Questo lavoro è stato sostenuto da un consiglio scientifico di ricerca scientifica del Canada (NSERC) Discovery Grant # 40352, Campus Alberta per l&#39;Innovation Program Chair, Alberta Alzheimer Research Program a MHM e NSERC CREATE in borsa di dottorato BIF e borsa di studio post-laurea AIHS a MK. Ringraziamo Pu Min Wang per lo sviluppo di questo protocollo e per la formazione chirurgica, e Behroo Mirza Agha e Di Shao per la carriera.

<html> Il seguente protocollo segue l&#39;Università del Comitato Animal Care Lethbridge (ACC) le linee guida, ed è condotta in conformità con gli standard del Consiglio canadese Animal Care (CCAC). 1. Preparazione <ol><li> Per periodi di tempo prolungati, autoclave tutte le forniture chirurgiche aperte e garantire che la sterilità viene mantenuta per tutta la chirurgia. Se sono necessari più interventi chirurgici, autoclave tra interventi chirurgici. </li><li> Assicurarsi che ci sia un sacco di tampone cervello a portata di mano (almeno 50 mL). La soluzione è composta da 134 mM cloruro di sodio, 5,4 mM di potassio, 1 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 1,8 mM di cloruro di calcio diidrato, e 5 mM HEPES sodio, pH bilanciato a 7,4 con acido 5 M di idrogeno. </li><li> Posizionare il mouse in una camera di induzione e anestetizzare con 3 - 4% isoflurano. Seguire con 1,0-2,0% isoflurano per la manutenzione durante l&#39;intervento chirurgico. Ridurre ulteriormente a partire allo 0,4 - 0,8% durante l&#39;imagingS = &quot;xref&quot;&gt; 5 , 13 , 14 , 15 , a condizione che venga mantenuta un&#39;anestesia adeguata. Questi bassi livelli di anestesia necessitano di monitoraggio vigile e frequente del mouse (circa ogni 5 min) per assicurarsi che rimangano muscolosi agli stimoli dolorosi. NOTA: La disidratazione può diventare problematica a causa dell&#39;elevato rapporto tra superficie e volume del topo ed esacerbato dall&#39;uso prolungato di isoflurano. <ol><li> Utilizzare iniezioni sottocutanee di soluzione salina, 0,1 ml per 10 g di peso corporeo, ogni 1 - 2 h. Quando opportunamente idratato, il mouse urinerà una volta ogni 1 - 2 h. </li></ol></li><li> Monitorare attentamente il mouse per garantire un&#39;anestesia coerente durante l&#39;intervento chirurgico e l&#39;imaging. Non lasciare il mouse incustodito e prendersi cura di non riprendere mai la coscienza. </li><li> Trasferire il mouse anestetizzato sul set di testa e posizionarlo su un pannello di riscaldamento termoregolatore impostato a 37 ° C. Fissare il tetto superioreh in un supporto denti. </li><li> Ruotare la testa del mouse verso sinistra di circa 30 ° per esporre la parte laterale destra della testa e fissare la testa del topo con l&#39;estremità smussata di barre orecchio (Figura 1A). </li><li> Applicare una pomata oftalmica per evitare l&#39;essiccazione della cornea. </li><li> Per ridurre l&#39;edema cerebrale, iniettare desametasone (4 mg / kg) per via intramuscolare. </li><li> Pulire la pelle sopra l&#39;area chirurgica con tamponi di cotone imbevuto 4% clorexidina (3 volte) e 70% di etanolo (3 volte). Utilizzare ogni tampone di cotone solo una volta. </li><li> Munirsi di guanti chirurgici e coprire l&#39;animale con la pellicola adesiva. Fornire anestetico locale iniettando di lidocaina (8 - 10 mg / kg; 2% epinefrina) per via sottocutanea sul sito craniotomia. Attendere 3-5 minuti per il farmaco di essere assorbito nel tessuto. </li></ol> 2. Rimozione della pelle e retrazione del muscolo dal cranio <ol><li> Eseguire quasi tutte queste procedure durante la visualizzazione del cranio, sotto undissezione microscopio (ad esempio, 0,7 - 4,5 x alimentazione, a seconda della situazione). </li><li> Sollevare la pelle 1 mm a sinistra della linea mediana (appena dietro l&#39;orecchio) con una pinza e fare una piccola incisione orizzontale con le forbici chirurgiche. </li><li> Fare un 5 - taglio laterale 6 mm verso l&#39;orecchio destro, e poi tagliare verso la fine rostrale della testa. </li><li> Al punto di incisione iniziale, inserire le forbici e tagliare 10 mm rostralmente. </li><li> Tagliare la pelle intorno l&#39;orecchio destro, vicino l&#39;occhio destro per esporre il lato destro del cranio e muscolo temporale. Assicurarsi che la parte più larga della zona esposta è di almeno 7 mm. Tagliare la pelle ulteriormente se l&#39;area chirurgica deve essere estesa. </li><li> Fissare la pelle intorno l&#39;incisione mettendo alcune gocce di cianoacrilato colla butilica tra il cranio e la pelle. Garantire che il tessuto è stato preventivamente essiccato con applicatori di cotone punta o tessuti laminati per aumentare l&#39;efficacia dell&#39;adesivo. </li><li> Usando un tampone di cotone, strofinare la superficiedel cranio in un movimento circolare per rimuovere il periostio dal cranio. Assicurarsi che nessuno rimanga asciugando completamente il cranio. </li><li> Utilizzando forbici e pinze a molla, separare il muscolo temporale dal cranio; tagliare e ritrarre il muscolo lateralmente fino all&#39;osso squammoso (Figura 1C). Prestare la massima attenzione a non danneggiare la vena temporale superficiale che costeggia il livello dell&#39;osso squamosal vicino all&#39;occhio, in caso contrario potrebbero verificarsi emorragia. </li><li> Controllo emorragia con schiuma gel pre-impregnato in tampone cervello. Per grave emorragia utilizzare un cauterizer di calore. Goccia cianoacrilato colla butilica sui siti di sanguinamento dopo il trattamento con il calore cauterizer. Assicurarsi che l&#39;area viene essiccato preventivamente mediante applicatori punta di cotone o tessuti laminati per aumentare l&#39;efficacia dell&#39;adesivo. </li></ol> 3. Craniotomia NOTA: Il chirurgo deve rimanere diligente durante la rimozione del cranio eDura per evitare complicazioni inutili. Le procedure di risoluzione dei problemi sono incluse in caso di complicazioni. <ol><li> Segnare la posizione del bregma con un indicatore fine o tagliare un nastro piccolo pezzo triangolare e puntare un angolo a bregma ( Figura 2A ) per orientare le regioni del cervello sottostanti. </li><li> Prima di apporre la testa, assicurarsi che il cranio sia completamente asciutto. Il cranio si asciuga rapidamente dopo l&#39;applicazione della schiuma gel immersa nel tampone del cervello, se è necessario un maggiore essiccamento, utilizzare tamponi di punta di cotone. Questo passaggio è fondamentale per la fissazione della lastra di testa ( figura 1B ). NOTA: Se sul teschio rimane del periosteo o se il cranio non è asciutto prima di incollare sulla piastra di testa, probabilmente si stacca. Se ciò accade, rimuovere delicatamente la piastra di testa e ricominciare. Durante questo processo si può verificare il sanguinamento; Lasciare qualche minuto per coagulare e quindi togliere delicatamente. Questo processo non è raccomandato per essere ripetuto più di due volte. </li> &lt;li&gt; Applicare la colla etilcianoacrilato attorno al bordo inferiore della piastra di testa 16, ed incollare la piastra di testa sopra la zona craniotomia (Figura 1D e Figura 2A). </li><li> Riempire lo spazio tra la piastra di apertura cranio e la testa con cemento dentale lasciando solo la zona craniotomia esposta. Attendere per il cemento dentale per asciugare e indurire, tipicamente 5 - 10 min (Figura 2B). <ol><li> Una volta che il cemento è impostato, brevemente riempire il pozzetto con tampone cervello e lasciare agire da 3 - 5 min. Utilizzare un tessuto laminato per rimuovere il tampone cervello prima perforazione (Figura 2C). </li></ol></li><li> Delineare l&#39;area chirurgica con una leggera segnando la superficie del cranio con un trapano dentistico. Utilizzare un martello pneumatico (impostato al massimo di 20 PSI), con un FG ¼ bava, e controllato con un pedale velocità variabile. </li><li> Delicatamente tracciare il trapano lungo il punteggio originale per approfondirla, eARANTIRE il trapano non penetra attraverso il cranio nel cervello (Figura 2D). A turno ogni pochi minuti tra foratura e tamponando la superficie del cranio con i tessuti laminati inumidite. Questo ridurrà il riscaldamento ed essiccamento del cranio da attrito meccanico ed esposizione prolungata. NOTA: Il cranio andrà in onda rapidamente asciutta dopo l&#39;applicazione della schiuma gel bagnato. Se è necessario più di essiccazione, utilizzare tamponi di cotone punta. Attenzione: Il cranio è uniforme di spessore. Ad esempio, la cresta parietale-temporale è la zona più spessa, mentre le regioni cranio vicino alla linea mediana e monumenti squammoso sono relativamente sottili. </li><li> Durante la perforazione, controllare periodicamente per deformazione del cranio premendo delicatamente su di esso con una pinza o la punta del trapano non in movimento. Quando l&#39;osso inizia a fibbia, smettere di foratura e immergere l&#39;intera finestra in un tampone cervello. NOTA: Se il sangue si precipita fuori di una zona, si può suggerire che la dura madre è stata danneggiata. Se questo è il caso, inserire un semi-bagnato schiuma gel sull&#39;area e cercare di assorbire il sangue mentre delicatamente applicando pressione alla schiuma gel con un tampone di punta di cotone. </li><li> Attendere almeno 5 minuti prima della rimozione del cranio per ammorbidire l&#39;osso e per ridurre la possibilità di attaccare la dura fino all&#39;osso, rendendo il processo di rimozione del cranio più facile. </li><li> Eseguire il processo di rimozione del cranio, mentre il cranio è immerso in un tampone cervello. NOTA: Se una parte del cranio rimane ostinatamente attaccato, una lama di bisturi # 11 può essere utilizzato per segnare delicatamente il cranio. Prestare la massima attenzione a non forare la lama attraverso il cranio e nel cervello. </li><li> A partire dal bordo anteriore, sollevare delicatamente il cranio allentato dalla dura madre con pinze. NOTA: se una piccola quantità di sanguinamento si verifica durante il processo di rimozione del cranio, rimuovere il buffer con una pipetta di trasferimento o una siringa, e poi sostituirlo con nuovo buffer. </li><li> Una volta che l&#39;osso è allentata e &quot;galleggiare&quot; sulla dura, afferrare saldamente l&#39;osso con una pinza e sollevare l&#39;osso dallala dura madre. Assicurarsi che l&#39;osso non penetra nel cervello. </li><li> Per controllare il sanguinamento, rotolare l&#39;angolo di un tessuto in un punto e rimuovere la maggior parte del buffer dal pozzo cranica. applicare rapidamente schiuma gel, pre-impregnato in un tampone, per la zona sanguinante aggiungendo pressione molto leggera con un tampone di punta di cotone. NOTA: Il sanguinamento di solito proviene da bordo del osso o la superficie della dura; entrambi i casi sono normali e sanguinamento si fermeranno rapidamente se senza grandi vasi sanguigni sono danneggiati. Se l&#39;emorragia continua, il sangue può riempire l&#39;intera finestra, formare un foglio coagulo sopra l&#39;area di esposizione. <ol><li> Per rimuovere il foglio di coagulo, accuratamente raccogliere pezzi di sangue coagulato dalla area di esposizione, lasciando intatto il coagulo di sangue attorno alla fonte del vaso sanguigno rottura. Fare attenzione a non rimuovere il coagulo di sangue dalla sorgente di spurgo in quanto ciò potrebbe causare ancora più perdita di sangue. Irrigare la superficie del cervello con tampone cervello per lavare via il sangue. </li><li> Fare attenzione a non toccare iltessuto cerebrale delicato o aggiungere materiale estraneo al cervello; ripetere fino emorragia si è fermata, per circa 2 - 5 minuti (figura 2E). NOTA: A questo punto, la craniotomia è pronto per la preparazione della finestra del cranio (vedi punto 5). Se necessario, rimuovere la dura prima di impiantare la finestra del cranio (vedi punto 4). </li></ol></li></ol> 4. Rimozione Dura NOTA: la rimozione Dura richiede estrema attenzione e può richiedere oltre 15 min. <ol><li> Disegnare via il tampone in eccesso dalla craniotomia. Pur mantenendo una superficie umida, afferrare un piccolo pezzo di dura con una pinza e strappare delicatamente la dura. </li><li> Utilizzare pinze e forbici molla strappare delicatamente e tagliare via la dura. </li><li> Goccia più tampone cervello sulla superficie del cervello galleggiare la dura e aiutare separato dal cervello. Continuare fino a quando tutto dura viene rimosso dal sito finestra del cranio. Quando eseguito correttamente apparirà il cervello a essere molto pulito con bl distintanavi OOD e senza macchie (confrontare figura 2E con 2F). Attenzione: Alcune aree della dura madre sono attaccati alle piccole arteriole sulla superficie del cervello (per esempio, vicino alla linea mediana prossimale alla zona associazione parietale), e la rimozione di tale possono rompersi arteriole. In questi casi, può essere meglio lasciare un piccolo pezzo di dura intatta sopra la parte superiore della arteriole. Il VSD non può penetrare quella piccola zona, ma questo è preferito avere sanguinamento maggiore. </li><li> Fissare la superficie del cervello in agarosio appena possibile per ridurre al minimo il movimento da pulsazione e prevenire ulteriore rigonfiamento (vedere la fase 5). </li></ol> 5. Preparazione cranica finestra <ol><li> Spruzzare il vetro di copertura con il 70% di etanolo e utilizzare una bombola d&#39;aria per asciugare delicatamente. Assicurarsi che il vetro sia completamente pulita senza macchie o polvere presente. </li><li> Preparare 1,3% agarosio mediante riscaldamento a 200 mg di polvere di agarosio disciolti in 15 mL di tampone cervello. Impostare il forno a micrave ad alta e calore per 10 - 15 s per volta, mescolando delicatamente in mezzo, fino a quando tutti agar è disciolto. Nota: Assicurare bolle o particelle sono presenti in quanto potrebbero interferire con l&#39;imaging. </li><li> Posizionare un termometro nel agarosio caldo e raffreddare l&#39;agarosio fino a poco sopra solidificazione di temperatura (~ 40 ° C). NOTA: Acqua corrente fredda sopra la parte esterna del contenitore agarosio può accelerare il processo di raffreddamento. Delicatamente mescolare continuamente per garantire l&#39;assenza di bolle o in presenza di particolato. </li><li> Immediatamente prima di applicare l&#39;agar, rimuovere il buffer cervello dal pozzo cranica. Redigere l&#39;agarosio con una pipetta di trasferimento e rilasciare l&#39;agarosio direttamente sul cervello. posizionare rapidamente il vetrino sulla superficie e fissare il vetrino con agarosio gocce sugli angoli. </li></ol> 6. eutanasia NOTA: i chirurghi Nella nostra esperienza, questa procedura richiede sperimentato almeno 3 - 4 ambulatori di pratica per raggiungere più del 90%tasso di successo. Meno chirurghi esperti potrebbero richiedere ancora più pratica. Durante la craniotomia o durotomia, il cervello può subire danni, come ad esempio se i punzoni di perforazione attraverso l&#39;osso nel cervello. Certo danno minore al bordo della craniotomia può essere consentita. Tuttavia, se il cervello non ha un aspetto &quot;pulito&quot; con brillanti vasi sanguigni intatti rossi e la corteccia bianca, l&#39;esperimento può avere bisogno di essere terminato. Esempi di preparazioni povere includono quelli con i vasi sanguigni morti, o quando la corteccia è contrassegnata con vasi sanguigni strappati o danneggiati. Se uno qualsiasi di questi segni sono presenti, l&#39;esperimento sarà improbabile produrre dati di alta qualità. Se l&#39;intervento chirurgico / esperimento ha avuto successo o meno, umanamente eutanasia il mouse al termine dell&#39;esperimento. <ol><li> Profondamente anestetizzare con almeno il 3,5% isoflurano. Quindi, dare un&#39;iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico a 300 mg / kg. Idealmente, se l&#39;ago viene inserito nel fegato, morte sarà molto rapida (&lt;1 min). </li><li> Se è richiesta la perfusione, verificare che l&#39;animale è anestetizzato profondamente prima di procedere (vedi passo 1.3). </li><li> In alternativa, se la perfusione non è richiesto, attendere un minimo di 5 min e quindi verificare che il mouse è morto. Confermare l&#39;assenza di respirazione, battito cardiaco, così come la mancanza di recesso dolore e riflessi corneali. Inoltre, per osservare azzurro / colorazione bianco di estremità e oscuramento dei vasi sanguigni sulla corteccia. </li></ol>

<ol>
	<li>Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+rapid+redistribution+of+sensory-evoked+depolarization+through+existing+cortical+pathways+after+targeted+stroke+in+mice.">Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+basis+for+the+robust+distribution+of+blood+to+rodent+neocortex.">Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).</li><li>Mohajerani, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+cortical+activity+alternates+between+motifs+defined+by+regional+axonal+projections.">Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections.</a> Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).</li><li>Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirrored+bilateral+slow-wave+cortical+activity+within+local+circuits+revealed+by+fast+bihemispheric+voltage-sensitive+dye+imaging+in+anesthetized+and+awake+mice.">Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice.</a> J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).</li><li>Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+voltage-sensitive+dye+imaging+of+rat+cortical+activity+with+high+signal-to-noise+ratio.">Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio.</a> J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).</li><li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+imaging+reveals+dynamic+spatiotemporal+properties+of+cortical+activity+after+spontaneous+muscle+twitches+in+the+newborn+rat.">Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat.</a> J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).</li><li>Sweetnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+impairs+cortical+plasticity+and+functional+recovery+following+ischemic+stroke.">Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke.</a> J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).</li><li>Yin, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+field+recordings+effectively+monitor+the+mouse+cortex+and+hippocampus+under+isoflurane+anesthesia.">In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia.</a> Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).</li><li>Sharp, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+stimulus-evoked+cerebral+hemodynamics+in+the+awake+mouse+and+under+a+novel+anesthetic+regime.">Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime.</a> Scientific Reports. 5, 12621 (2015).</li><li>Kyweriga, M., Mohajerani, M. H., Kianianmomeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+Methods+and+Protocols.">Optogenetics: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1408, 251-265 (2016).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , (2005).</li><li>Vanni, M. P., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscale+transcranial+spontaneous+activity+mapping+in+GCaMP3+transgenic+mice+reveals+extensive+reciprocal+connections+between+areas+of+somatomotor+cortex.">Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex.</a> J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+High-Frequency+Mesoscale+Intracortical+Maps+Using+the+Genetically+Encoded+Glutamate+Sensor+iGluSnFR.">Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR.</a> J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).</li><li>Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscale+infraslow+spontaneous+membrane+potential+fluctuations+recapitulate+high-frequency+activity+cortical+motifs.">Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs.</a> Nat Commun. 6, 7738 (2015).</li><li>Lim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Large-Scale+Cortical+Mapping+Using+Channelrhodopsin-2+Stimulation+in+Transgenic+Mice+Reveals+Asymmetric+and+Reciprocal+Relationships+between+Cortical+Areas.">In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas.</a> Front Neural Circuits. 6, (2012).</li><li>Ferezou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+cortical+sensorimotor+integration+in+behaving+mice.">Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice.</a> Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).</li><li>Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mini-strokes+produce+changes+in+interhemispheric+sensory+signal+processing+that+are+indicative+of+disinhibition+within+minutes.">Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance.">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo innovativo per una grande finestra cranica permette l&#39;imaging simultaneo sulle zone temporali e parietali della corteccia cerebrale. Combinato con imaging ottico, può aiutare a rivelare dinamiche neurali all&#39;interno di aree corticali durante l&#39;attività spontanea e stimolo-indotta. Questo craniotomia espansiva espone anche una grande estensione della rete vascolare corticale, tra cui l&#39;estremità prossimale dell&#39;arteria cerebrale media (MCA), consentendo imaging in vivo de...

Craniotomia è una procedura standard utilizzato da neuroscienziati per rivelare una porzione del cervello. Sin dagli albori della elettrofisiologia, la craniotomia ha consentito innovazioni senza precedenti nel campo delle neuroscienze. mappatura densa della corteccia cerebrale con elettrodi ha portato ad ipotesi esperimenti di prova e teorie basate su queste mappe. Abbiamo recentemente entrati in una nuova era in cui la craniotomia è utilizzata per l&#39;imaging in vivo del flusso sanguigno corticale 1, 2, 3 e architettura neurovascolari 4, permettendo la visualizzazione in tempo reale dell&#39;attività corticale nelle aree esposte 5, 6, 7. Sebbene molti studi utilizzano craniotomie combinate con tecniche di imaging ottico in vivo per studiare la struttura e la funzione dei neuroni corticali, glia e corvascolarizzazione tici 8, 9, ulteriori indagini sono limitate da piccole aree della corteccia esposta (ma vedi 10). Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un metodo per creare una grande craniotomia laterali, esponendo la corteccia cerebrale dalla linea mediana all&#39;osso squammoso, e si estende oltre bregma e lambda. Questa grande craniotomia consente la visualizzazione simultanea delle cortecce di associazione (retrosplenial, cingolo, e parietale), motoria primaria e secondaria, somatosensoriale, visivo, e la corteccia uditiva. Questo metodo è stato precedentemente accoppiato con immagini a colori sensibile tensione (VSDI) per indagare come più aree corticali interagiscono tra loro durante l&#39;attività spontanea e stimolo indotto corticale 5, 11, 12. Gli aspetti più difficili di questa procedura include il posizionamento della testadell&#39;animale, che fissa la piastra di testa, ed evitando emorragia mentre separa il muscolo temporale dall&#39;osso parietale. Si deve inoltre tener conto durante i processi di foratura e di rimozione del cranio come le curve cranio ad un angolo obliquo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heating Pad&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>2 or more pairs are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00, 15000-10</td>
			<td>1 pair should be designated for dura removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jet tooth shade powder</td>
			<td>LANG Dental</td>
			<td>Jet Tooth Shade Powder</td>
			<td>to be mixed with the Jet Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jet tooth shade liquid</td>
			<td>LANG Dental</td>
			<td>Jet Tooth Shade Liquid</td>
			<td>to be mixed wihth the Jet Powder&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389</td>
			<td>Midwest Dental</td>
			<td>385201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Sinclair Dental Canada</td>
			<td>Pfizer Gelfoam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td>
			<td>124125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Epinephrine</td>
			<td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td>
			<td>125299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethazone 5 mg/mL</td>
			<td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td>
			<td>125231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyl cyanoacrylate glue (VetBond)</td>
			<td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td>
			<td>12612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity

La craniotomia è una procedura comunemente eseguita per esporre il cervello per gli esperimenti in vivo. Nella ricerca del mouse, la maggior parte dei laboratori utilizzano una piccola craniotomia, in genere da 3 mm x 3 mm. Questo protocollo introduce un metodo per creare una finestra del cranio sostanzialmente quella da 7 x 6 mm esponendo più di un emisfero cerebrale sopra il mouse corteccia temporale e parietale (ad esempio, bregma di 2,5 - 4,5 mm laterale sul 0 - 6 mm). Per eseguire questo intervento, la testa deve essere inclinata di circa 30 ° e gran parte del muscolo temporale deve essere ritirato. A causa della grande quantità di rimozione ossea, questa procedura è previsto solo per gli esperimenti acuti con l&#39;animale anestetizzato durante l&#39;intervento chirurgico e sperimentare. Il vantaggio principale di questo innovativo grande finestra cranica laterale è di fornire accesso simultaneo a entrambe le zone mediale e laterale della corteccia. Questo grande finestra del cranio unilaterale può essere utilizzato per studiare le dinamiche neurali tra le cellule,nonché tra le diverse aree corticali combinando multi-elettrodo registrazioni elettrofisiologiche, imaging dell&#39;attività neuronale (ad esempio, l&#39;imaging intrinseca o estrinseca), e la stimolazione optogenetic. Inoltre, questa grande craniotomia espone anche una grande area di vasi sanguigni corticali, consentendo la manipolazione diretta della vascolarizzazione corticale laterale.

<html> Per studiare le interazioni tra le aree corticali all&#39;interno di un singolo emisfero, abbiamo usato un ampio craniotomia estende attraverso il seno sagittale e 5 - 6 mm lateralmente. Questa finestra cranica inclusa primaria (motore, somatosensoriale, visivo, uditivo), secondari (motore, visivo), e di associazione (retrosplenial, cingolo, parietale associazione) cortecce di emisferi destro (Figura 3A). Per questo lavoro abbiamo utilizzato l&#39;imag...

Watch this Scientific Journal Video about A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity at JoVE.com

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Questo protocollo presenta un metodo per creare una grande craniotomia unilaterale sulle regioni temporali e parietali della corteccia cerebrale del mouse. Ciò è particolarmente utile per l&#39;imaging in tempo reale su un&#39;area espansiva di un emisfero corticale.

Una procedura Grande laterale Craniotomia per Mesoscale Wide-field Optical Imaging di Brain Activity

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Views.  University of Lethbridge.  Questo protocollo presenta un metodo per creare una grande craniotomia unilaterale sulle regioni temporali e parietali della corteccia cerebrale del mouse. Ciò è particolarmente utile per l'imaging in tempo reale su un'area espansiva di un emisfero corticale. 

Video: A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

Stato-dipendenza Effetti sulla TMS: uno sguardo al comportamento Motive fosfene

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Ricerca

Neuroscienze

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Registrazione ottica a singolo fotone a campo largo nelle sezioni cerebrali utilizzando Colorazione sensibile alla tensione

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a real-time fMRI platform to guide experimenters to monitor fMRI responses instantaneously during acquisition, which can be used to modify the physiology of animals to achieve desired hemodynamic responses in animal brains. The real-time fMRI set-up is based on a 14.1T preclinical MRI system, enabling the real-time mapping of dynamic fMRI responses in the primary forepaw somatosensory cortex (FP-S1) of anesthetized rats. Instead of a retrospective analysis to investigate confounding sources leading to the variability of fMRI signals, the real-time fMRI platform provides a more effective scheme to identify dynamic fMRI responses using customized macro-functions and a common neuroimage analysis software in the MRI system. Also, it provides immediate troubleshooting feasibility and a real-time biofeedback stimulation paradigm for brain functional studies in animals.

Animal brain functional mapping can benefit from the real-time functional magnetic resonance imaging (fMRI) experimental set-up. Using the latest software implemented in the animal MRI system, we established a real-time monitoring platform for small animal fMRI.

Mappatura cerebrale fMRI in tempo reale negli animali

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates reafferent cues that animals must disentangle from relevant sensory cues of the surrounding environment. For example, when a fish swims, flow generated from body undulations is detected by the mechanoreceptive neuromasts, comprising hair cells, that compose the lateral line system. The hair cells then transmit fluid motion information from the sensor to the brain via the sensory afferent neurons. Concurrently, corollary discharge of the motor command is relayed to hair cells to prevent sensory overload. Accounting for the inhibitory effect of predictive motor signals during locomotion is, therefore, critical when evaluating the sensitivity of the lateral line system. We have developed an in vivo electrophysiological approach to simultaneously monitor posterior lateral line afferent neuron and ventral motor root activity in zebrafish larvae (4-7 days post fertilization) that can last for several hours. Extracellular recordings of afferent neurons are achieved using the loose patch clamp technique, which can detect activity from single or multiple neurons. Ventral root recordings are performed through the skin with glass electrodes to detect motor neuron activity. Our experimental protocol provides the potential to monitor endogenous or evoked changes in sensory input across motor behaviors in an intact, behaving vertebrate.

We describe a protocol to monitor changes in the afferent neuron activity during motor commands in a model vertebrate hair cell system.

Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Procedura craniotomia per la visualizzazione delle attività neuronali nell'ippocampo dei topi che si comportano

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imaging del calcio a campo largo e a due fotoni da un topo utilizzando una grande finestra cranica

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...