Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede 2R01 GM53132 e P50 GM071558.

1. Celle di carico con indicatori di calcio <ol><li> Cellule piastra in piatti di 35 millimetri dal fondo di vetro MatTek (o qualsiasi altro fondo di vetro visione camere). </li><li> In caso di utilizzo primario cappotto miociti delle camere 1 giorno prima con 10μg/ml laminina. Miociti cardiaci piastra (isolata da cani adulti, ratti neonati, o altro organismo) in KB del buffer (K-inversione del buffer Tyrode 35 mmol / L di HEPES, 140 mmol / L di KCl, 8 mmol / L di KHCO 3, 2 mmol / L di MgCl 2, e 0,4 mmol / L di KH 2 PO 4, pH 7,5) e il cambiamento in modo graduale per M199 media integrato con il 15% di siero fetale bovino e 1% e 0,5% streptamycin gentamicina e incubare a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Incubare le cellule con il calcio verde AM (1-5 mM; Molecular Probes) o qualsiasi altro indicatore di calcio desiderato per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire il piatto con un foglio di alluminio per evitare photobleaching del colorante. </li><li> Lavare le cellule tre volte con Leibovitz15 media con 14mm EGTA (se si esegue esperimenti di calcio) o qualsiasi altro supporto di visualizzazione appropriata. </li><li> Incubare per altri 30-45 minuti in media Leibovitz15 containing14mM EGTA. </li><li> Se il test gli effetti di inibitori (ad esempio 10μM U73122 PLC inibitore) vengono aggiunti durante la seconda incubazione. </li></ol> 2. Cellule Microinjecting <ol><li> Cardiomiociti cultura in piatti con fondo trasparente MatTek (o altre camere di linea) per 24 ore. </li><li> Modificare il medio-fenolo libero Leibovitz-15 con 14 mM EGTA (cardiomiociti devono essere iniettati nel calcio di media liberi, altre cellule può essere iniettato in media contenenti calcio). </li><li> Preparare la soluzione microiniezione - i nostri studi hanno utilizzato un peptide che elimina Gα q - interazioni caveolae. Tenete presente che solo una piccola quantità di volume è iniettato nella cellula (~ fl) e così le scorte ragionevolmente concentrato deve essere utilizzato. Abbiamo usato 2 mM di questo peptide, CAV3-patibolo, con DAPI di calcio senza medium. DAPI è un blue colorante che macchia il nucleo e permette l&#39;identificazione di cellule che sono state microiniettati. DAPI non interferisce con la fluorescenza di molti indicatori di calcio. La quantità di DAPI è variabile e generalmente usiamo abbastanza per visualizzare il nucleo (0,5 e 2 mM) </li><li> Preparare la soluzione di controllo contenente DAPI - il tracciante colorante da solo. </li><li> Per microiniezioni utilizzare aghi di auto-tirata o disponibili in commercio. Pratica con iniezione colorante per determinare i parametri ago corretta. Prendiamo atto che le cellule differenti possono richiedere diametri ago diverso e pressioni microiniezione. </li><li> Usare il sistema automatizzato microiniezione, per esempio un NI2 InjectMan con una pompa FemtoJet da Eppendorf. Impostare la pressione di iniezione P i a 90 hPa, e la compensazione della pressione P C a 45 hPa. Impostare il tempo t di iniezione a 0,7 s. Regolare i parametri di iniezione come necessità. </li><li> Effettuare microiniezioni su un microscopio invertito (ad esempio Zeiss Axiovert 200M) dotata di obiettivo lavoro lungo contrasto di fase a distanza (ad esempio fase aerea 40x obiettivo 2). </li><li> Iniettare le cellule maggior numero possibile in modo rapido. Esaminare le cellule iniettate con il contrasto di fase per selezionare cellule vitali. </li></ol> 3. Co-immunofluorescenza studi <ol><li> Lavare le cellule due volte con PBS e fissare con il 3,7% paraformaldeide per 30 minuti. Se necessario, le cellule possono essere stimolate prima fissazione. </li><li> Lavare le cellule fissate tre volte con PBS, e incubare con il 0,2% NP40 in PBS per 5 minuti. </li><li> Blocco con PBS contenente siero di capra al 4% (o altro siero del caso) per 1 ora. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;anticorpo primario ad una diluizione appropriata con siero di capra 1% in PBS per 1 ora. </li><li> Lavare le cellule per tre volte per 10 minuti con 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 seguita da aggiunta di fluorescenza marcata con anticorpo secondario, come Alexa-Fluor-488 anti-coniglio o Alexa-Fluor-647 anti-topo anticorpo secondario diluito a 1: 1000 1% siero di capra in PBS (notare che quando sondaggio per due diverse proteine ​​gli anticorpi primario deve essere allevato in diverse specie e il secondario deve essere contro le specie corrispondente). </li><li> Incubare a 37 ° C per 1 ora, lavare tre volte con TBS. </li><li> Vedi le cellule in TBS buffer o altro supporto di visualizzazione appropriato. </li></ol> 4. Calcio di imaging veloce <ol><li> Usa microscopio confocale a scansione laser (per esempio Fluoview 1000 Olympus). </li><li> Utilizzare alto obiettivo apertura numerica. </li><li> Impostare i parametri di acquisizione. Per utilizzare il calcio verde 488 nm di eccitazione e di lunga passare 515 filtri di emissione. </li><li> Regolare il tempo di pixel - per misurazioni di calcio veloce è impostato a 2 ms / pixel. </li><li> Impostare lo zoom dell&#39;immagine per raggiungere dimensioni dei pixel di 0,05 - 0,3 micron. </li><li> Selezionare una linea da una cella di scelta in una determinata regione. </li><li> Nella finestra di controllo volta selezionate tempo di acquisizione per almeno 1500 scansioni (per ottenere desiderato arco di tempo dila risposta - 1,3 ms / linea produrrebbe 2 secondi). </li><li> Sfondo registrare la lettura prima della stimolazione. </li><li> Stimolano le cellule con 5 carbacolo mM ed iniziare immediatamente la registrazione dei dati. Mantenere le cellule in 1 ml di Leibovitz15 media, preparare 10 carbacolo micron di Leibovitz15 e aggiungere delicatamente 1 mL nel piatto </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Estrarre l&#39;intensità per ogni pixel di immagine registrata. Salvare i dati di intensità, come una tabella utilizzando il software Fluoview 1000. </li><li> Importazione di dati di intensità in SigmaPlot o una simile analisi dei dati di programma e bin i dati in ~ 9-40 cassonetti. Confronta con esperimenti di controllo e il rumore elettronico. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Abbiamo ripreso celle microscopio confocale a scansione laser LSM510 (Zeiss, Jena, Germania) dotato di multi-linea eccitazione laser e un obiettivo apocromatico 40x/1.2 NA immersione in acqua. In fig. 1 (rossa) ci mostrano la distribution caveolae in cardiomiociti adulti canino ventricolare che sono state fissate e colorate con un anticorpo di caveolina-3, che è la maggiore proteina strutturale caveolari in queste cellule 9. Caveolina-3 è stato immunolabelled con Alexa-647 ed eccitato con la 633-nm linea da un Lui: Ne laser. Le immagini sono state registrate utilizzando LP650 filtro per le emissioni nm. La distribuzione della caveolina-3 è stato confrontato con Gα q che è stata immunolabeled con Alexa-488 (verde). Alexa-488 è stato eccitato con 488 nm Argon-laser a ioni di linea e l&#39;immagine è stata registrata usando filtro per le emissioni BP505-530nm. In queste misurazioni colocalizzazione, i due fluorofori erano eccitati in maniera sequenziale utilizzando acquisizione Multi Track. Questa procedura riduce al minimo canale di cross-talk. L&#39;analisi dei dati per colocalizzazione è stata eseguita utilizzando il software fornito con AIM Zeiss LSM510-Meta. Come si può vedere, le due proteine ​​sono colocalized. Per determinare la modalità di accoppiamento tra caveolina-3 e Gα <sub&gt; q sui segnali di calcio, abbiamo effettuato studi di imaging di calcio su un sistema di microscopia confocale a scansione laser (Fluoview, Olympus, Tokyo, Giappone) accoppiato ad un microscopio invertito (IX70, Olympus) con un obiettivo 40x (UPlanApo, Olympus, apertura numerica 1,3), anche se queste misurazioni possono essere eseguite anche sui sistemi Zeis descritto sopra. Per queste misurazioni, le cellule sono state cariche di Ca 2 + Verde. Siamo entusiasti del colorante con un laser a ioni argon 488 nm e raccolte le immagini attraverso un filtro LP515 emissioni. Cornici immagine sono stati raccolti a intervalli di 500 ms. Valori di intensità per ogni pixel sono stati estratti utilizzando il software Olympus e ImageJ. La modalità di scansione linea è stata utilizzata per l&#39;analisi quantitativa dei più veloci transienti di Ca 2 + e Ca 2 + scintille. La dimensione dei pixel utilizzati nel presente studio era 0,1-0,3 micron. La line-scan tasso era di circa diverse centinaia di ms per riga. In fig. 2 si mostra una scansione di una linea di Ca 2 + verde-caricato cardiomiociti in cui il pixel dtempo ben è stato di 2 ms, il tempo di linea è stata di 142 ms. L&#39;immagine è composta da 1200 linee. Ogni riga della scansione corrisponde alla fluttuazione intensità di Ca 2 + verde composto da 71 punti presi in un intervallo di 142 ms, e può essere usato come un rapido read-out per le risposte di calcio. Per esempio, nella fig. 3 si mostrano le attività di Ca 2 + di una singola linea di un individuo cardiomiociti, come misurato da Ca 2 + intensità di fluorescenza verde in funzione del tempo in secondi prima (in alto) e dopo (in basso) l&#39;aggiunta di 5 mM carbacolo che esalta il livello intracellulare di Ca 2 + attraverso Gα q-PLCβ attività. Quando le linee sono molti media, la stimolazione carbacolo produce un aumento di ~ 1,8 volte a Ca 2 + intensità verde. A causa di variazioni nelle condizioni sperimentali (temperatura ambiente, potenza del laser, la risposta del rivelatore, distribuzioni di tintura, ecc), questo aumento non può essere visto nei singolilinea di scansione. Anche se i valori di intensità (valori asse y) sono simili, è chiaro che la trama carbacolo stimolata sul fondo ha picchi molto più ampia, corrispondente a livelli di calcio più sostenuta, oltre le cime fluttuazione ristretta visto prima stimolazione. Questo aumento ampliamento e relativa intensità oscura piccoli, oscillazioni più lente. Il nostro obiettivo è quello di discriminare meglio fra questi diversi tipi apparente delle fluttuazioni di calcio. Un altro esempio di queste fluttuazioni calcio veloce è mostrato in fig. 4. Il grafico in alto mostra i dati linea prima per cardiomiociti ventricolari stimolati (rosso) e una media di 3 tracce linea appare in bianco. Per determinare la misura in cui queste fluttuazioni di calcio sono stati mediati da Gα q - caveoline3 interazioni, abbiamo microiniettati un peptide che destabilizza caveolina-3 - Gα interazioni q (cioè CAV3 peptide) che elimina il più a lungo di Ca 2 + corrente e questi dati sono mostrati in blu(Notiamo che abbiamo sottratto 500 dal CAV3 intensità peptide modo che le due tracce possono essere meglio discernere). Abbiamo importato le colonne di dati grezzi dai nostri archivi eccellere in SigmaPlot (Jandel, Inc.) e ha svolto un&#39;analisi istogramma. In questa analisi, il numero di eventi è raggruppate in un numero uguale di scatole (bidoni) per produrre un istogramma. La larghezza di bin rappresenta un intervallo di tempo uguale. Le intensità sono inseriti nel tempo diverso si lega in modo che l&#39;altezza di un bin particolare rappresenta il numero di volte che l&#39;intensità si verifica nella finestra di tempo. Poiché questo tipo di analisi dipende solo raccogliere dati alla velocità di scansione stessa, molte tracce possono essere analizzati contemporaneamente. Inoltre, questa analisi non è sensibile alle differenze nei livelli di tintura, potenza del laser, ecc, e il rumore elettronico e il problema si presenta su scale temporali molto veloce e si vedono solo nei primi 1-2 bidoni. Il histogra corrispondentems dei dati grezzi in fig. 4 sono mostrati nella parte inferiore della pagina. L&#39;istogramma per le cellule di controllo sono distribuite su un gran numero di contenitori corrispondente a una distribuzione temporale ampio, come rappresentato dalla linea rossa (la linea è per guidare l&#39;occhio e nessun modello si presume). Al contrario, i bidoni per la risposta delle cellule in cui è stato interrotto il q-CAV3 Gα interazione peptide sono limitati a una distribuzione ristretta bin suggerendo che la presenza di peptidi elimina i flussi più lunga durata. Microiniezione di un peptide di controllo che non interrompe Gα q-CAV3 produce un istogramma simile a un-iniettato le cellule 8. In fig. 5 abbiamo confrontare le fluttuazioni di intensità veloce di Ca 2 + verde in cardiomiociti adulti ventricolare canino (a sinistra) e fresco, cardiomiociti di ratto stimolate neonatale che la mancanza caveolae (a destra). Qui, gli istogrammi corrispondenti delle intensità per un periodo di 3 minuti sono state cestinate<html> a 35 per visualizzare gli eventi di calcio più lento. Si noti che i cardiomiociti neonatali visualizzazione fluttuazioni veloce su una linea di base piatta che mostra la mancanza di lenti Ca 2 + attività, mentre una linea di base più strutturata è visto per le cellule adulte. Queste differenze sono più facilmente visibile negli istogrammi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> Immagini Figura 1. Dei cardiomiociti ventricolari cane adulto che mostra la distribuzione di Gα q immunolabeled con Alexa-488 dove era eccitato Alexa-488 con 488 nm Argon-laser a ioni di linea e l&#39;immagine è stata registrata usando filtro per le emissioni BP505-530nm. Alto a destra è l&#39;immagine stessa visione la localizzazione di caveolina-3 immunolabeled con Alexa-647, eccitato con la 633-nm linea da un Lui: Ne laser e registrati utilizzando LP650 nm emissione filtro. L&#39;immagine fusa in cui si vede colocalizzazione in arancione è in basso a sinistra con un&#39;immagine estesa a destra. <html> &quot;Pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> Figura 2. Immagini di calcio, di cardiomiociti vita canina ventricolare adulti carichi di Ca 2 + Verde. L&#39;immagine è stata scattata su un sistema di microscopia confocale a scansione laser con un obiettivo 40x utilizzando un laser a ioni argon 488 nm ed un filtro per le emissioni LP515. L&#39;immagine è composta da 1200 linee, il pixel tempo di permanenza è stato di 2 ms, e la dimensione dei pixel è stata di 0,1 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> Figura 3. Fluttuazioni di intensità superiore di una linea da una traccia di vita canina cardiomiociti ventricolari adulti carichi di Ca 2 + Green e immaginato come descritto, e sotto la stessa cella stimolata dalla carbacolo aggiunta di 5 micron. <html> / 3505fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. TOP Un esempio di traccia linea da una vita canina cardiomiociti ventricolari adulti carichi di Ca 2 + verde (rossa) preso più di 180 ms in cui viene mostrata la media di 3 tracce come una linea nera, e rispetto a una cella che è stata microiniettati con un peptide che sconvolge Gα q caveolina-3 associazione (rosso), dove una media di tre tracce è in nero. Notiamo che abbiamo sottratto 400 conteggi intensità dalla serie inferiore di dati per scopi di visualizzazione. I pannelli inferiori sono gli istogrammi corrispondenti dei dati cestinate come descritto nel testo, e dove il numero di bin è arbitraria e il numero di bin (o semplicemente contare) corrisponde alla quantità totale di intensità che bin particolare. Prendiamo atto che le linee linee rossa e blu disegnate nel controllo (a sinistra) e peptide (a destra) sono istogrammi per consentire una più facile identificazione e confronto dei dati e nessun modello è assunto. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Fluttuazioni di intensità di Ca 2 + verde in cardiomiociti adulti ventricolare canino (a sinistra) e fresco, cardiomiociti di ratto stimolate neonatale che la mancanza caveolae (a destra) ed i loro istogrammi corrispondenti sono riportati di seguito.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare ed isolare i segnali di calcio rapido cardiomiociti viventi. Mentre le condizioni sperimentali di queste misurazioni sono state precedentemente applicata ai sistemi cellulari altri 10 così come cardiomiociti 11, l&#39;utilizzo di istogrammi e di analisi bin consente ai dati di molti Ca 2 + eventi da acquisire. Più veloce eventi possono essere facilmente isolate da quelli lenti e modelli adattati a comprendere i meccanismi sottostanti. Cardi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomiociti hanno più Ca 2 + flussi di durata variabile che lavorano insieme per ottimizzare 1,2 funzione. Variazioni di Ca 2 + attività in risposta ad agenti extracellulare è prevalentemente regolata dalla fosfolipasi Cβ-Gα percorso q localizzato sulla membrana plasmatica, che è stimolata da agenti come l&#39;acetilcolina 3,4. Abbiamo recentemente scoperto che i domini delle proteine ​​della membrana plasmatica chiamato caveolae 5,6 può intrappolare attivato Gα q 7. Questo intrappolamento ha l&#39;effetto di stabilizzare lo stato di attivazione Gα q e conseguente prolungata Ca 2 + segnali in cardiomiociti e altri tipi di cellule 8. Abbiamo scoperto questo sorprendente risultato misurando le risposte di calcio dinamica su scala veloce in cardiomiociti viventi. In breve, le cellule vengono caricati con un indicatore fluorescente Ca 2 +. Nei nostri studi, abbiamo usato Ca 2 + Verde (Invitrogen, inc.) che mostra un aumento di intensità di emissione di fluorescenza dal legame di ioni calcio. L&#39;intensità della fluorescenza è quindi registrato per l&#39;utilizzo di una linea-modalità di scansione di un microscopio confocale a scansione laser. Questo metodo permette una rapida acquisizione della durata di intensità di fluorescenza in pixel lungo una retta, la produzione di diverse centinaia di tracce tempo sulla scala temporale microsecondo. Queste tracce sono molto veloci trasferiti in Excel e poi in SigmaPlot per l&#39;analisi, e sono confrontati con le tracce ottenute per il rumore elettronico, senza coloranti e altri controlli. Per sezionare Ca 2 + risposte di tassi di flusso differenti, abbiamo effettuato una analisi istogramma che cestinate intensità di pixel con il tempo. Binning ci permette di raggruppare più di 500 tracce di scansioni e visualizzare i risultati compilato spazialmente e temporalmente in un unico appezzamento. Così, il lento Ca 2 + che le onde sono difficili da discernere quando le scansioni sono sovrapposti a causa di diversi posizionamento di picco e rumore, può essere facilmente visto ingli istogrammi cestinate. Flussi molto veloce nella scala temporale della misura mostrano una stretta distribuzione di intensità nelle celle tempi molto brevi, mentre più di Ca 2 + onde mostrare i dati cestinate con una distribuzione più ampia cassonetti tempo più lungo. Queste distribuzioni di tempo diversi ci permettono di analizzare i tempi di Ca 2 + flussi nelle cellule, e di determinare il loro impatto sui vari eventi cellulari.

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Vi presentiamo un metodo per isolare rapido (microsecondi) eventi di calcio da più lenti flussi nelle cellule viventi mediante microscopia confocale a scansione laser. Il metodo di misura fluttuazioni di intensità di fluorescenza di indicatori di calcio da scansioni di registrazione linea di diverse centinaia di pixel in una cella. Analisi istogramma permette di isolare la scale temporali dei flussi di calcio diverse.

Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

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Research

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Biology

15.1K Views.  Queensborough Community College. Vi presentiamo un metodo per isolare rapido (microsecondi) eventi di calcio da più lenti flussi nelle cellule viventi mediante microscopia confocale a scansione laser. Il metodo di misura fluttuazioni di intensità di fluorescenza di indicatori di calcio da scansioni di registrazione linea di diverse centinaia di pixel in una cella. Analisi istogramma permette di isolare la scale temporali dei flussi di calcio diverse.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

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Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.