Il nostro protocollo fornisce metodi alternativi per l'identificazione e la caratterizzazione di fattori ospiti virali, nucleolari e non nucleolari che mantengono il ciclo infettivo dell'HIV-1. I concetti utilizzati in questo approccio sono applicabili ad altri modelli virali e di malattia che richiedono la caratterizzazione di percorsi sottostudiati. Le tecniche di risoluzione dei problemi sono descritte per la modifica ad altri modelli proteici.
A dimostrare la procedura saranno Haitang Li e Pritsana Chomchan, scienziati del Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare del Beckman Research Institute presso la Città della Speranza, e Roger Moore, membri del Centro proteomica della città della speranza e del Dipartimento di Immunologia Molecolare. Inizia coltivando un HLfB che esprime stabilmente la coltura della linea cellulare HeLa in tre lastre di coltura di 100 millimetri a una densità due volte 10-to-the-six-cells-per-millilitro. Quando le cellule raggiungono la concentrazione appropriata, mescolare 20 microgrammi di plasmide contenente il segnale di localizzazione nucleolare Rev mutazione a tre bandiere di interesse con 1,76 millilitri di TE 79/10 in un tubo da 15 millilitri, seguito dall'aggiunta di 240 microlitri di cloruro di calcio bimolare, con miscelazione accurata.
Successivamente, trasferire il contenuto del tubo dropwise in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di 2x HBS, seguito dalla miscelazione su una macchina a vortice. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, vortice le precipitazioni. Aggiungere un millilitro della sospensione dropwise a ciascuna delle tre piastre di coltura HLfB da 100 millimetri mentre si ruota delicatamente il mezzo.
Dopo un'incubazione di sei ore nell'incubatore di coltura cellulare, sostituire la miscela di trasfezione con 10 millilitri di terreno di coltura fresco e riportare le cellule nell'incubatrice per altre 42 ore. 48 ore dopo la trasfezione, posizionare ogni piatto su un letto di ghiaccio all'interno di una cappa di coltura tissutale di livello due a rischio biologico. Rimuovere il supporto di coltura cellulare e sciacquare delicatamente le cellule con 10 millilitri di PBS prechilled, senza interrompere gli strati cellulari.
Scartare il PBS dopo aver risciacquato le cellule. Successivamente, trattare le cellule con un millilitro di tampone di lisi, integrato con cocktail inibitore della proteasi, per piatto. Inclinando le piastre per raccogliere le celle in una piscina, utilizzare un raschietto per interrompere manualmente gli strati.
Utilizzando una micropipetta da 1.000 microlitri, mettere in comune il lisato da ogni piastra in un tubo prechilled da 15 millilitri per un'incubazione di 15 minuti sul ghiaccio, con vortice ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, l'aliquota lista in tre tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri e raccoglie i lisati mediante centrifugazione. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 15 millilitri e ottenere la concentrazione di lisato proteico virale, come descritto nel manoscritto.
Per la coimmunoprecipitazione del segnale di localizzazione nucleolare Rev bandiera a tre numeri primi, sciacquare tre volte 25 microlitri di perline di gel di affinità M2 con 500 microlitri di tampone di lysis fresco, integrati con cocktail inibitore della proteasi, per lavaggio. Eseguire questi passaggi in una stanza fredda o con i reagenti sul ghiaccio. Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere una concentrazione di un milligrammo per millilitro di glisato proteico virale alle perline risciacquate in un volume finale di cinque millilitri di tampone di lysis.
Incubare la reazione per tre ore a quattro gradi Celsius con rotazione. Al termine dell'incubazione, pellettare le perline di lisato proteico virale coniugate per centrifugazione. Raccogliere il supernatante per la misurazione della concentrazione proteica del lisato post-immunoprecipitazione.
Vedi il manoscritto per istruzioni per la conservazione dei campioni. Aggiungere 750 microlitri di tampone di lysis al pellet di perline coniugato con proteine virali, trasferire le perline in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e lavare le perline su un rotatore per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere le perline per centrifugazione per altri due lavaggi sul rotatore, come appena dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una punta pizzicata, lunga e gel-caricamento per rimuovere eventuali tracce di tampone di lisi dal complesso di precipizione di perline-coimmununo. Rimossare le perline in 55 microlitri di tampone di carico 2x. Quindi, far bollire il campione a 95 gradi Celsius per 10 minuti.
Caricare 25 microlitri di eluito su un gel macchia occidentale e un gel Coomassie che macchia il gel SDS-PAGE. Dopo aver completato l'elettroforesi del gel SDS-PAGE, sciacquare il gel tre volte in 25 millilitri di acqua ultrapura per 15 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 millilitri di reagente di macchia Coomassie sul gel.
Vedi il manoscritto per il protocollo di colorazione completo. Per la digestione delle fasce di gel, utilizzare prima una lama di rasoio pulita per tagliare le fasce di gel dall'intera corsia del gel, rappresentando ogni mutazione, in cubi di circa cinque millimetri. Posizionare ogni banda in un tubo di microcentrifugo pulito da 0,5 millilitri.
Coprire le bande due volte con bicarbonato di ammonio da 100 millimolare in una soluzione di acetonitrile-to-water uno-a-uno a temperatura ambiente per 15 minuti per lavaggio. Quindi, asciugare i pezzi di gel per cinque minuti in una centrifuga sottovuoto. Per ridurre le proteine, coprire i pezzi di gel essiccato con ditiotriolo 10 millimolare in bicarbonato di ammonio da 100 millimolare per un'incubazione di un'ora a 56 gradi Celsius, seguita da alchilazione in iodoacetamide da 100 millimolare in acqua per un'ora a temperatura ambiente al buio.
Successivamente, ridurre e rigonfiare i pezzi di gel due volte con acetonitrile, seguito da bicarbonato di ammonio 100 millimolare, entrambi con tremori delicati a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo il secondo rigonfiamento, asciugare i pezzi di gel per cinque minuti in una centrifuga sottovuoto. Gonfiare i pezzi di gel con 50 nanogrammi per microlitro di tripside modificata di grado sequenziante in bicarbonato di ammonio da 100 millimolare.
Dopo cinque minuti, coprire i pezzi di gel con bicarbonato di ammonio 100 millimolare e lasciare che si gonfino completamente, aggiungendo bicarbonato di ammonio 100 millimolare aggiuntivo in modo che i pezzi di gel gonfio siano completamente coperti. Quindi, incubare i pezzi di gel durante la notte a 37 gradi Celsius, fermando la reazione con 1/10 del volume dei campioni con il 10% di acido formico in acqua la mattina successiva, e raccogliere il supernatante da ogni tubo. Il segnale di localizzazione nucleolare del rev bandiera a tre numeri primi è rilevabile in tre diverse condizioni tampone di lisi contenenti varie concentrazioni di cloruro di sodio.
B23 è rilevabile anche in tampone di lisi contenente la minore concentrazione di sale, appena rilevabile in tampone di lisi contenente la concentrazione media di sale, e non rilevabile in tampone di lisi contenente un'alta concentrazione di sale. Il rilevamento B23 è ottimale nel tampone di lisi contenente la bassa concentrazione di cloruro di sodio con bandiera a tre primi Rev di tipo selvaggio e perde affinità con il segnale di localizzazione nucleolare Rev M1 bandiera tri-primo. Anche l'affinità B23 con la bandiera a tre primi Rev di tipo selvaggio diminuisce con una maggiore concentrazione di sale e il controllo negativo del pcDNA non produce immunodetezione non specifica dopo l'immunoprecipitazione in entrambe le condizioni tampone di lysis.
Il segnale di localizzazione nucleolare rev tri-prime è più rilevabile dopo l'eluizione attraverso l'ebollizione nel buffer di caricamento del campione 2x, mentre B23 è rilevabile sia in condizioni di incubazione del tampone campione di 37 che di 95 gradi Celsius. Dopo l'immunoprecipitazione e la colorazione dell'argento, come dimostrato, i segnali di localizzazione nucleolari Rev e Rev di tipo selvaggio M2, M6 e M9 sono rilevabili a 18 kilodalton. Bande corrispondenti alla proteina B23 sono osservate anche con il marcatore di 37 kilodalton.
La colorazione con reagente Coomassie dimostra ulteriormente la rilevabilità del segnale di localizzazione nucleolare Rev a tre primi in presenza e assenza di mutazioni a 18 kilodaltoni. Utilizzare tutti i controlli, sia positivi che negativi, necessari per i riferimenti relativi al modello di malattia durante il processo di risoluzione dei problemi e screening per potenziali fattori di legame. Tutte le mutazioni a singolo punto possono essere esaminate per l'attività dominante-negativa attraverso la multimerizzazione con Rev di tipo selvaggio e utilizzate nell'arresto della replicazione dell'HIV-1.
