NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali durata della vita e di tutti gli animali e le procedure secondo la Nazionale Guide Consiglio di ricerca per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio 10. 1. Balloon Fabbricazione e ventricolare sinistra Pressure Monitoring Circuit <ol><li> Costruire palloni LV secondo Miller et al. 11 in un bicchiere con un ancoretta, miscelare 9.5 ml di acqua distillata, 14,2 ml di sciroppo di mais luce e 33,8 g di saccarosio, e il calore su un piatto caldo, mescolare fino a quando lo zucchero si scioglie . Continuare soluzione di riscaldamento fino a raggiungere circa 150 ºC. NOTA: esistono numerosi metodi per la costruzione di palloncini BT, tra cui la modifica di consigli preservativo e trasparente pellicola di costruzione 9,12. Troviamo il metodo di cui sopra sia relativamente facile da costruire palloni perdite liberi, ma un vantaggio di aggrapparsi palloncini pellicola comprende caratterizzazione precedente un&#39;adeguata frerelazioni cy-risposta 9. </li><li> Rompere fili di spaghetti secchi in pezzi di circa 5 cm di lunghezza e immergere un lato di ogni pezzo di circa 1 cm di profondità nella soluzione di zucchero e rimuovere lentamente. </li><li> Posizionare la parte secca del filo di pasta in un blocco di schiuma di polistirene e sospendere così il mix di zucchero gocciola verso il basso e forma uno stampo forma a goccia. Lasciare O / N in un essiccatore così stampo indurisce. </li><li> Il giorno seguente, immergere gli stampi in gel di silicone dispersione. Posizionare fili di pasta di nuovo in polistirene blocco di schiuma e il luogo in aa 37 ºC forno per 2 ore o fino a secco. Ripetere questo passaggio una volta di più vengono applicati due strati di silicone. </li><li> Una volta asciutto, posto in acqua per diverse ore per aiutare nella rimozione di pallone dallo stampo. Conservare palloncini in 0,02% soluzione di sodio azide. </li><li> Utilizzare una raccolta di sangue 23 G impostata per produrre una cannula balloon personalizzato tagliando un ago per creare una punta smussata e mettendo tacche nell&#39;ago. </li><li> Collegare il tubo ad una pressione transduttore e sciacquare con acqua mantenendo tubi e cannule completamente sommerse per impedire l&#39;ingresso di aria nel sistema. Posizionare un palloncino che è stato riempito con acqua sulla cannula e utilizzare 2-0 punti di sutura in seta per legare sulla cannula. Prova palloncino capacità di mantenere la pressione (~ 100 mmHg per almeno 1 ora) </li></ol> 2. Preparazione del sistema di perfusione del cuore isolato <ol><li> Inizialmente, lavare e riscaldare il sistema. Accendere un 37 ºC acqua calda bagno circolatore che è stato collegato all&#39;apparato Langendorff, e riempire il serbatoio tampone con acqua distillata. Collegare un nuovo filtro in fibra di vetro dei tubi scorre in apparati e accenda la pompa per scovare il sistema. Durante il tempo di preparazione, il controllo della temperatura dell&#39;acqua espulsa dal blocco Langendorff usando una sonda di temperatura, per garantire che bagnomaria è impostato correttamente. Inoltre, accendere una pompa di circolazione refrigerato e impostare a 20 ° C che verrà utilizzata durante l&#39;arresto cardioplegico del cuore. </li><li> IOn frattempo preparare le seguenti soluzioni. Preparare 1 L di soluzione di cardioplegia (NaCl 110 mM, KCl 16 mM, 16 mM MgCl 2, 1.5 mM CaCl 2, 10 mM NaHCO3) e filtrare. Inoltre, preparare 2 litri di KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mm KH 2 PO 4, 1.7 MgSO mm 4, 2 mM Na-piruvato, destrosio 6 mm 24,9 NaHCO mm 3 (pre-cellulare con il CO 2) , 1.4 mM CaCl 2 (aggiunto ultima). Una volta sciolto, rimuovere precipitati filtrando in un pallone con una lente 5 micron imbuto sinterizzato. Porre un in un piccolo piatto su ghiaccio per essere usato durante la chirurgia e isolamento. </li><li> Ossigenare il perfusato (KHB) con 95% O 2/5% CO 2 per almeno 30 minuti prima dell&#39;uso. Sistema Perfuse Langendorff con KHB per rimuovere eventuale acqua residua dal sistema e tampone serbatoio. Per i topi, impostare la velocità iniziale della pompa a ~ 2,0 ml / min. Mettere 2-0 e 4-0 punti di sutura in seta vicino perfusione cannula. Eseguire la pompa fino a quando il tubo e l&#39;apparecchiatura sono pieni di spiritoh perfusato e garantire la strup bolla è pieno di perfusato. NOTA: per lunghi periodi di perfusione e la funzione stabile si raccomanda di installare un filtro in linea in fibra di vetro (~ 1 micron) nel circuito di perfusione a raccogliere eventuali precipitati che potrebbero costituire la formazione di coaguli nel cuore </li></ol> 3. mouse Chirurgia 3.1) Topo Anestesia e trattare <ol><li> Preparare siringa con la dose di anestetico di 80 mg / kg di ketamina e 5 mg / ml miscela xilazina e aggiungere 0,9% soluzione salina sterile per richiamare il volume di 0,2 ml. Iniettare eparina IP (50 ml di 1.000 U / ml soluzione). </li><li> Posizionare il mouse di nuovo nel contenitore per il trasporto (~ 10-20 min) e attendere che si perda la coscienza come l&#39;eparina ha effetto. Periodicamente fare un pizzico punta a monitorare il dolore riflesso. </li></ol> 3.2) Rimuovere il Cuore <ol><li> Una volta che il mouse è completamente privo di sensi e non risponde a pizzico piedi, fissarla ad un tavolo operatorio adeguato con perni o 25 G<html> puntali attraverso le arti. Eseguire una toracotomia per esporre il cuore. Tagliare un piccolo foro appena sotto lo sterno ed estendere il taglio ai lati del mouse evitando il diaframma. </li><li> Tagliare rapidamente il diaframma e poi rapidamente tagliare i lati della gabbia toracica. Capovolgere indietro la gabbia toracica come una conchiglia per esporre la cavità toracica. Afferrare delicatamente cuore, posizionare sotto le forbici e togliere il cuore. NOTA: E &#39;indispensabile per rimuovere rapidamente il cuore una volta che è esposto nella cavità toracica e polmoni sono non-funzionali. </li></ol> 3.3) Pulire il Cuore <ol><li> Mettere il cuore nel piatto contenente ghiaccio KHB freddo e tagliare eventuali grossi pezzi di tessuto polmonare allegati. Utilizzare pinze a prendere il cuore e individuare l&#39;aorta. Premere delicatamente il cuore e cercare il sangue che viene visualizzata, come questo dovrebbe essere l&#39;estremità aperta dell&#39;aorta. Utilizzare pinzette punta fine di tenere cuore dalla estremità aperta dell&#39;aorta. </li></ol>e &quot;&gt; 4. Montaggio del Cuore, partenza perfusione, e Posizionamento del palloncino 4.1) Montaggio e Cannulating Cuore <ol><li> Prima di trasportare il cuore all&#39;apparato Langendorff, accendere la pompa assicurandosi che la pressione di perfusione è bassa (~ 20 mmHg). Tenere cuore dall&#39;aorta appena sotto la cannula. Utilizzando un altro set di pinzette punta fine, aprire con cautela l&#39;aorta e far scorrere cardiaca sulla cannula. Tenerlo in posizione con una serie di pinzette e poi usare un clip morbido bordi per fissare temporaneamente a cannula. NOTA: montare rapidamente il cuore alla cannula di perfusione è fondamentale per una buona preparazione. Con l&#39;esperienza, le procedure di apertura della cavità toracica fino montare il cuore dovrebbe prendere tra 1 e 2 min. </li><li> Legare e avviare perfusione come segue, con 4-0 sutura di seta aorta sicuro alla cannula direttamente sotto il clip. Assicurarsi che la cravatta è anche intorno alla cannula aortica metallo, così l&#39;aorta non ottenere legati off durante il serraggioil nodo. Una volta che una cravatta è ben posizionato, rimuovere la clip. </li><li> Utilizzare punti di sutura in seta aggiuntivi per fissare l&#39;aorta saldamente alla cannula facendo attenzione a legare sotto i rami dei vasi che possono essere venuta fuori l&#39;aorta. Questi possono spesso essere individuati da perdite perfusato o tiro fuori dall&#39;aorta. NOTA: Durante le fasi iniziali della perfusione del sangue deve essere lavando dal cuore e l&#39;intero cuore dovrebbe apparire di un colore rosa tenue. Decolorazioni scure che non si lavano fuori indicano le aree ischemiche probabilmente a causa di emboli o coaguli di aria e il cuore non deve essere utilizzato. </li></ol> 4.2) Stabilire perfusione e LVP misura <ol><li> Aumentare lentamente la pressione di perfusione e aumentare la velocità della pompa fino a che la pressione di perfusione raggiunge i 70 mmHg. NOTA: la pressione di perfusione standard per il mouse perfusione possono essere 70-90 mmHg, ma devono essere tenuti costanti da un animale all&#39;altro all&#39;interno di un esperimento. </li><li> Pulire il residuo di tessuto (polmone, tiroide ecc) Che potrebbe essere ancora fissato al cuore. Utilizzare le forbici per tagliare gli atri sinistra per creare un&#39;apertura nel ventricolo sinistro. </li><li> Posizionare il palloncino sul supporto e sgonfiare. Posizionare la cannula pallone vicino la cannula aortica, direttamente sopra l&#39;apertura nel ventricolo sinistro. Inserire con cautela pallone verso il basso nel ventricolo sinistro tenendo il cuore in atto in modo aorta non si strappi. </li><li> Una volta che è a posto lentamente inizia a gonfiare il palloncino fino a quando il LVEDP raggiunge ~ 8 mmHg. Posizionare la sonda di temperatura contro il fondo del cuore in modo che misura la temperatura dell&#39;effluente. </li></ol> 4.3) Misura basale <ol><li> Sigillare il cuore in una camicia d&#39;acqua camera di perfusione. Durante questo periodo profumato continuamente il cuore con KHB, e assicurarsi che la temperatura continua a salire. Monitorare la temperatura e regolare il bagno di acqua di conseguenza, fino a raggiungere circa ~ 37 ºC. NOTA: temperat Monitoraggioure nelle fasi iniziali di perfusione è critica come flussi coronariche e successivamente temperatura può variare da cuore a cuore. Temperatura del perfusato effluente viene monitorato per temperature infarto desiderata tramite una sonda di temperatura posta all&#39;apice del cuore. Inoltre, in confronto ad altri protocolli di perfusione Langendorff, cuore non è immerso in CP o KHB durante la perfusione o arresto, questo è fatto principalmente di regolare rapidamente la temperatura, oltre a fornire la consegna CP efficiente senza diffusione. </li><li> Inizia a registrare continuamente misurazione funzionale utilizzando un sistema di acquisizione dati collegato ai sensori appropriati, compresa la pressione di perfusione, pressione ventricolare sinistra (trasduttore di pressione collegato al palloncino LVP), la temperatura, e parametri elettrofisiologici (EKG, MAP se presente) (allegato sarà I fabbricanti e le specifiche ai singoli sensori e sistema di acquisizione dati). Una volta che l&#39;effluente KHB raggiunge ~ 37 ° C per almeno 15<html> min e parametri funzionali cardiaci sono stabili, prendere nota del tempo per misurazioni di riferimento. NOTA: i criteri di inclusione / esclusione vengono applicate a ogni cuore. Un LVDP di &lt;60 mmHg al basale indica un cuore che deve essere rimosso dall&#39;analisi. Inoltre, il flusso coronarico&gt; 4,5 ml / min, o l&#39;incapacità di mantenere la pressione di perfusione al basale probabilmente indica una perdite o dell&#39;aorta strappati. Anche eventuali cuori che hanno chiare le aree ischemiche che possono essere confermati visivamente (ad esempio, coagulo) o riduzioni di ischemia associata espositive della funzione cardiaca (ad esempio, l&#39;aumento LVEDP, estremamente aritmici) vengono rimossi dall&#39;analisi. </li><li> Misurare flusso coronarico mediante raccolta dell&#39;effluente coronaria in un cilindro graduato per 1 min. Chiudere la camera e consentire la temperatura e la funzione di ritorno ai valori basali. Alternativamente misurare il flusso coronarico continuo nella linea di perfusione con una sonda di flusso posto dopo il circuito di scarico della pressione. </li></ol>&quot;&gt; 5. Avvio cardioplegica arresto <ol><li> Mettere 100 ml di tampone cardioplegia fredda in un altro serbatoio e. trasferire il serbatoio cannula KHB al serbatoio cardioplegia. </li><li> Staccare il corpo rivestito acqua e il circuito di riscaldamento di perfusione dal bagno di acqua calda e connettersi al circolatore refrigerato utilizzando tubi sgancio rapido. Utilizzare circolatori di riscaldamento e raffreddamento separati per consentire rapidi cambiamenti di temperatura del cuore e perfusato. </li><li> Seguire la bolla d&#39;aria che viene introdotto nel tubo durante la commutazione, e una volta raggiunta vicino al cuore isolato avviare la temporizzazione per cardioplegia. Consegnare cardioplegia per 2 minuti. Dopo la dose iniziale di fermare la pompa. Assicurarsi di arrestare cuore in diastole ed essere vicino alla temperatura desiderata CP. NOTA: Una trappola bolla sufficiente è necessario per evitare emboli aria nel cuore. In alternativa un sistema di erogazione per entrambi i serbatoi commutate da un rubinetto può essere facilmente costruito, tuttavia troviamo seguirezione la piccola bolla d&#39;aria che viene introdotto quando cambi la cannula tra bacini, un metodo facile di tempistiche di consegna, CP dato potenzialmente differenti velocità della pompa tra esperimenti (ad esempio, a causa di topo / ratto, pressione di perfusione, resistenza del filtro, ecc.) </li><li> Mantenere il cuore in cardioplegia per 2 ore a ~ 20 ° C. Ogni mezz&#39;ora durante CP accendere la pompa nuovamente per 1 minuto in modo da un&#39;altra dose viene somministrata. NOTA: dosi intermittenti di CP ogni 30 min comporta compromissione funzionale del cuore, senza la necrosi del tessuto. Periodi più lunghi tra le dosi di CP (cioè,&gt; 45 min) possono provocare necrosi e contrattura ischemica e sarebbe più appropriato per un modello di danno necrotico associato con ischemia non protetto. </li></ol> 6. riperfusione <ol><li> Alla fine del CP, trasferire la cannula serbatoio indietro al ossigenato KHB. Collegare i circuiti di controllo della temperatura per il circolatore riscaldamento e spegnere la pompasu per iniziare riperfusione. A questo punto la cardioplegia lava fuori, osservare l&#39;aumento di temperatura e il cuore inizia a battere dopo 2-4 minuti di riperfusione. Quando il cuore inizia a battere il cuore è lento e spesso aritmica. NOTA: di solito non è un grande aumento diastolica LVP (vale a dire, ≤10 mmHg aumento), che spesso è caratteristico in modelli di ischemia puri. Le aritmie possono persistere anche nel riperfusione e di tanto in tanto il cuore dovranno essere defibrillato. Ciò può essere ottenuto con l&#39;uso di un insieme stimolatore a tensioni superiori (~ 10-50 V) ed elettrodi posti alla base e apice del cuore. </li><li> Lasciare cuore per reperfuse per 30 minuti, e durante questo periodo di tempo prendere misure di flusso coronarico come necessario. Misurare il flusso coronarico raccogliendo l&#39;effluente con un cilindro graduato per 30-60 secondi. </li></ol> 7. Raccolta Tissue <ol><li> Sgonfiare il palloncino e rimuoverlo dal ventricolo sinistro. Prendete il cuore fuori dalcannula e si pesa. In esperimenti iniziali, almeno una porzione trasversale del cuore dovrebbe essere presa e TTC macchiato valutare la necrosi per garantire che il cuore è libero di lesioni necrotiche. </li><li> Raccogliere le fette di cuore per gli studi di microscopia, pesi wet / dry, ecc Il resto o tutto il cuore dovrebbe essere rapidamente congelati mettendo in azoto liquido. Conservare cuori congelati in un freezer -80 ° C. NOTA: Per la misurazione di composti fosfato ad alta energia (cioè, l&#39;ATP, fosfato creatina), il cuore deve essere congelato immediatamente. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

I particolari del protocollo precedenti metodi per valutare stunning miocardico secondario all&#39;ischemia globale associato con l&#39;arresto cardioplegic. Nelle nostre mani questo protocollo produce un approssimativo ~ riduzione del 40% della funzione cardiaca (LVDP, +/- dP / dt) con modifiche minime della frequenza cardiaca al 30 min punto tempo di post-riperfusione. Mentre il cuore è riperfuso e rewarmed tutti i parametri di funzionalità cardiaca sono ridotte in momenti iniziali con una frequenza cardiaca molto r...

Miocardico stordimento è definito come reversibile attività contrattile ridotto nonostante il ripristino di un adeguato flusso di sangue dopo un breve periodo di ischemia o periodi prolungati di insulti ischemici con cardioprotezione 1,2,3,4,5. Il metodo presentato è specificamente utilizzato per modellare clinicamente rilevanti insulti ischemici che possono provocare alterazioni reversibili in funzione contrattile (vale a dire, gli insulti ischemici associati alla chirurgia cardiaca utilizzando arresto cardioplegico, brevi periodi di ischemia, angina, ecc). In contrasto con gli studi di ischemia gravi (infarto miocardico, necrosi) questo protocollo è stato sviluppato per valutare il recupero funzionale del miocardio e cardioprotezione senza danno tissutale, rimodellamento, e la morte cellulare. La maggior parte della carta discute un protocollo standard arresto cardioplegic con elementi simili a un cardiochirurgia utilizzando ipotermia e consegna cardioplegia intermittente. Prot miocardicaezione durante la maggior parte di interventi chirurgici cardiaci si basa su cardioplegia e bypass cardiopolmonare. Sebbene cardioplegia soluzioni e strategie (CP) sono molto variabili (sangue, crystalloid, freddo, caldo, ecc) gli elementi più comuni sono 1) iperkaliemia e / o altre strategie per arrestare il cuore in diastole, limitando così l&#39;utilizzo di energia derivante dalla contrazione del miocardio, e 2) l&#39;ipotermia per rallentare il metabolismo e aiutano a mantenere ATP e altre riserve di energia mentre arrestato. Le soluzioni cardioplegia attuali offrono protezione per il cuore contro gli insulti ischemici che altrimenti rivelarsi letale. Tuttavia, le strategie cardioprotettivi durante insulti ischemici chirurgici non sono perfetti, e la conseguente lieve danno ischemico può provocare reversibile disfunzione contrattile cardiaca nonostante un adeguato flusso di sangue (stunning miocardico), l&#39;acidosi, danni cardiomiociti, e gli effetti vascolari, tra cui ridotta perfusione coronarica e vasospasmo. Questo protocollo è diversoda modelli standard di ischemia cardiaca isolati valutazione infarto miocardico e ischemia grave in quanto valuta più lievi insulti ischemici che può portare a insufficienza cardiaca seguente breve ischemia o insulti ischemici associati con l&#39;arresto cardioplegic. (Per la revisione sulle tecniche di perfusione Langendorff e I / studi R vedi 6-8). Per linee guida generali e un&#39;analisi approfondita dei parametri sperimentali connessi con il mouse isolato cuori perfusi vedere Sutherland e t al., 2003 9 La tecnica qui presentata dettagli l&#39;attrezzatura necessaria, reagenti, gradini, strategie e suggerimenti per indurre affidabile mozzafiato in cuori del mouse. Modifiche minori sono necessarie per applicare la tecnica a ratti. Brevemente cuori isolato mouse sono Langendorff perfusi per circa 30 minuti con fisiologica tampone Krebs-Henseleit (KHB), seguiti da freddo protetta arresto cardiaco mediante consegna di un hypotherm hyperkalemicsoluzione cardioplegia ic. Dopo l&#39;arresto, il recupero funzionale cardiaca viene monitorato nel corso rewarming e riperfusione del cuore con KHB. Le variazioni del grado di recupero della funzione contrattile cardiaca può essere valutata per valutare agenti cardioprotettivi e strategie cardioprotezione differenti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Cardioplegia Solution (St Thomas II)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Symbol / Concentrations (mM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaCl; 110</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KCl; 16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>CaCL2; 1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>MgCL2; 16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Bicarbonate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaHCO3; 10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Krebs-Heinslet Buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaCl; 118</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KCl; 4.8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>MgSO4; 1.7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Bicarbonate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaHCO3; 24.9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Phosphate (monobasic)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KH2PO4; 1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>CaCL2; 1.4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Pyruvate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Na pyruvate; 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>C6H12O6; 6</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Balloon reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corn Syrup</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spaghetti</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon Dispersion Gel</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >styrofoam block</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lab oven/incubator ( 50C)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Langendorff Perfusion equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heated water circulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cooling water circulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Perfusion pump capable of 2-30 ml/min</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inline perfusion filters - 1 um glass fiber</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small graduated cylinder (~10 mL)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >perfusion resevoir (1L)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cardioplegia resevoir (~200 mL)</td>
			<td ></td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gas bubbler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >95/5 O2/CO2 mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical tools and reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metzenbaum and Potz surgical scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >two Dumont size 5 forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ketamine</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylazine</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >heparin</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silk 2-0 and 4-0 sutures</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
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</table>

murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest

Il protocollo seguito è utile per valutare la funzione cardiaca compromessa o miocardiche splendida seguenti moderati insulti ischemici. La tecnica è utile per modellare danno ischemico associato con numerosi fenomeno clinicamente rilevanti tra cui la chirurgia cardiaca con arresto cardioplegica e bypass cardiopolmonare, CABG off-pump, trapianto, angina, breve ischemia, ecc. Il protocollo presenta un metodo generale per modellare ipotermico arresto cardioplegico hyperkalemic e riperfusione nei cuori roditori concentrandosi su misura della funzione contrattile miocardica. In breve, un cuore mouse è perfuso in modalità Langendorff, strumentato con un palloncino intraventricolare, e parametri funzionali cardiaci di base sono registrate. Dopo la stabilizzazione, il cuore è quindi soggetta a brevi infusione di una soluzione cardioprotettivo cardioplegia ipotermico di avviare arresto diastolica. Cardioplegia viene consegnato in modo intermittente su 2 ore. Il cuore è quindi riperfuso e warmed a temperature normotermici e recupero della funzione miocardica è monitorata. L&#39;uso di questo protocollo si traduce in affidabilità funzione contrattile cardiaca depressa esenti da danni ai tessuti del miocardio lordo nei roditori.

La Figura 1 presenta i risultati tipici da un esperimento del mouse. LVP (linea rossa), dP / dt (linea verde), e la temperatura (linea viola) sono state continusouly registrato oltre ~ 3 ore. Lettere indicano un - misurazione di base, b, c, d, e - consegna di soluzione cardioplegia, f - inizio della riperfusione, g, h, i, j - misurazione del flusso cornary durante la riperfusione. Nota, LVDP depresso e dP / dt su riperfusione rispetto al basale. Figura 1B include i dati da un registrato...

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Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Murino Isolato Cuore modello di infarto stordimento associati con arresto cardioplegica

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.6K Views.  Brown University. The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

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A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

A Murine chiuso del torace modello di ischemia miocardica e riperfusione

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Ricerca

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modello murino di guarigione delle ferite

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Whole-cuore Analisi tessuto miocardico

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. After isolation and retrograde perfusion of the heart according to the Langendorff technique, the heart is inverted into an upside-down position and is mechanically stabilized by a balloon catheter inserted into the left ventricle. Then, a thin latex cap &#8211; previously cast to match the average size of the rat heart &#8211; is placed over the epicardial surface. The outlet of the latex cap is connected to silicon tubing, with the distal opening 10 cm below the base level of the heart, creating slight suction. CT continuously produced on the epicardial surface is collected in ice-cooled vials for further analysis. The rate of CT formation ranged from 17 to 147 &#181;L/min (n = 14) in control and infarcted hearts, which represents 0.1-1% of the coronary venous effluent perfusate. Proteomic analysis and high performance liquid chromatography (HPLC) revealed that the collected CT contains a wide spectrum of proteins and purinergic metabolites.

This protocol describes a method to collect cardiac interstitial fluid from the isolated, perfused rat heart. To physically separate interstitial transudate from coronary venous effluent perfusate, the Langendorff perfused heart is inverted, and the transudate (interstitial fluid) formed on the cardiac surface is collected using a soft latex cap.

Il modello invertito del cuore per la raccolta di transudati interstiziali dal cuore isolato del ratto

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modello di criolesionismo per studiare l'infarto miocardico nel mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major causes of mortality and morbidity around the world. Cell-based therapies for cardiac repair and improvement of left ventricular function after MI have attracted considerable attention. Accordingly, the safety and efficacy of these cell transplantations should be tested in a preclinical large animal model of HF prior to clinical use. Pigs are widely used for cardiovascular disease research due to their similarity to humans in terms of heart size and coronary anatomy. Therefore, we sought to present an effective protocol for the establishment of a porcine chronic HF model using closed-chest coronary balloon occlusion of the left circumflex artery (LCX), followed by rapid ventricular pacing induced with pacemaker implantation. Eight weeks later, the stem cells were administered by intramyocardial injection in the peri-infarct area. Then the infarct size, cell survival, and left ventricular function (including echocardiography, hemodynamic parameters, and electrophysiology) were evaluated. This study helps establish a stable preclinical large animal HF model for stem cell treatment.

We sought to establish a swine model of heart failure induced by left circumflex artery blockage and rapid pacing to test the effect and safety of intramyocardial administration of stem cells for cell-based therapies.

Istituzione di un modello suina di infarto post-miocardico per il trattamento delle cellule staminali

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Myocardial Infarction by Percutaneous Embolization Coil Deployment in a Swine Model

Myocardial infarction (MI) is the leading cause of mortality worldwide. Despite the use of evidence-based treatments, including coronary revascularization and cardiovascular drugs, a significant proportion of patients develop pathological left-ventricular remodeling and progressive heart failure following MI. Therefore, new therapeutic options, such as cellular and gene therapies, among others, have been developed to repair and regenerate injured myocardium. In this context, animal models of MI are crucial in exploring the safety and efficacy of these experimental therapies before clinical translation. Large animal models such as swine are preferred over smaller ones due to the high similarity of swine and human hearts in terms of coronary artery anatomy, cardiac kinetics, and the post-MI healing process. Here, we aimed to describe an MI model in pig by permanent coil deployment. Briefly, it comprises a percutaneous selective coronary artery cannulation through retrograde femoral access. Following coronary angiography, the coil is deployed at the target branch under fluoroscopic guidance. Finally, complete occlusion is confirmed by repeated coronary angiography. This approach is feasible, highly reproducible, and emulates the pathogenesis of human non-revascularized MI, avoiding the traditional open-chest surgery and the subsequent postoperative inflammation. Depending on the time of follow-up, the technique is suitable for acute, sub-acute, or chronic MI models.

Myocardial infarction (MI) animal models that emulate the natural process of the disease in humans are crucial to understanding pathophysiological mechanisms and testing the safety and efficacy of new emergent therapies. Here, we describe an MI swine model created by deploying a percutaneous embolization coil.

Infarto miocardico mediante dispiegamento della bobina di embolizzazione percutanea in un modello suino

Myocardial infarction (MI) is the leading cause of mortality worldwide. Despite the use of evidence-based treatments, including coronary revascularization ...

Left Coronary Artery Ligation: A Surgical Murine Model of Myocardial Infarction

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In order to explore the pathophysiological changes after myocardial infarction and design future treatments, research models of MI are required. Permanent ligation of the left coronary artery (LCA) in mice is a popular model to investigate cardiac function and ventricular remodeling post MI. Here we describe a less invasive, reliable, and reproducible surgical murine MI model by permanent ligation of the LCA. Our surgical model comprises of an easily reversible general anesthesia, endotracheal intubation that does not require a tracheotomy, and a thoracotomy. Electrocardiography and troponin measurement should be performed to ensure MI. Echocardiography at day 28 after MI will discern heart function and heart failure parameters. The degree of cardiac fibrosis can be evaluated by Masson's trichrome staining and cardiac MRI. This MI model is useful for studying the pathophysiological and immunological alterations after MI.

Presented here is a surgical procedure for permanent ligation of the left coronary artery in mice. This model can be used to investigate the pathophysiology and associated inflammatory response after myocardial infarction.

Legatura coronaria sinistra: un modello chirurgico murino di infarto miocardico

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In ...