meiotico con strumenti genetici per giocatori con essentia bersagliofunzioni l pre-meiotica e meiotiche, questo approccio ex vivo costituisce un&#39;alternativa. Inoltre, in linea di principio, il metodo potrebbe essere adattato a pulse-chase esperimenti per seguire lo sviluppo delle cellule germinali trattate nel corso del tempo. Tuttavia, non abbiamo ancora testato questa possibilità. Facendo uso di precoce testicoli pupa è un vantaggio in saggi farmacologici. In primo luogo, la guaina esterna sottile dei giovani testicoli pupa (circa 24 ore APF) potrebbe consentire una migliore permeabilità dei composti chimici. In secondo luogo, quando si studia l&#39;interruttore post-meiotico HP, i testicoli pupa sezionati a 24 ore APF dalla linea fly-protamina-GFP che esprimono consentono una lettura diretta del fatto che lo switch HP è stata colpita o meno. Ad oggi, sono stati sviluppati diversi protocolli per la coltivazione ex vivo di organi e tessuti, tra cui testicoli e cisti germinali di Drosophila (ad esempio, vedi 4,14,17,20,39,40). Il mezzo di coltura e le condizioni generali utilizzatinel protocollo presentato qui sono stati istituiti nel 1979 17. Il sistema di coltura è stato successivamente adattato per imaging in vivo del meccanismo di individualizzazione nel tardo cisti post-meiotico isolate da testicoli adulti 4. In precedenza, abbiamo riportato che queste condizioni supportano anche la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule germinali meiotica e post-meiotici primi nelle loro cisti per circa 48 ore 12. A differenza di altri sistemi di coltura 19 i tempi di sviluppo osservato in queste culture è stato di circa coerente con la tempistica stabilita dai campioni fissi (per i dettagli, vedi 12). Segnali di fluorescenza H2AvD-RFP e protamina-GFP può essere utilizzato per visualizzare la morfologia e la composizione della cromatina nucleare delle cellule germinali in coltura. Abbiamo scoperto che per una chiara identificazione delle fasi di sviluppo della cultura, questo è vantaggioso rispetto ad altri criteri, come l&#39;avvolgimento di cisti. È importante sottolineare che il protocollo presentato non comporta aggiunta di mosca extfattori di crescita RACT o altri diversi dal siero fetale bovino. Inoltre, mostriamo qui che le condizioni siano compatibili con la microscopia a fluorescenza imaging divisioni meiotica ex vivo nella cultura. Le immagini possono essere ottenuti con ragionevole risoluzione in un mezzo facile da usare che supporta lo sviluppo a lungo termine. Questo è in contrasto con protocolli per osservazioni a breve termine (circa 3 ore) in Voltalef olio 41,42. Le procedure sopra descritte per la coltivazione e il trattamento farmacologico dei testicoli pupa e singoli maschi cisti germinali sono facilmente adattabili ai molti genetica, epigenetica, cellule biologiche, o le domande di sviluppo che può essere ricercato in Drosophila spermatogenesi. Ciò comprende in particolare la ricerca incentrata sulle cellule staminali germinali. E &#39;stato dimostrato che lo sviluppo di cellule staminali può essere seguita da immagini dal vivo di coltura adulto testicoli 20,43. Tuttavia, il movimento peristaltico del testicolo maturo guainah interferisce con l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Pertanto, sia l&#39;imaging viene fatto usando testicoli frammentati 43 o il numero di esperimenti di imaging effettuati deve essere aumentato per tenere conto di perdita di dataset 20. Testicoli pupa primi (24 ore APF) non sono ancora chiusi con le cellule muscolari. Anche un po &#39;testicoli più anziani (36-45 h APF) sembrano mostrare alcuni movimenti peristaltici (confronta figura 3 e il video supplementare 1). Pertanto, la coltivazione di giovani testicoli pupa come organi intatti potrebbe servire come alternativa. Inoltre, una volta imparato, la capacità di sezionare testicoli pupa ed eventualmente isolate cisti germinali consentiranno ulteriori applicazioni che utilizzano singole cisti come fonte di un omogeneo, anche se piccola, popolazione di cellule. Ad esempio, è quindi possibile effettuare RT-qPCR per analizzare la regolazione trascrizionale di geni specifici durante le fasi definite di spermatogenesi, come è già stato dimostrato <sup&gt; 15.

Lo sviluppo delle cellule germinali maschili di molte specie è un processo sequenziale. Essa è caratterizzata da una serie di eventi cruciali che culmina nella formazione di spermatozoi morfologicamente e epigeneticamente altamente specializzato. In Drosophila melanogaster, le cellule staminali della linea germinale sulla punta della divisione testicolo asimmetricamente per dare origine ad una nuova cellula staminale e la spermatogonio, vale a dire, la cellula figlia che si impegna per la differenziazione (vedi Figura 1 per una panoramica) 1,2 . Il spermatogonio subisce quattro turni di divisioni mitotiche e, con l&#39;inizio della meiosi, una fase di notevole crescita e l&#39;attività trascrizionale chiamato la fase spermatocita. Le cellule provenienti da un spermatogonio rimangono collegati tra loro e si sviluppano come un fascio sincronizzato avvolto da due cellule somatiche-una struttura denominata una cisti. Dopo il completamento della meiosi, la morfologia delle cellule germinali maschili è completamenteriorganizzati (schematicamente illustrato in figura 1). Inizialmente, spermatidi rotondi allungano per formare la struttura testa idrodinamico, e il flagello sviluppa. Infine, le cellule spermatiche sono separate l&#39;una dall&#39;altra da un complesso meccanismo di apoptosi connesse chiamato individualizzazione 3 - 5. In molte specie, tra cui Drosophila melanogaster e specie di mammiferi, i cambiamenti morfologici delle cellule germinali sono accompagnati da una notevole riarrangiamento epigenetico del aploide maschile germinale cromatina, chiamato interruttore istone-a-protamina (switch HP) 6-9. Forse quasi tutti istone canonico e molte molecole di istone-variante vengono rimossi dalla DNA e sono sostituiti da piccole proteine ​​di base, le protamine, con conseguente struttura nucleoprotamine estremamente compatto specifico per la cromatina degli spermatozoi maturi. Caratteristiche generali dello switch HP sono tegli sostituzione degli istoni canonici prima da varianti istoniche, poi da proteine ​​di transizione, e infine da protamine. Il tutto è accompagnato da diverse modifiche segnali epigenetici, come ad esempio un aumento dei livelli di acetilazione dell&#39;istone H4 appena prima della rimozione istone 7,10 - 12. La maggior parte, se non tutti, dei processi sopra menzionati sono essenziali per lo sviluppo di una matura, sperma interamente fertili. Questo è vero non solo in Drosophila, ma anche negli esseri umani, come le azioni spermatogenesi mammiferi una notevole quantità di somiglianza con il 1,8,9 sistema di invertebrati. Studiare lo sviluppo cellula germinale maschile è molto facilitato nel sistema modello Drosophila. Le mosche sono geneticamente altamente accessibile. La generazione di mutanti, nonché la creazione di ceppi mosca esprimere geni di fusione o costrutti di interferenza RNA richiede poco sforzo. Tuttavia, nello studio di spermatogenesi post-meiotica, l&#39;uso di mutanti und semplici strumenti genetici potrebbero raggiungere un limite. In Drosophila spermatogenesi, trascrizione cessa quasi completamente con l&#39;entrata in divisioni meiotica. Così, la spermatogenesi post-meiotico si basa principalmente su mRNA traslazione repressi e memorizzati sintetizzati in una profase meiotica esteso 13 - 16. Pertanto, strumenti come RNA interference o l&#39;uso di mutanti non condizionali non sono adatti per studiare specificatamente i ruoli post-meiotici di prodotti genici che soddisfano anche funzioni essenziali per lo sviluppo delle cellule germinali pre-meiotica o meiosi. Un vantaggio di Drosophila che può essere sfruttato in questi casi è la capacità di testicoli intatti sezionati e anche cisti di cellule germinali di sviluppare ex vivo di cultura medio 4,12,17 - 20. La dissezione e la coltivazione dei testicoli o cisti germinali permette non solo l&#39;osservazione microscopica di sviluppo germinale delle cellule in cellule viventi, ma unaLSO l&#39;uso di dosaggi farmacologici con, ad esempio, gli inibitori dei complessi enzimatici, come istone acetiltransferasi (copricapo), istone deacetilasi (HDAC), topoisomerasi, o il proteasoma. Quindi, è possibile manipolare le funzioni enzimatiche durante la spermatogenesi post-meiotico e per monitorare i risultati di sviluppo a prescindere embrionali, pre-meiotica o meiosi funzioni 4,12. In saggi farmacologici, abbiamo già analizzato la localizzazione acetilazione-dipendente di una proteina bromodomain durante la profase meiotica, nonché la rilevanza dei livelli di acetilazione degli istoni per lo switch HP epigenetico nella spermatogenesi post-meiotico utilizzando inibitori specifici di targeting cappelli e HDAC 12,21. Targeting l&#39;interruttore HP in questi test è stato reso possibile utilizzando un ceppo mosca che esprime i geni di fusione histone2AvD-RFP e protamineB-eGFP 12,22 nei modelli endogeni, e l&#39;osservazione chei primi spermatidi in testicoli pupa passano attraverso lo switch HP tra 24 e 48 ore APF 12. Il protocollo presentato descrive la dissezione dei testicoli e cisti di Drosophila pupe, le condizioni di coltura, e un test farmacologico con testicoli pupa intatti. A questo scopo, testicoli pupa a circa 24 ore dopo la formazione puparium (APF) sono sezionati (vedi figure 1 e 2). In questo momento, i testicoli non hanno collegamenti con altri tessuti e sono circondato solo da una guaina esterna sottile, che permette una migliore penetrazione dei composti inibitori 23,24. I testicoli sono organi bean- oa forma di pera che possono essere facilmente presi in cultura. I testicoli sono sezionati, colta, e trattati con inibitori specifici. Successivamente, gli effetti degli inibitori sono monitorati con analisi di immunofluorescenza e microscopia a fluorescenza di espressione della proteina di fusione, e confrontando la Morphol nuclearelogia delle cellule germinali trattate a quella delle cellule germinali non trattate. Le condizioni presentate in questo protocollo permette anche l&#39;imaging dal vivo di sviluppare testicoli e cisti della linea germinale in cultura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Durante la spermatogenesi nei mammiferi e in Drosophila melanogaster, cellule germinali maschili si sviluppano in una serie di processi di sviluppo essenziali. Questo include differenziazione da una popolazione di cellule staminali, l&#39;amplificazione mitotico, e meiosi. Inoltre, le cellule germinali post-meiotica subiscono un drammatico processo riconfigurazione morfologica e una riconfigurazione epigenetica globale della cromatina-switch linea germinale istone-a-protamina. Studiare il ruolo di una proteina nella spermatogenesi post-meiotico mediante mutagenesi o altri strumenti genetici è spesso ostacolata da embrionale essenziale, pre-meiotica, o funzioni meiotiche della proteina in esame. Il fenotipo post-meiotica di un mutante di una tale proteina potrebbe essere oscurato tramite un blocco dello sviluppo precedente, o l&#39;interpretazione del fenotipo potrebbe essere complicata. L&#39;organismo modello Drosophila melanogaster offre un bypass a questo problema: testicoli intatti eanche le cisti di cellule germinali sezionati dai primi di pupe sono in grado di sviluppare ex vivo in mezzo di coltura. Facendo uso di tali colture permette l&#39;imaging microscopico di vivere cellule germinali nei testicoli e cisti germinali. È importante sottolineare che i testicoli coltivati ​​e le cellule germinali diventano accessibili anche agli inibitori farmacologici, consentendo così la manipolazione delle funzioni enzimatiche durante la spermatogenesi, comprese le fasi post-meiotico. Il protocollo presentato descrive come sezionare e coltivare testicoli pupa e cisti germinali. Le informazioni sullo sviluppo di testicoli pupa e condizioni di coltura sono forniti insieme di dati di immagini al microscopio di testicoli live e cisti germinali in coltura. Descriviamo anche un saggio farmacologico per studiare la spermatogenesi post-meiotico, esemplificato da un saggio mira l&#39;interruttore istone-to-protamina utilizzando l&#39;inibitore acido anacardic istone acetiltransferasi. In linea di principio, questo metodo di coltivazione potrebbe essere adattato per affrontare molti odomande di ricerca Ther spermatogenesi in pre e post-meiotico.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K Views.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Video: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larvali NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Cultura Vivo di cellule primarie umane tube di Falloppio epiteliale

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging attraverso il caso pupa di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura embrionali di topo della pelle e live-imaging delle Migrazioni Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo