Vorremmo ringraziare il Dott Claycomb per la fornitura di cellule HL-1 e protocollo dettagliato di manutenzione. Vorremmo anche ringraziare la signora Elena Carrillo e il Dr. Seth Robia per la loro assistenza con la generazione di film cellulare e Mr. Pete Caron per la sua assistenza con fare alcuni accessori per il nostro sistema duale mappatura ottica del canale. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 a XA), National Institutes of Health (HL113640 a XA), e Loyola University Development Fund Research (a XA).

1. Soluzione Preparazione <ol><li> Soluzione noradrenalina (NP) <ol><li> Sciogliere 40 mg di NP in 25 ml di 30 mM acido ascorbico (0,1475 g di acido ascorbico in 25 ml di Milli-Q (MQ) acqua depurata. Evitare l&#39;esposizione alla luce diretta durante la preparazione della soluzione perché noradrenalina (NP) è sensibile alla luce. </li><li> Filtrare la soluzione NP con un filtro a siringa da 0,22 micron. Aliquota della soluzione in 1 ml microtubi sterile e conservare a -20 ° C. Una volta congelato, NP è stabile per un mese. </li></ol></li><li> Integrata Lavare e Final Claycomb supporti <ol><li> Iniziare con 43,5 ml di Claycomb medio e integrare con 5 ml di siero bovino fetale (FBS), 0,5 ml di penicillina / streptomicina, 0,5 ml di NP e 1: 100 diluito L-Glutammina fare 50 ml di mezzo finale Claycomb integrato. Evitare l&#39;esposizione alla luce diretta durante la preparazione della soluzione perché Claycomb mezzo è sensibile alla luce. </li><li> Preparare il supporto Lavare Claycomb utilizzando la stessa ricetta del supsere realizzata Claycomb media tranne aggiungere 5% FBS e omettere la NP e componenti L-glutammina. NOTA: I media finale e Wash Claycomb integrati sono buoni per due settimane se conservato a 4 ° C senza l&#39;esposizione alla luce diretta. </li></ol></li><li> Soia soluzione inibitorio tripsina <ol><li> Sciogliere 25 mg di inibitore della tripsina di soia in 100 ml di tampone fosfato salino Ca-free e Mg-libera di Dulbecco (PBS). </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron. NOTA: La soluzione sterilizzata è stabile per un mese se conservato a 4 ° C. </li></ol></li><li> Gelatina / fibronectina soluzione di rivestimento piatto <ol><li> Sciogliere 0.1 g di gelatina in 500 ml di acqua per fare MQ 0,02% di gelatina. </li><li> Autoclave, quindi diluire 1 ml di fibronectina in 199 ml di 0,02% gelatina e mescolare delicatamente. </li><li> Aliquota 6 ml di soluzione di gelatina in tubi separati e conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Soluzione Salt Hanks &#39; <ol><li> Utilizzando scalporepiastra, sciogliere i seguenti sali in acqua MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0.4000), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (5,042), CaCl 2 (1.261). </li></ol></li><li> Soluzione di calcio di colorante sensibile (Rhod2) <ol><li> Diluire 1 mg di polvere secca Rhod2 in 400 ml di 20% Pluronic F-127 in DMSO per fare un Rhod2 colorante soluzione madre e conservare a -20 ° C. </li><li> Diluire questa soluzione 1: 1000 con la soluzione Salt Hanks &#39;per ottenere una soluzione di lavoro finale prima di iniziare l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Soluzione Tensione dye sensibili (Rh237) <ol><li> Diluire 5 mg di Rh237 con 2 ml di DMSO per rendere soluzione stock e conservare a -20 ° C. Diluire soluzione madre 1: 1000 con la soluzione Salt Hanks &#39;per fare una soluzione di lavoro finale prima di iniziare l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol> &amp; #160; NOTA: 1-4 soluzioni sono basate sul HL-1 protocollo coltura cellulare Claycomb con lievi modifiche. 2. Passaging e Coltura HL-1 atriale miociti su vetrini NOTA: Le cellule HL-1 possono essere ottenuti dal Dr. Claycomb (Louisiana State University). <ol><li> Grow HL-1 le cellule in fiasche T25 e mangimi con 5 ml di integrazioni Claycomb media quotidiana. Passage le cellule T25 flaconi ogni cinque giorni secondo la HL-1 protocollo coltura cellulare Claycomb (descritto di seguito) 10. </li><li> Coprioggetto tondo Luogo (diametro 20 mm) in 12 pozzetti piastre di coltura 24 ore prima che le cellule del pallone T25 sono completamente confluenti e pronto per essere diversi passaggi, e quindi coprire i vetrini con gelatina / fibronectina notte a 37 ° C. </li><li> Il prossimo giorno, aspirare e scartare la gelatina / fibronectina dalle piastre di coltura e di sostituirlo con 1,5 ml di integrare media finale Claycomb in ogni pozzetto. </li><li> Cellule Spalato da una cultur T25e pallone dopo aver raggiunto piena confluenza al giorno 5. Aspirare il mezzo dal pallone T25 contenente la cultura confluenti e sciacquare la cultura brevemente con PBS a 37 ° C. </li><li> Aspirare PBS e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C pipettando la tripsina / EDTA sul fondo del pallone T25 per evitare il contatto diretto con le cellule. Incubare a 37 ° C per 1 min. </li><li> Rimuovere tripsina / EDTA tramite aspirazione e aggiungere un altro 1,3 ml di tripsina / EDTA per bombola T25. Incubare a temperatura ambiente per 1 min. Esaminare al microscopio e se le cellule sono ancora attaccate al pallone, toccare per rimuovere completamente le cellule rimanenti. </li><li> Aggiungere 1,3 ml di inibitore della tripsina di soia per le cellule e le cellule di trasferimento del pallone in un tubo da centrifuga da 15 ml. Lavare il pallone vuoto con 5 ml di Wash Claycomb media. Aggiungere il risciacquo delle cellule nella provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 500 g per 5 min. </li><li> Dopo centrifugazione, aspirare il surnatante e delicatamente risospendere il pellet cellularein 6 ml di mezzo integrato finale Claycomb. </li><li> Seme ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti con 0,5 ml di sospensione cellulare da passaging cellulare. Alimentare le cellule con fresca INTEGRAZIONI media finale Claycomb quotidiana. NOTA: Strettamente monitorare la crescita delle cellule, tipicamente i monostrati cellulari raggiungere stato confluenti il ​​giorno 4 e le attività spontanee rimangono visibili. Poi, il monostrato colta sarà pronto per la mappatura ottica giorno 4-5. </li></ol> 3. Caricamento di calcio e di tensione coloranti sensibili alle cellule <ol><li> Per gli studi di mappatura ottica, rimuovere delicatamente il vetrino dalla piastra di coltura cellulare 12-bene e risciacquare con la soluzione Salt Hanks &#39;. </li><li> Per colorare le cellule con Ca colorante sensibile Rhod2, incubare il monostrato di cellule sul vetrino con 3 ml della ossigenato (gorgogliare con 5% di CO 2/95% O 2 gas) soluzione Rhod2 lavorare a 37 ° C a bagnomaria per 30 min . </li><li> Per colorare le cellule con V m colorante sensibiliRh237, immergere il Rhod2 caricata monostrato cellulare in 3 ml di soluzione di lavoro Rh237 ossigenata a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua per altri 15 min. </li></ol> Mappatura 4. Dual Channel Optical <ol><li> Posizionare il monostrato cellulare, che è doppio macchiato con V m e coloranti Ca, in una camera di circolazione su un microscopio a fluorescenza invertito. Utilizzare un sistema di circolazione riscaldata per mantenere la temperatura della camera di cella a 35 ± 1 ° C. Controllare accuratamente la temperatura del perfusato regolando la velocità del flusso che circola attraverso la camera per evitare un gradiente di più di 0,3 ° C attraverso la camera. <ol><li> Prima di registrare V m / segnali Ca, lavare il monostrato cellulare con la soluzione Hanks fresco per circa 5 minuti per eliminare il colorante residuo dalle operazioni di colorazione precedenti. </li></ol></li><li> Pace monostrati cellulari sano utilizzando un elettrodo bipolare costituito da una pipetta di vetro riempita con una soluzione di Salt Hanks &#39;e silver fili avvolti intorno alla punta della pipetta come descritto in precedenza 12,17. </li><li> Pace monostrati di cellule sane in una durata del ciclo di 200-500 msec e polso larghezza di 2 ms, che prevedono una soglia di stimolazione a circa 1 mV. NOTA: per ogni lotto di monostrati coltivate, almeno due monostrati non trattati devono essere utilizzati per verificare la condizione del lotto cella. Monostrati di controllo sani dovrebbero essere in grado di essere catturato da una stimolazione elettrica a durata del ciclo di 200-500 msec. Se i monostrati di controllo non riescono a essere elettricamente ritmo, questo suggerisce che l&#39;intero lotto delle cellule non può essere adatto per esperimenti di mappatura ottica. </li><li> Per eccitare sia V m e Ca coloranti sensibili, utilizzare una sorgente di luce LED (520 nm) accoppiato con un filtro di eccitazione (510 nm / 40) e uno specchio dicroico (561 nm). <ol><li> Raccogliere i segnali fluorescenti emessi dalle cellule mediante un obiettivo 40X e split con uno specchio dicroico (594 nm) in un componente V m ed una componente Ca.Filtrare la luce emessa nel canale m V con un filtro passaggio lungo (700 nm) e la luce emessa nel canale Ca con un filtro passa banda (585/40 nm). </li><li> Raccogliere la luce fluorescente filtrata con due telecamere CCD (80 x 80 pixel, 1.000 fps; redshirt Imaging). </li><li> Per evitare dye photobleaching, effettuare registrazioni per meno di 2 secondi su ogni campo di vista di limitare il tempo di esposizione alla luce. Qui, l&#39;immagine tipicamente quattro aree diverse per ogni monostrato. </li></ol></li></ol> 5. Elaborazione dati di V mo Ca Recordings <ol><li> Per entrambi V m e segnali Ca (80 x 80 pixel), la media dei valori di intensità di venticinque (5 x 5) confinanti pixel in un valore di intensità in diversi momenti della registrazione per ridurre il rumore di fondo. NOTA: Dopo la media dei dati, ogni punto del tempo di registrazione di un potenziale d&#39;azione individuale o Ca transitoria produce una matrice di dati contenente 16 x 16 in media valori di intensità (mediacanali dati) con una risoluzione spaziale di 50 micron. </li><li> Definire tempo di attivazione (AT) di registrazione V m o segnali Ca. <ol><li> Per definire un tempo di attivazione (AT) di un potenziale d&#39;azione singola o Ca transitorio, determinare il tempo del 50% di ampiezza di picco V mo segnali Ca utilizzando un algoritmo basato su MATLAB misura come precedentemente descritto. 12 </li><li> Revisionare manualmente l&#39;ATS analizzato per eliminare eventuali errori che possono verificarsi durante l&#39;analisi del programma. </li><li> Conservare la definita AT matrice (16 x 16 in media i canali di dati) del potenziale d&#39;azione registrata e transitori di calcio, rispettivamente, nel software utilizzato. </li></ol></li><li> Calcola potenziale d&#39;azione o di calcio transitori velocità di conduzione (CV) vettori sulla matrice AT utilizzando il metodo di analisi campo vettoriale, come descritto in precedenza, con piccole modifiche 12,18. <ol><li> Calcolare il vettore CV di un canale dati relativi al suo circostante AT punti dati (5 ×; 5 vicina media canali dati) per simulare una superficie polinomiale liscia di tempi di attivazione (AT superficie) utilizzando un algoritmo di minimi quadrati all&#39;interno del programma MATLAB 12,18. </li><li> Calcolare la conduzione di vettore utilizzando le formule seguenti Formula 1: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formula 2: θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)] NOTA: Ve è un vettore CV proiettata a xey assi; dx / dt è la proiezione del vettore CV in asse x; dy / dt è la proiezione del vettore CV in asse y. T è la superficie AT; x, y riferiscono alla 2-D coordinate; T x = ∂T / ∂x è la derivata parziale di T rispetto ax; T y = ∂T / ∂y è la derivata parziale di T rispetto a y; θ è la direzione finale di un vettore CV. </li><li> Gruppo tutti i vettori della matrice AT in 36 percorsi, ciascuno dei quali copre un settore di dieci gradi sulla bussola. &lt;/ Li&gt; <li> Selezionare il percorso che contiene la più grande popolazione dei vettori CV tra le 36 vie di conduzione. Calcolare il CV medio di questa via per rappresentare il CV del monostrato. </li></ol></li></ol> 6. Visualizzazione della propagazione delle onde anteriore <ol><li> Normalizzare l&#39;intensità di un potenziale d&#39;azione individuale o Ca transitoria a differenti tempi di registrazione relativi al suo valore di picco utilizzando il software MATLAB segnale. </li><li> Temporaneamente memorizzare i dati di intensità normalizzate di ogni punto di tempo registrato in una matrice di 16 x 16 intensità nel software MATLAB utilizzato. </li><li> Costruire una mappa di intensità codice colore dalla matrice intensità memorizzato di ogni punto di tempo di registrazione utilizzando la funzione surf.m. NOTA: Nella mappa intensità, rosso rappresenta elevata intensità del V mo segnali Ca, e blu riflette bassa intensità dei segnali di fluorescenza. </li><li> Creare un file .avi utilizzando la funzione avifile.m. </li><li> Salva tutto l&#39;imappe ntensity in diversi momenti della registrazione del potenziale d&#39;azione o Ca transitoria con la funzione addframe.m. NOTA: A questo punto, verranno generati due file avi separati di V m e Ca propagazione. </li></ol>

<ol>
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No conflicts of interest declared.

Questo articolo descrive gli aspetti chiave della mappatura ottica in una colta HL-1 atriale myocyte monostrato colorati con coloranti fluorescenti sensibili di calcio e di tensione. Esso comprende coltura un ottimo HL-1 monostrato cellulare, l&#39;installazione delle apparecchiature di mappatura, mappando un monostrato colta, e l&#39;analisi dei dati. Per mappare con successo cellule in coltura, la chiave è quello di preparare un monostrato cellulare uniformemente distribuito. Quando la se...

Un calcio unico (Ca) e la tensione (V m) doppia mappatura ottica del canale tecnica 1-5 sta emergendo come uno strumento efficace per registrare simultaneamente i segnali V m e Ca sia cuori intatti e monostrati di cellule in coltura. Questa tecnica permette di ottenere informazioni potenti sul rapporto tra transienti di calcio e potenziali di azione per meglio comprendere i meccanismi elettrofisiologici sottostanti di aritmie cardiache. Monostrati di cellule in coltura hanno dimostrato di essere un modello cellulare utile per studiare elettrofisiologia cardiaca e il meccanismo alla base di aritmie. 4,6-8 HL-1 le cellule sono una linea di cultura myocyte atriale ben caratterizzato. Cellule HL-1 mantengono anche un genotipo e fenotipo differenziato in modo univoco che include morfologica, elettrofisiologico, e le caratteristiche farmacologiche di miociti atriali adulti. Queste cellule esprimono geni e proteine ​​cardiache, tra cui important canali ionici cardiaci (ie, L- e canali del calcio di tipo T) 9 e isoforme maturi di proteine ​​contrattili sarcomeriche normalmente presenti nei miociti atriali adulti come gli altri e ci hanno già segnalato. 10-13 Inoltre, HL-1 le cellule possono essere colta per formare un 2-dimensionale (2-D) miociti monostrato. Così, i vantaggi dell&#39;utilizzo di colture monostrato HL-1 sono: 1) il costo relativamente più basso e più facile da mantenere una linea di cultura miociti di isolare e coltura miociti neonatali primarie; 2) un monostrato confluente di cellule riduce la complessità strutturale che derivano dalla struttura 3-D del cuore; 3) un monostrato di cellule in grado di eliminare l&#39;interferenza della fibrosi interstiziale che si verifica nel cuore intatta. Questo può essere utilizzato per analizzare specifiche funzioni elettrofisiologiche di un gruppo di miociti senza interferenze di fibroblasti e matrice interstiziale; 4) valutazione delle conseguenze funzionali di manipolazione farmacologica o genetica in culmonostrati cellulari turati possono essere efficacemente raggiunti. Pertanto, HL-1 le cellule sono diventate un modello cellulare ampiamente utilizzato per studiare diversi aspetti della fisiologia miociti e attività elettriche anormali stimolazione indotta. 13-16 Tuttavia, la gestione e la cura speciale è richiesto per la cultura monostrati di cellule sane che rispondono a esterni La stimolazione elettrica per gli studi di mappatura ottica. Inoltre, la doppia procedura di tintura colorazione fluorescente potrebbe facilmente danneggiare l&#39;integrità della coltura monostrati di cellule confluenti. Pertanto, l&#39;esecuzione di V m / CA a doppio canale di mappatura ottica in coltura HL-1 monolayers è stata una grande sfida. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di fornire i passaggi chiave per l&#39;esecuzione con successo doppia mappatura ottica del canale in coltura HL-1 monostrati. Qui abbiamo fornito ampi dettagli su un protocollo ottimizzato per la preparazione monostrato HL-1 cellule, doppia mappatura ottica canale di un monostrato di cellule in coltura, e l&#39;elaborazione dei dati di mappatura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhod2 dry powder</td>
			<td style="width:103px;">&#160;AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pluronic</td>
			<td style="width:103px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">20050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rh237</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">&#160;S-1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPEs</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

Mappatura ottico ha dimostrato di essere una tecnica utile per rilevare l&#39;attività elettrica cardiaca sia cuori intatta ex vivo e in monostrati miociti in coltura. Cellule HL-1 sono stati ampiamente utilizzati come un modello cellulare 2-dimensionale per studiare diversi aspetti della fisiologia cardiaca. Tuttavia, è stata una grande sfida per la mappa otticamente calcio (Ca) transienti e potenziali d&#39;azione contemporaneamente dallo stesso campo visivo in una colta HL-1 monostrato cellulare atriale. Questo perché è necessario trattamento e la cura speciale per preparare le cellule sane che possono essere catturati elettricamente e otticamente mappate. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di lavoro ottimale per la doppia mappatura ottica del canale. In questo manoscritto, abbiamo descritto in dettaglio come eseguire l&#39;esperimento di mappatura ottica doppio canale. Questo protocollo è uno strumento utile per migliorare la comprensione del potenziale d&#39;azione propagazione e cinetica Ca in sviluppo aritmia.

Un confluenti monostrato colto presenta un ritmo intrinseco regolare come dimostrato in Movie 1. Abbiamo quindi effettuato V m / Ca doppia mappatura ottica del canale in una completamente confluenti HL-1 monostrato. Figura 1A mostra esempi di tracce di V m e segnali Ca da una registrazione singola battere. Mappe isocrone rappresentativi di propagazione uniforme V m e segnali Ca utilizzando il sistema duale mappatura ottica canale sono mostrate nelle <str...

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Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Video: Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Manutenzione e pulizia adeguata del microscopio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Ricerca

Biologia

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

La registrazione ottica di attività elettrica in Guinea-maiale Reti enterici utilizzando tensione sensibile Coloranti

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Fotoconversione di proteine ​​purificate fluorescenti ed evidenziazione ottica dual-sonda in cellule vive

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

Riepilogo

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Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

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Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

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