Questo protocollo utilizza la microdisezione laser e il sequenziamento dell'RNA per analizzare l'espressione differenziale dell'mRNA dell'eterogeneità intratumorale, come aree di accumulo di cellule mesenchimali o aree di invasione tumorale. Questo metodo è stato ottimizzato per preservare l'istologia tissutale di buona qualità e l'integrità dell'RNA per facilitare l'acquisizione di campioni di microdisezione laser di alta qualità. Questo metodo è sensibile e altamente riproducibile.
Può essere utilizzato per studiare la morfologia e l'eterogeneità del tumore in vari modelli tumorali. La microdisezione laser del tessuto tumorale cerebrale congelato è una tecnica economica e affidabile per l'isolamento di aree anatomiche discrete delle popolazioni cellulari dai tessuti tumorali per studiarne i profili molecolari. L'LMD può essere utilizzato per acquisire una conoscenza meccanicistica approfondita degli eventi molecolari che si svolgono durante la progressione tumorale e potrebbe rivelare nuovi obiettivi terapeutici.
Una bioluminescenza in vivo del peso tumorale del topo raggiunge un segnale tra uno per 10 e il sei e uno per 10 al 7 ° fotoni. Lavare la soluzione di tirodi ossigenati attraverso il sistema circolatorio del topo che porta tumore eutanasiato fino a quando il fegato e i polmoni non sono stati completamente liberati dal sangue. Continuare a perfondere l'animale con una soluzione di saccarosio al 30% sciolta in soluzione di tirolo per altri 15 minuti.
Per valutare il successo della perfusione, confermare che il collo, la coda e le gambe sono rigidi alla fine della circolazione. Quindi raccogliere il cervello secondo i protocolli standard e conservare il cervello durante la notte in una fresca soluzione di saccarosio al 30%. Per prepararsi alla crioconservazione, riempire un barattolo con isopentane-2-metilbutano freddo e posizionare il barattolo in un contenitore pieno di azoto liquido.
Mentre il solvente è agghiacciante, asciugare il cervello su un pezzo di carta da filtro e posizionare il cervello in un Cryomold etichettato. Con attenzione a circa cinque millilitri di mezzo di taglio della temperatura ottimale al centro del Cryomold e posizionare il cervello nello stampo nell'orientamento desiderato. Utilizzando forcep pulite, posizionare rapidamente il Cryomold nell'isopentane-2-metilbutano refrigerato per 30-40 secondi.
Una volta che il mezzo di taglio si è solidificato, trasferire il Cryomold sul ghiaccio secco e avvolgere il Cryomold e scattare il tessuto cerebrale congelato in un foglio di alluminio per meno 80 gradi Celsius. Per acquisire sezioni di tessuto tumorale cerebrale congelate, impostare prima la temperatura di un criostato tra meno 20 e meno 24 gradi Celsius e posizionare il blocco campione nella camera criostatica per 30-60 minuti. Mentre il campione è equilibrante, pulire la camera e il portaprofestelli con etanolo al 100% e spruzzare le spazzole di sezione con soluzione detergente RNasi.
Quando il campione è pronto, rimuovere lo stampo e utilizzare un mezzo di taglio fresco per attaccare il blocco di tessuto congelato al disco campione del criostato. Posizionare il blocco nel supporto del disco e allineare il blocco con la lama del coltello. Acquisire sezioni di 10 micrometri del cervello utilizzando uno dei pennelli senza Rnase per appiattire e disartiare accuratamente i pezzi di tessuto sulla superficie di taglio.
Per montare le sezioni del tessuto cerebrale sulle diapositive, premere senza problemi il lato caricato positivamente di uno scivolo di vetro PEN senza RNasi etichettato sulla sezione e posizionare lo scivolo in una scatola di stoccaggio all'interno della camera. Una volta raccolte tutte le diapositive, posizionare la casella di archiviazione a meno 80 gradi Celsius. Per sciogliere il mezzo di taglio prima della microsezione laser, immergere le diapositive in immersioni sequenziali di etanolo decrescente di 30 secondi seguite da colorazione della soluzione di viola cristallo per 20 secondi e cinque secondi in soluzione 0,5% eosina Y.
Al termine dell'incubazione eosina Y, utilizzare carta da filtro per bloccare gli scivoli asciutti e disidratare le diapositive in immersioni sequenziali ascendenti all'etanolo. Dopo l'immersione in etanolo di 60 secondi, sciacquare le diapositive in un contenitore di xilene per tre minuti. Successivamente, asciugare i vetrini su superficie priva di RNasi a temperatura ambiente per 10 secondi prima di montare i campioni in mezzo di montaggio preparato con acqua priva di RNasi.
Dopo 10-20 secondi, trasferire le diapositive sulla piattaforma di microscopio per la microscopia. Per la microdisezione di cattura laser, accendere l'alimentazione prima di accendere il laser. Quindi, accendere il controller del microscopio nel computer e avviare il software di microdisezione di acquisizione laser.
Nel pannello Controllo microscopio selezionare l'ingrandimento 10 volte superiore. In Controllo laser impostare i parametri laser per la dissezione dei tessuti e selezionare una frequenza laser di 120 hertz e una corrente laser del 100%Per una microdisezione laser accurata, impostare la velocità su 10 e impostare l'apertura su 10 micrometri. Quindi impostare la potenza su 53.
Caricare il raccoglitore di tessuti che acquisirà il tessuto seguendo la sezione e fare clic sul secondo pulsante Scarica. Sostituire il collettore vuoto con tubi a testa piatta PCR da 0,5 millilitri senza DNasi e Rnase contenenti 30 microlitri di tampone di lisi per tubo. Riportare il raccoglitore alla macchina e fare clic su continua a procedere.
Caricare il campione elaborato sul microscopio e fare clic su Scarica nel software di microdisezione laser. Su per il campione sul supporto dello scivolo e posizionare il supporto dello scivolo sul palco. Fate clic su Continua (Continue) per procedere e selezionate Disegno taglio (Draw Cut) nella finestra Taglia forme (Cut Shapes).
Utilizzare i controlli del microscopio per trovare l'area di interesse e tracciare un profilo intorno alla regione di interesse. Quindi selezionate un tubo di raccolta di destinazione e fate clic su Avvia taglio (Start Cut) per procedere alla microdisezione del tessuto. Una volta sezionate tutte le aree di interesse, trasferire i tubi di collettore dal supporto sul ghiaccio secco fino a quando non sono a valle.
Per acquisire tessuti con una morfologia superiore e integrità dell'RNA, sono stati valutati vari approcci di perfusione. Per sezionare le aree di interesse, è necessario macchiare i tessuti con coloranti innocui per l'RNA. La successiva perfusione di topi portanti di tumore con soluzione di tirodi e 30% di saccarosio seguita da un'incubazione notturna nel 30% di saccarosio porta alla conservazione della morfologia e dell'integrità dell'RNA del tessuto del topo.
Sebbene la fissazione del tessuto paraformaldeide si traduce in una morfologia dei tessuti di alta qualità, l'integrità dell'RNA è influenzata negativamente. Altri approcci come l'uso di un'incubazione di soluzione di tiroide o soluzione di tirolo più il 30% di incubazioni di soluzione di saccarosio non influenzano la qualità dell'RNA, ma si osserva una risoluzione ridotta nella morfologia dei tessuti. Se i tessuti non sono montati con mezzo di montaggio, le sezioni si disidratano e la morfologia si deteriora durante il montaggio dei campioni di tessuto con il mezzo di montaggio del 15% sciolto in acqua mantiene una morfologia tissutale di alta qualità.
L'imaging al microscopio a microscopia a cattura laser consente la selezione del tessuto tumorale per la dissezione. Questa selezione della regione di interesse consente quindi la dissezione delle aree di interesse all'interno di ciascun campione di tessuto per l'analisi dell'integrità dell'RNA. Mantenere una morfologia del tessuto tumorale di alta qualità e l'integrità dell'RNA è fondamentale.
La soluzione di tirodi e la perfusione di saccarosio al 30% con conservazione notturna nel 30% di saccarosio migliorano significativamente la morfologia dei tessuti per l'LMD. La rapida fissazione, colorazione e montaggio del licoma con la soluzione GAN è un passo fondamentale per preservare la qualità dell'RNA e prevenire la formazione di crepe all'interno del tessuto. Si consiglia di sessare almeno 2,5 per 10 al 6 ° micrometro quadrato tumore totale per area tissutale per ottenere quantità appropriate di RNA sia per il controllo qualità dell'RNA che per l'analisi trascritomica.
LMD consente l'analisi delle vie di segnalazione molecolare che regolano l'eterogeneità e l'invasione del glioma che potrebbero rivelare nuovi potenziali obiettivi per il futuro sviluppo traslizionale nei modelli di glioma preclinico.
