The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. Preparazione di strumenti, Substrati, Culture Media e Piatti <ol><li> Gestione delle finestre nitruro di silicio (Si 3 N 4). <ol><li> Aprire la capsula leggermente spremitura un&#39;estremità contenente la finestra in modo tale da non comprimere finestra stessa, ruotando l&#39;altra estremità della capsula con l&#39;altra mano. </li><li> Controllare un paio di inversione, pinzette dalla punta sottile sotto stereomicroscopio per assicurarsi che non ci siano adesivi, lacune o curve sulla punta. In caso contrario, le finestre possono essere rotti dalle pinzette o il distacco di loro durante le fasi successive. </li><li> Rimuovere la finestra dalla capsula afferrando attentamente il telaio della finestra con una pinzetta, mentre delicatamente comprimendo la capsula in prossimità dell&#39;estremità aperta esercitando una pressione in una direzione in modo da rendere la capsula più ampio in cui i bordi della finestra devono venire fuori. </li></ol></li><li> Finestra pre-lavaggio (optional). <ol><li> Se lo si desidera, le finestre di prelavaggio per immersione delicatamentein acqua distillata per 5 sec, seguito da 2 minuti di lavaggio in 70% di etanolo e 2 min lavaggio in 100% di etanolo. </li></ol></li><li> L&#39;apposizione e sterilizzazione finestre sul piatto cultura. <ol><li> Per fissare le finestre, impostare la finestra con lato piatto fino al fondo del piatto di coltura, posizionare un pezzo di nastro su un vetrino pulito. Tagliare su una striscia di quarto di pollice giù per il lato lungo del nastro. Prendete una fetta di nastro largo del lato corto (a ⅛ &quot;da ¾&quot;) con una lama di rasoio pulito. </li><li> Utilizzare pinzette per applicare la fetta di nastro al bordo della griglia o finestra. Usare abbastanza per aderire saldamente senza coprire l&#39;apertura della finestra stessa. Manipolando il nastro aderito con pinzette, impostare il finestrino sul fondo del piatto di coltura. Utilizzare la punta delle pinzette di aderire il nastro al fondo del piatto cultura saldamente. </li><li> Applicare un&#39;altra striscia di nastro per l&#39;altro bordo e rispettare questo al fondo saldamente con la punta delle pinzette. </li><li> Una volta che tutte le finestre sonoregistrato, sterilizzare finestre in piastre di coltura con raggi ultravioletti (UV). Realizzare questo mettendo il piatto sotto la lampada UV in una cappa a flusso laminare per circa 1 ora. </li><li> (Facoltativo) Se le finestre devono essere pre-rivestito con poli-lisina, farlo seguente finestra di sterilizzazione. Rivestire la finestra con 10 ml di soluzione sterile 0,01% poli-L-lisina per 1 ora a 37 ° C incubatore, e poi sciacquare la soluzione rimanente via con il mezzo di coltura. </li></ol></li><li> Preparare buffer per lavaggio finale prima XFM. <ol><li> Preparare sia un Tris-glucosio o piperazine- N, N &#39;-bis (acido etansolfonico) (TUBI) -sucrose tampone privo di eventuali tracce di metalli con osmolalità e pH pari al tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS) senza calcio e magnesio. Utilizzare uno di questi buffer per risciacquare celle dopo cellule vengono fissate chimicamente. <ol><li> Per rendere la soluzione Tris-glucosio (Tris 10 mM, glucosio 260 mM, 9 mM acido acetico,) aggiungere 1,4 g di glucosio, 36 mg di base Tris e16 ml di acido acetico e 20 ml di acqua ultrapura. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Non è necessaria alcuna regolazione del pH. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana. </li><li> Per rendere i TUBI-saccarosio (20 TUBI mM, saccarosio 200 mm) aggiungono 0,18 g di tubi e 2,0 g di saccarosio a 20 ml di acqua ultrapura e regolare il pH a 7,4 con piccole quantità di acido acetico concentrato. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana. NOTA: La ragione per evitare di utilizzare PBS nel risciacquo finale è che le concentrazioni di fosfato, cloruro e potassio in PBS sono così alti che può interferire con XFM se non viene completamente rimosso prima essiccazione all&#39;aria. </li></ol></li></ol></li><li> Preparare buffer per la placcatura cellulare. <ol><li> Preparare o estrarre tutti i media, come ad esempio RPMI medio 1640, 1x soluzione tripsina-EDTA, D-PBS, e tutti gli altri reagenti come necessario per la particolare linea cellulare aderente come normalmente fatto per passaging le cellule aderenti ointeressi f, e riscaldare a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. placcatura di Celle <ol><li> Per piatto di coltura sterilizzato contenente le finestre, nella cappa a flusso laminare, aggiungere delicatamente supporti (10 ml per un piatto di coltura 100 mm), lungo il lato del piatto cultura con esso inclinato ad un angolo. Evitare di creare tensione superficiale inutili o cadere supporto direttamente sulla superficie delle finestre nitruro di silicio. Come si aggiunge supporto, lentamente alleviare l&#39;angolo di inclinazione per rivestire la griglia e la finestra con i media. </li><li> Preparare la linea cellulare aderenti di interesse appropriato, trypsinizing o raschiare le cellule fuori delle piastre come al solito per passaging la linea cellulare. Eseguire una conta cellulare, o altra preparazione necessaria prima di applicare le cellule alla piastra fresca. </li><li> Aggiungere cellule al piatto cultura con finestre ad una densità cellulare che è necessaria per raggiungere tipicamente il 50% -70% di confluenza entro 24-72 ore, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica. </li&gt; <li> Osservare la crescita delle cellule occasionalmente, utilizzando un microscopio ottico invertito, fino alla densità cellulare desiderata (di solito 50% -70% di confluenza) è raggiunto. </li></ol> 3. Fissazione delle cellule <ol><li> Preparare freschi 4% paraformaldeide in D-PBS diluendo uno stock acquistato (ad esempio 25% paraformaldeide) e regolando il pH a 7,4 con acido acetico (per evitare l&#39;aggiunta di eccesso di sodio al campione). </li><li> Quando le cellule sono state coltivate come desiderato, e le macchie vitali (come Hoescht) sono stati applicati e ripreso, rimuovere il supporto aspirando delicatamente, inclinando il piatto in un angolo di 45 ° con una mano, e l&#39;aspirazione con una pipetta con l&#39;altra mano . NOTA: Invece di pipettaggio impiegato mezzi, l&#39;alternativa è quella di scegliere la finestra in alto, immergere la finestra in microprovette con D-PBS due volte e poi metterlo in una nuova imbarcazione cultura con soluzioni fissativo per 20 minuti seguito da 2 tempi di lavaggio PBS per rimuovere i residui fissativi. Se questo viene scelto, andare directly al punto 3.5. </li><li> Lavare il piatto delicatamente con D-PBS e sostituire immediatamente il liquido rimosso aggiungendo delicatamente il fresco 4% PFA / PBS tenendo il piatto con un angolo di 45 °, pipettaggio verso il lato del piatto, e lentamente rilassante l&#39;angolo di inclinazione per consentire la soluzione fissativa per coprire le finestre. Conservare le celle coperte con il fissativo per 20 minuti a RT. </li><li> Rimuovere il liquido mediante aspirazione delicata, ancora come sopra, inclinando leggermente il piatto ed aspirando a mano. </li><li> Sostituire il liquido rimosso aggiungendo delicatamente alcuni dei tubi / soluzione di saccarosio, con il metodo di inclinazione e pipettaggio descritto nel passaggio 3.3. </li><li> Ripetere i punti 3.4 e 3.5. </li><li> Preparare i materiali per l&#39;essiccazione. <ol><li> Raccogliere asciugamani privo di lanugine, come Kimwipes, e tirare uno fuori dalla scatola, quindi è a portata di mano molto rapidamente e facilmente. </li><li> Preparare un luogo non-pulita e in piano per impostare la finestra per asciugare. Impostare su una stuoia griglia gomma del tipo usato in microscopia elettronica, che ha così crestela finestra può essere appoggiato su un&#39;estremità mentre si asciuga. Ciò manterrà la finestra di rimanere bloccati alla superficie di essiccazione come si asciuga, e drenare qualsiasi buffer residuo al bordo del campione. </li></ol></li><li> Tweeze cautela il nastro collegata alla finestra per tenere la finestra fuori dal liquido. Recuperare le finestre che si staccano del nastro, applicando una piccola quantità di TUBI / saccarosio per farli galleggiare e poi raccogliere con le pinzette inversa. </li><li> Cautela (senza toccare la finestra stessa) e accuratamente daub qualsiasi eccesso TUBI / saccarosio dal bordo della finestra con un Kimwipe. Daub Anche la parte posteriore zona frastagliata con una piega arrotondata di un Kimwipe. NOTA: L&#39;obiettivo è di avere meno cristallizzazione di sali o buffer sulla superficie della finestra possibile. </li><li> Collocare la finestra sul tappeto griglia. Assicurarsi che la finestra non è disteso sul tappeto griglia, ma appoggiato su un bordo (con le creste del tappeto griglia) e toccando il meno della grigliamat possibile. Lasciare la finestra di asciutto. </li></ol> 4. Montaggio del campione e Imaging <ol><li> Una volta che il campione è essiccato, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico. Eseguire questa verifica, prima di preparare i campioni per il trasporto di un sincrotrone. </li><li> Pacchetto le finestre per il trasporto alla linea di luce di sincrotrone di hosting l&#39;esperimento. Apporre delicatamente le finestre con nastro su due lati di un vetrino, poi fissare il vetrino con nastro sul fondo di una piastra di Petri di plastica. Nastro il piatto chiusa Petri. NOTA: Prima di questo punto, la procedura può essere eseguita in qualsiasi laboratorio tipico. Le seguenti operazioni dovrebbero essere meglio fatto a una linea di luce di sincrotrone. </li><li> Rimuovere il nastro dalla finestra delicatamente con una pinzetta. Utilizzare smalto, in un sottile strato uniforme lungo il bordo della finestra, per fissare le finestre al possessore di alluminio fornito dai collaboratori beamline del sincrotrone. </li><li> Inserire il supporto di alluminio inuna cinematica di montaggio, e poi posto in posizione al microscopio a raggi X. Montare il campione su una staffa di collegamento alla fasi motorizzati, all&#39;interno della camera campione alla linea di luce. </li><li> Dopo essere usciti dalla radiografia zona strumento microscopio campione (una gabbia fatta di muri di piombo pieno), impostare la scansione. Utilizzando il software specifico linea di luce, selezionare la zona appropriata del campione da esaminare, mentre si visualizza la posizione del fascio di raggi X sul campione utilizzando una macchina fotografica dotata di un video mirino e pre-allineata con una fotocamera scintillatore valle. </li><li> Scegliere la risoluzione appropriata per il campione, sulla base di una stima della dimensione della funzione più piccolo di interesse. Per l&#39;imaging singole cellule di mammifero (~ 20-40 micron di dimensione), utilizzare una risoluzione di 0,25-0,5 micron. Per le zone di tessuti di imaging, e distinguendo strati cellulari tra loro, utilizzare una risoluzione di 2-20 micron. </li><li> Scegliere il tempo di permanenza adeguato per il campione, in base alla stima della quantità del riunitoal di interesse presenti. Per una scansione rapida panoramica, o se sono presenti elevate quantità di metalli, utilizzare scansioni Vola con tempi di sosta di 30-300 msec per pixel. Se poco materiale è presente, o per misurare i metalli di bassa abbondanza relativa, utilizzare scansioni passo con tempi di sosta di 1-2 sec per pixel. </li><li> Programmare le scansioni nel software specifico per linea di luce. Acquisire un&#39;immagine raster-scan. Lavorare insieme con i collaboratori linea di luce per analizzare i dati con il software che identificheranno i caratteristici picchi di energia per ogni elemento. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X-ray imaging di fluorescenza è utile in molti campi, tra cui geoscienze, scienza dei materiali e biologia chimica 26-34. Advances in raggi X di sincrotrone, e la loro messa a fuoco, hanno prodotto molto fasci ad alta intensità. Focused X-ray travi sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule ora esistono, segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore al silicio deriva produzione. E studio della biologia chimica di metalli nella cella è un&#39;applicazio...

X-ray fluorescenza consente sia l&#39;identità e la quantità di elementi presenti in un campione da spazialmente risolto. Incidente raggi X, di una energia selezionata per essere maggiore dell&#39;energia dell&#39;elemento più pesante di interesse vincolante elettroni, superare l&#39;energia di legame degli elettroni interno-shell al nucleo 1. Questo crea un &#39;buco&#39; nel guscio di elettroni. Come elettroni ad alta energia cadono in questi fori, raggi X fluorescenti sono emessi cui lunghezza d&#39;onda dipende dalla separazione dell&#39;energia di tali orbitali. Poiché la spaziatura energia degli orbitali è caratteristica di un dato elemento, l&#39;emissione di fluorescenza a raggi X ha anche lunghezze d&#39;onda caratteristiche, dipendenti sull&#39;elemento. È questa emissione alla lunghezza d&#39;onda caratteristica che permette l&#39;identificazione degli elementi presenti. Calibrazione dell&#39;intensità di fluorescenza permette quantificazione degli elementi presenti. Fluorescenza a raggi X microscopy (XFM) è diventato sempre più utilizzato, in parte a causa dello sviluppo di fonti di sincrotrone a raggi X molto brillanti, come quelle in Primavera-8 in Giappone, l&#39;europeo di radiazione di sincrotrone (ESRF) in Francia, e l&#39;Advanced Photon Source ( APS) negli Stati Uniti 2. Queste fonti forniscono altissima intensità fasci di raggi X. Allo stesso tempo, il miglioramento ottica a raggi X, come la tecnologia zone plate, permesso la messa a fuoco di questi fasci a macchie sub-micron, anche se piuttosto inefficiente 3. Con molto fasci ad alta intensità, anche una quantità relativamente piccola di luce che può essere messo a fuoco è sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule, producendo segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore. Pertanto, lo studio della biologia chimica di metalli nella cella è un&#39;applicazione in particolare, che fa uso di molti dei recenti sviluppi in questa tecnica 4-10. Ci sono molti fattori critici da considerare durante la appmentire XFM per indagare la distribuzione elementare e la quantificazione di cellule di mammifero in coltura o altri campioni biologici. In primo luogo, il campione deve essere mantenuto integro, sia strutturalmente e rispetto alla sua composizione elementare, affinché la misura sia significativo. In secondo luogo, il campione deve essere conservato in qualche modo in modo che sia resistente al danno di radiazione che può essere causato da un fascio di raggi X focalizzato. Un modo che un campione può soddisfare entrambi i criteri contemporaneamente deve essere rapidamente congelati in un vetrosa, ghiaccio amorfo 11,12. Congelamento rapido è spesso raggiunto attraverso varie tecniche di crioconservazione, come tuffo il congelamento o alta pressione congelamento 13-16. E &#39;generalmente accettato che la crioconservazione conserva architettura cellulare complessiva e composizioni chimiche in campioni biologici il più vicino possibile allo stato nativo. Fissaggio chimico, d&#39;altra parte, a causa della penetrazione lenta e selettiva di fissativi in ​​cellule e tessuti come well le successive variazioni di permeabilità della membrana, possono consentire vari ioni cellulari soprattutto gli ioni diffusibili come Cl, Ca e K per essere colati, perse o ricollocate, rendendo così investigazione di questi elementi non ottimali 17-19. Nonostante il chiaro vantaggio di crio-over fissaggio fissaggio chimica in generale, per le cellule di mammifero aderenti in particolare, crioconservazione ha varie limitazioni 20-23. La più ovvia è che non tutti i laboratori di ricerca ha un facile accesso agli strumenti di crioconservazione. La maggior parte dei congelatori alta pressione correnti o anche immergono congelatori sono costosi e di proprietà solo da un sottoinsieme di strutture cryo, che può essere lontano da dove vengono incubate cellule. Il vantaggio di crioconservazione potrebbe essere scambiato per lo svantaggio di stress viaggi collocato sulle cellule. Così, mentre crioconservazione è sicuramente il modo più rigoroso per conservare campioni per analisi a raggi X di fluorescenza, non è certamente la più accessibile a tutti i ricercatori in tutte le circostanze;né è sempre essenziale - se i metalli di interesse sono strettamente legati alle macromolecole fissabili, e la risoluzione con cui viene ripreso il campione è superiore al danneggiamento del ultra-microstruttura che potrebbero verificarsi durante l&#39;essiccazione. Memore dei caveat 24, fissaggio chimico e asciugatura può essere una scelta adatta. Altri fattori in un esperimento di imaging di fluorescenza a raggi X di successo includono l&#39;analisi corretta. X-ray imaging di fluorescenza è fondamentalmente spettroscopia di emissione di fluorescenza di raggi X in combinazione con raster-scanning per fornire la risoluzione spaziale. Gli spettri di emissione di fluorescenza a raggi X raccolti contengono una combinazione di sovrapposizione picchi di emissione, di fondo, e le cime di scattering elastico e anelastico del fascio incidente. Software che consente la de-convoluzione di questi contributi, e il montaggio dei picchi di emissione, è stato uno sviluppo critico per questo campo 25. Inoltre, lo sviluppo e dist commercialeribution di norme a film sottile di composizione nota, usata per calibrare intensità della fluorescenza rispetto alla quantità di materiale, è stato molto importante anche. Questo protocollo fornisce una descrizione della preparazione di cellule aderenti da fissazione chimica ed essiccamento all&#39;aria. Un passo fondamentale in questo processo è la crescita delle cellule alle finestre di nitruro di silicio, che spesso non aderiscono bene, rendendo dolce risciacquo in una particolare chiave di modo di successo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

La capacità dell&#39;imaging fluorescenza a raggi X per fornire informazioni sui campioni biologici è subordinato questi campioni essere preparati in modo tale che essi sono robusti alle radiazioni sulla scala temporale dell&#39;esperimento, e tuttavia la loro caratteristiche chimiche e strutturali sono ben conservato. Nella visualizzazione del risultato di un campione che è stato preparato come sopra descritto e illustrato, è possibile vedere che c&#39;è variazione degli elementi presenti - indica che la fissazion...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K Views.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Ricerca

Chimica

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

Diffrazione di raggi X Polvere in Conservazione Scienza: verso Routine di cristallo Struttura Determinazione di corrosione prodotti sul patrimonio Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

Quantificare i dati di fluorescenza di raggi x utilizzando le mappe

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

L'assorbimento del metallo essenziale nei batteri gram-negativi: fluorescenza, radioisotopi, a raggi x e delle cellule di frazionamento

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

Elementale-sensibile alla rilevazione della chimica in batterie attraverso la spettroscopia di assorbimento di raggi x molli e risonante Inelastic x-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Ligando-mediata di nucleazione e crescita di nanoparticelle metalliche Palladium

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...