Vorremmo ringraziare Alex Hitchen e Meg Booth per il loro aiuto con le prove di accoppiamento. Questo lavoro è stato sostenuto da NERC concessione NE / H015604 / 1 a TP.

1. Preparazione di Fly cibo con coloranti alimentari <ol><li> Prendere una fiala standard Drosophila con circa 20 ml di cibo sul fondo (Figura 1). Utilizzare la seguente ricetta per la miscela alimentare con 1 L di acqua bollente: 10 g della agar, 85 g di destrosio, 60 g di farina di mais, 40 g di lievito, e agitare per 5 min di ebollizione. Aggiungere 25 ml di 10% nipagen volta la miscela è raffreddata a 75 ° C. </li><li> Dopo il cibo è raffreddato e solidificato aggiungere due gocce (circa 0,5 - 1 ml) di colorante alimentare blu all&#39;inizio del cibo e si sviluppa su tutta la superficie del flacone (Figura 1). Utilizzare un diverso colore della tintura se si preferisce. </li><li> Lasciare il cibo per due giorni nel frigorifero in modo che il colorante viene assorbita dallo strato superiore di cibo; questo evita eccessiva umidità danneggiare le mosche durante il periodo di maturazione. Aggiungere un piccolo pezzo di carta velina, se eccessiva umidità è ancora un problema per cancellare l&#39;umidità in più e poi successivamenterimuoverlo. </li><li> Trasferimento vola sul cibo singolarmente o in gruppo. Nota: Le mosche guadagneranno colorazione intestinale entro 1 giorno di essere immessi sul cibo. In alternativa, maturare pienamente le mosche sul cibo tinto prima dell&#39;esperimento (aumento della mortalità durante il periodo di maturazione non è stata osservata dall&#39;esposizione al colorante alimentare). </li><li> Verificare che le mosche colorate possono essere facilmente distinta dalle mosche non tinti. Se non possono essere distinti, ripetere i passaggi 1,1-1,4 usando una maggiore concentrazione di colorante o un colorante diverso. </li></ol> 2. Due Prove di accoppiamento maschio con colorante alimentare <ol><li> Per la produzione di progenie, impostare più fiale contenenti coppie di mosche femminili e maschili (piccoli gruppi di uomini e donne sono anche adatti, anche se fare attenzione per evitare l&#39;affollamento delle larve). Lasciare le femmine depongono le uova e si muovono in linea di nuovi flaconi ogni 5 - 7 giorni. Conservare le fiale a una temperatura adatta per la specie di interesse (22 ° C fo D. pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C per D. melanogaster). </li><li> Prima di raccogliere le mosche sperimentali rimuovere tutte le mosche dai flaconi di raccolta in un tempo stabilito prima di raccogliere i maschi e femmine per assicurare che saranno vergini (D. melanogaster - 6 ore a 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 ore a 22 ° C, e D. subobscura - 24 ore a 22 ° C). Nota: se le mosche non sono vergine questo pregiudizio volontà il loro comportamento nelle prove di accoppiamento 15. <ol><li> Conservare e maschio maturo individualmente in fiale standard di 75 x 20 mm plastica (contenente ~ 20 ml di cibo). Questo evita gli effetti negativi sul comportamento di accoppiamento maschio e fitness visto in alcune specie quando i maschi sono allevati in gruppi di 16. </li><li> Esporre metà dei maschi per il trattamento desiderato (CO 2 anestesia in questo caso). Utilizzare un tappetino di CO 2 o toccare per esporre le mosche per il tempo necessario. Conservare la metà del males in ogni trattamento il cibo colorato fino l&#39;accoppiamento avviene. Questo li renderà visivamente distinguibili durante le prove di accoppiamento. </li><li> Per il trasferimento di mosche utilizzare un aspiratore 17. Etichettare ogni flaconcino per identificare sia il trattamento e lo stato del colore del maschio. Qui, utilizzare quattro trattamenti (anestesia, non-color = G-NC, anestesia, colorato = GC, no anestesia, non colorato, NG-NC, e senza anestesia, colorato, NG-C). </li></ol></li><li> Trasferire femmine nuovi emersi in fiale alimentari freschi a maturare come gruppi di 10. </li><li> Lasciare le mosche a maturare all&#39;età di accoppiamento (D. melanogaster - 3 giorni, D. pseudoobscura - 5 giorni, D. subobscura - 7 giorni 18 Conservare vola ad una temperatura adatta per la specie in fase di studio (ad esempio, 22 ° C per D. . pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C per D. melanogaster). </li><li> Spostare le femmine a singoli flaconi (containing ~ 20 ml di cibo) 1 giorno prima del processo di accoppiamento per l&#39;acclimatazione al flaconcino di accoppiamento. Etichetta queste fiale in modo che fiale possono essere differenziati. Attenzione accecare l&#39;esperimento utilizzando etichettatura neutra (cioè, 1 - 150) in modo che non è possibile indovinare l&#39;identità di linea in ogni flaconcino. Nota: Il soggetto che immette in linea in ogni fiala dovrà conoscere l&#39;identità delle mosche collocati in ogni fiala in quanto saranno notare che il trattamento era macchiato. Tuttavia, l&#39;osservatore che guarda l&#39;accoppiamento non deve conoscere la loro identità. Per farlo sarà necessario questo almeno due sperimentatori, una da installare e di osservare. </li><li> Iniziate le prove di accoppiamento tra 10-12 del mattino, o in un momento che coincide con la luce proveniente sul nel ciclo luce / buio linea sono esposti a (&quot;alba&quot; per linea). Aggiungere due mosche maschio per ogni flacone di accoppiamento (che contiene una mosca femminile) con un aspiratore. Assicurarsi che i due maschi sono da diversi trattamenti (anestesia ocontrollo) e che uno ha colorazione intestinale per permettere di distinguerli l&#39;uno dall&#39;altro, e scrivere che maschile è macchiato. </li><li> Se si verifica copulazione, registrare lo stato del maschio che si accoppia (colorato o non - colorati). Se le prove durano 2 ore, assumono la femmina non si accoppiano. Nota: 2 ore è adatto per queste specie, ma altri Drosophila potrebbe essere necessario più o meno tempo. </li></ol> 3. Uomo singolo Trials accoppiamento <ol><li> Per gli studi maschi singoli, ripetere protocollo 2 con due modifiche: <ol><li> Al punto 2.3 non tenere i maschi sul cibo colorato. </li><li> In fase 2.7, aggiungere un solo maschio per ogni flacone. </li></ol></li><li> Nel passo 2.8, registrare il tempo di volo viene aggiunta alla fiala, il tempo inizia accoppiamento e il tempo dell&#39;accoppiamento finito devono essere registrati. Da questi valori, calcolare accoppiamento successo, la latenza, e la durata. </li></ol> Analisi 4. Dati <ol><li> Utilizzare software statistico adatto per analisi. Se i dati sono normali e hanno solo due trattamenti, utilizzare t-test o equivalente modello lineare generalizzato (GLM). Per due esperimenti di sesso maschile, utilizzare i test binomiale o un GLM binomio che sono disponibili in qualsiasi pacchetto delle statistiche di base. Nota: per i dati di esempio, tutte le analisi sono state effettuate in R versione 3.0.3 19. </li><li> Controllare i dati di latenza accoppiamento e durata di accoppiamento per la normalità, tracciando istogrammi di frequenza di latenza e di durata per ogni trattamento 20, e l&#39;utilizzo di un test per la normalità, come Shapiro-Wilk. Se non è normale, trasformarlo, o utilizzare corrispondenti statistiche non parametrici 20. Nota: per i dati di esempio degli esperimenti maschi singoli log trasformazione soddisfatto i requisiti di normalità e varianze uguali. </li><li> Se i dati possono essere normalizzati, Usa T-test per esaminare le differenze tra la latenza di accoppiamento e la durata delle prove singole di accoppiamento maschi quando si utilizzano due trattamenti 21. Se si utilizzano trattamenti multipli,provare un analisi della varianza (ANOVA) 20. Se i dati non possono essere normalizzati, provare equivalenti test non parametrici 21. </li><li> Utilizzare test binomiale per verificare l&#39;effetto di una colorante alimentare o di CO 2 anestesia sul successo di accoppiamento dei maschi concorrenti 20. Se si utilizzano più trattamenti, come è il caso con i dati di esempio, utilizzare un GLM con struttura di errore 21 binomiale. </li><li> Per le due prove maschili nei dati esempio, utilizzare MLG con strutture errore binomio. Una GLM esaminato colore come una variabile di risposta (colorato = 0, non colorato = 1) con specie, lo stato di gas, e il trattamento di gas installati come esplicativo variables.One GLM esaminato CO 2 come una variabile di risposta (gasati = 0 e non-gassati = 1) con le specie, lo stato di colore e trattamento del gas montati. In ciascun caso, il modello produrre massima, ed eseguire semplificazione modello basato sulla AIC 20. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questi dati mostrano che l&#39;impatto dell&#39;anestesia CO 2 è coerente tra le specie, con due delle tre specie mostrano scarso impatto. I nostri risultati suggeriscono l&#39;etichettatura con il colorante alimentare ha avuto un minor impatto sul successo di accoppiamento maschio di CO 2 per l&#39;anestesia D. melanogaster. Questi esperimenti dimostrano che i coloranti alimentari possono facilmente ed economicamente essere utilizzati per le mosche di etichette per le prove di accoppiamento che coinvolgono più maschi. Delle tre specie modello Drosophila esaminati, solo D. melanogaster ha mostrato un effetto di CO 2 anestesia sulle prestazioni di accoppiamento in una situazione di concorrenza. Al contrario, nessuna delle specie ha mostrato un effetto di raccolta gas in studi singoli accoppiamento in termini di latenza accoppiamento, contrariamente ai risultati precedenti per D. melanogaster 5. L&#39;effetto della concorrenza potrebbe quindi essere evidenziando effetti di fitness più sottili di anestesia CO 2, che sono solo rilevabiliin situazioni in cui vi è una concorrenza maschio-maschio. L&#39;esposizione a raccolta precoce e un giorno prima del processo hanno un effetto negativo sulla capacità dei maschi di D. melanogaster per ottenere un accoppiamento. Esposizione due giorni prima del processo, tuttavia, non ha mostrato alcun effetto. Entrambi D. pseudoobscura e D. subobscura non ha mostrato alcun effetto di esposizione a gas in qualsiasi delle prove. Una spiegazione è che D. melanogaster era vulnerabile a precoce esposizione al CO 2 perché deve essere raccolto in precedenza in vita (0-6 ore di età) rispetto alle altre specie per garantire i maschi sono vergine. Quindi maschio D. melanogaster di questa età può essere più sensibile la cuticola della mosca è ancora indurimento, rispetto alle altre specie che hanno avuto più per la loro cuticola per indurire. In generale, questo sostiene l&#39;idea che gli effetti di CO 2 anestesia sono specie specifici e investigatori dovrebbero adeguatamente testare l&#39;effetto in loro specie bersaglio. Correntely, la maggior parte del lavoro sull&#39;effetto di CO 2 anestesia è stata effettuata su Drosophila melanogaster 5,11,22 e quindi non può essere opportuno applicare alle altre specie affini. Il metodo non invasivo alternativa presentata a differenziare le mosche è colorante alimentare. I risultati suggeriscono questo trattamento non ha avuto effetto in in tutte le specie esaminate. Tuttavia, mentre il suo uso è riuscita a fornire un marker economico e facilmente visibili distinguere tra individui va osservato che il colorante era facile distinguere in D. pseudoobscura e D. subobscura che in D. melanogaster. Precedente autori hanno utilizzato diversi colori (rosso, verde e blu) 4,6. Abbiamo trovato colorazione blu per essere il più facile distinguere in tutte le specie, particolarmente D. pseudoobscura e D. subobscura. Utilizzando diversi colori potenzialmente consentire esperimenti più complessi con molti marcati individualmente flies. Tuttavia, i test preliminari di diversi coloranti sono essenziali, come alcuni coloranti alimentari non riescono a colorare le mosche, forse essere digerito se consumato. Altri coloranti possono avere effetti tossici e ridurre la sopravvivenza delle mosche, e dovrebbero essere evitati 14). Metodi coloranti alimentari alternativi utilizzando le macchie più costosi sono stati utilizzati anche per l&#39;esame di integrità intestinale per D. melanogaster 23. Questi possono fornire un&#39;alternativa, anche se più costoso, metodo di tintura 23. Il metodo di tintura è il più velocemente di CO 2 ala ritaglio come mosche possono essere memorizzati sul cibo tinto a raccolta. Uptake del cibo era rapida (~ 3 ore), in modo stoccaggio O / N sul cibo colorato sarebbe anche sufficiente a marcare mosche, come usato in altri studi 6. Tuttavia, la durata della colorazione è relativamente breve (~ 4 - 5 ore) rispetto al centro di clipping (permanente) o polvere fluorescente marcatura (10 - 12 giorni) 24. Come Drosophila specievari in apparenza, diversi coloranti saranno più o meno efficace per le specie diverse, e alcuni ceppi (ad esempio, mutanti knock-out) possono essere sensibili a cambiamenti nella dieta, qualsiasi uso di colorante richiede una prova preliminare della sua efficacia soprattutto se più esposizione a lungo termine ai coloranti può essere tossico 14. In contrasto studio di Kalaw et al. 14, abbiamo trovato alcuna significativa mortalità dopo stoccaggio per più giorni sugli alimenti colorati per D. melanogaster (3 giorni), D. pseudoobscura (5 giorni), o D. subobscura (7 giorni), probabilmente a causa della differenza di colorante utilizzato. Il passo fondamentale per utilizzare con successo la tecnica di tintura è passo 1.5, convalida che il colorante prescelto funziona bene con le specie e del ceppo utilizzati. Una tecnica alternativa comporta l&#39;applicazione di polvere colorata all&#39;esterno della mosca prima dell&#39;uso in esperimenti di campo 24. Questo metodo è stato utilizzato per l&#39;inseguimento individui nel campo a causa to la durata di marcatura e la facilità di massa marcatura 24 mosche. Anche se non abbiamo testato in modo esplicito questo metodo negli studi di accoppiamento, sarebbe importante esaminare gli effetti che la polvere potrebbe avere sui sensi importanti in accoppiamento, in particolare in Drosophila 25, 26. In specie, invece, dove la tintura intestinale non è possibile, questi metodi potrebbero essere adatti. In conclusione, abbiamo scoperto che in due delle tre specie testate (D. pseudoobscura e D. subobscura) non vi è stato alcun effetto trovato su entrambi CO 2 anestesia o colorante alimentare sulla capacità di accoppiamento dei maschi. Per D. melanogaster un effetto negativo di CO 2 anestesia è stato rilevato, ma colorante alimentare non ha influenzato l&#39;accoppiamento successo in questa specie. In generale, il metodo della tintura fornisce un metodo non invasivo semplice ed economico per identificare singoli Drosophila equivalente o migliore di metodi che richiedono CO 2 anestesia. Essoè probabile che questo metodo avrebbe funzionato in una vasta gamma di specie.

Negli ultimi decenni si è registrato un crescente interesse in modo sessuale selezione e competizione tra maschi impatto sull&#39;evoluzione 1,2. Esperimenti sul comportamento di accoppiamento hanno svolto un ruolo importante nello sviluppare e testare le teorie di selezione sessuale 3,4. In particolare, la ricerca con le specie del genere Drosophila, ha contribuito notevolmente alla comprensione di selezione e il comportamento sessuale. Tuttavia, è importante indagare se tecniche comunemente utilizzate potrebbero influenzare artificialmente i risultati di esperimenti di accoppiamento standard di 5,6. Anestesia è spesso usato per la gestione e l&#39;identificazione in esperimenti 7. Ad esempio, le mosche sono comunemente raccolti prima dell&#39;accoppiamento, o ordinate in genotipi o trattamenti sperimentali che utilizzano anidride carbonica (CO 2) anestetico. Negli esperimenti in cui è necessario distinguere due o più individui, è pratica comune per anestetizzare il flIES e clip parte dell&#39;ala off per identificare ogni individuo o gruppo di trattamento 5,8. E &#39;fondamentale, però, per capire come CO 2 trattamento sarà influenzare il comportamento. L&#39;effetto di CO 2 l&#39;anestesia è stata esaminata in Drosophila melanogaster in cui i maschi esposti a CO 2 ha preso molto più tempo per accoppiarsi e nel complesso è stata il successo di accoppiamento inferiori rispetto ai maschi non anestetizzato o maschi anestetizzati con l&#39;esposizione al freddo 5. Questo effetto è stato osservato sia quando l&#39;anestesia è stata applicata il giorno dell&#39;esperimento e quando le mosche hanno dato un giorno per recuperare. Tuttavia, questo studio è stato limitato in studi solo esame in cui un singolo maschio è stato presentato ad ogni femmina 5. Uno scenario più realistico è per una femmina di incontrare più maschi 9,10, permettendo la concorrenza tra i maschi, il che potrebbe permettere il rilevamento di perdite più sottili del fitness maschile a causa di anestesia. L&#39;uso di anestesia CO 2 è anche essereen trovato per ridurre la fecondità e la longevità di adulti D. melanogaster quando sono esposti poco dopo eclosion, come è comune nella raccolta vergine vola 11. Un&#39;alternativa di CO 2 l&#39;anestesia è di marcare le mosche somministrando loro cibo colorato con tinture 4,6,10,12,13. Questo colorante entra l&#39;intestino della mosca ed è visibile attraverso l&#39;addome, permettendo mosche colorate per distinguere dalle mosche incolore, o da mosche etichettati con un colore diverso. Metodi differiscono in quanto questo può essere applicato: viene aggiunto direttamente al cibo 12, tramite tinto pasta lievito complementare 6, o mediante esposizione ad un romanzo tinto alimentare substrato 13. Queste tecniche di marcatura sembrano mostrare alcun effetto sulle prestazioni di accoppiamento 4,6. Tuttavia, un documento esaminare direttamente gli effetti dello stesso colorante alimentare su adulto D. melanogaster trovato una forte riduzione della durata della vita 14. Il lavoro precedente ha anche concentrato almost interamente su D. melanogaster, sia per quanto riguarda gli effetti di CO 2 anestesia 5,11 e colorante alimentare 14 metodi. Attualmente, ci sono poche informazioni su come CO 2 anestesia o l&#39;uso di coloranti intestinale colpisce il comportamento di accoppiamento di altri Drosophila. Il seguente studio valuta l&#39;effetto di CO 2 anestesia sul comportamento di accoppiamento di tre specie di Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura, e D. subobscura). L&#39;effetto di raccogliere mosche su di CO 2 è stata esaminata sia in singolo e due prove di accoppiamento maschi. L&#39;effetto della CO 2 è stato trovato anche variare in D. melanogaster 5 e così diversi periodi di latenza tra l&#39;esposizione a CO 2 e l&#39;accoppiamento sono stati testati. Un metodo per l&#39;anestesia e l&#39;ala clipping marcatura alternativa: l&#39;uso di coloranti per colorare linea viene valutata anche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TWT-200-061G</td>
			<td>Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine mesh</td>
			<td>Any haberdashery</td>
			<td>-</td>
			<td>Fine curtain mesh is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-376</td>
			<td>Various brands of pipette tips would be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>58.49</td>
			<td>Larger vials or bottles could also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls</td>
			<td>Lewis Medical Solutions</td>
			<td>28170</td>
			<td>The size of cotton will vary depending on the size of vials used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Food colouring</td>
			<td>Thesugarcraftcompany</td>
			<td>-</td>
			<td>Other dye colours and brands can have variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>BOC</td>
			<td>BOC 40VK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie Markers</td>
			<td>Steadtler</td>
			<td>Lumocolor 313 S</td>
			<td>Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Salter</td>
			<td>SL3920</td>
			<td>Any stopwatch with a good digital display would be fine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dyeing insects for behavioral assays: the mating behavior of anesthetized drosophila

Esperimenti di accoppiamento utilizzando Drosophila hanno contribuito notevolmente alla comprensione di selezione e il comportamento sessuale. Esperimenti spesso richiedono metodi semplici, semplici ed economiche per distinguere tra gli individui in un processo. Una tecnica standard per questo è di CO 2 l&#39;anestesia e poi etichettatura o ala clipping ogni mosca. Tuttavia, questo è invasivo e ha dimostrato di influenzare il comportamento. Altre tecniche hanno utilizzato colorazione per identificare mosche. Questo articolo presenta un metodo semplice e non invasivo per l&#39;etichettatura Drosophila che permette loro di essere identificati individualmente entro esperimenti, utilizzando coloranti alimentari. Questo metodo è usato in processi in cui due maschi competono per accoppiarsi con una femmina. Tintura permesso l&#39;identificazione facile e veloce. C&#39;era tuttavia qualche differenza nella forza della colorazione di tutti i tre specie testate. I dati sono presentati mostrando il colorante ha un minore impatto sul comportamento di accoppiamento di CO 2 in Drosophila melanoGaster. L&#39;impatto di anestesia CO 2 è indicata a dipendere dalla specie di Drosophila, con D. pseudoobscura e D. subobscura mostrando alcun impatto, mentre D. maschi melanogaster avevano ridotto successo di accoppiamento. Il metodo di tintura presentato è applicabile ad un&#39;ampia gamma di modelli sperimentali.

Due studi accoppiamento maschio - L&#39;effetto di CO 2 anestesia sul comportamento di accoppiamento Il modello più trovato per spiegare la variazione dell&#39;effetto di CO 2 anestesia conteneva specie come fattore (con D. pseudoobscura e D. subobscura fusa come mostrato differenze tra di loro). In D. pseudoobscura e D. subobscura non vi era alcun effetto significativo di CO 2 anestesia sul successo di accoppiamento in due prove maschili (Z 1.589 = 0.087, p = 0,931). Per D. melanogaster, maschi esposti a CO 2 anestesia avuto successo accoppiamento significativamente inferiore (Z1,589 = 2.467, p = 0,014). C&#39;è stata anche una significativa interazione tra le specie e il trattamento (χ 2 1.589 = 6.83, P = 0.009), con un effetto maggiore di essere visto quando D. melanogaster sono stati esposti a gas raccolta o 1 giorno prima prove (Tabella 1). Carner, D. maschi melanogaster esposti a CO 2 due giorni prima del processo sperimentale non hanno mostrato un effetto di CO 2. Due studi accoppiamento maschio - L&#39;effetto della colorazione intestinale sul comportamento di accoppiamento Modello semplificazione non ha mostrato alcun effetto significativo di colorante alimentare essere trovato qualsiasi delle tre specie (p&gt; 0,1). Quando il trattamento o lo stato di gas sono stati inclusi nell&#39;analisi questi erano anche non significative (P&gt; 0,1). Le proporzioni di accoppiamenti successo per linea colorata attraverso trattamenti sono riportati nella Tabella 2. La differenza di colorazione tra mosche conservata a colorato e il cibo non colorato può essere visto in Figura 1. L&#39;intensità del colorante alimentare intestinale era maggiore in D. pseudoobscura e D. subobscura che in D. melanogaster. Prove di accoppiamento singolo - L&#39;effetto di utilizzare CO 2 anestesia su mcomportamento ope- Non c&#39;era differenza nella latenza di accoppiamento per una delle tre specie quando di CO 2 l&#39;anestesia è stato utilizzato per raccogliere recentemente emerse adulti. Un effetto è stato trovato per la durata accoppiamento in D. subobscura quando è stato esposto a CO 2 due giorni prima prove di accoppiamento (figure 2 e 3, Tabella 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografia che mostra Fiale di colori e non colori Fly alimentari (A) e la forza della intestinale Colorazione a Male D. Subobscura (B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig2.jpg" /> Figura 2. La media e il 95% intervallo di confidenza per accoppiamento di latenza per le tre specie effettuati studi singolo maschio, quando i maschi erano anestetizzared (barre chiare) o non anestetizzati (barre scure) quando raccolti come Virgins prima della maturità sessuale. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig3.jpg" /> Figura 3. La media e il 95% intervalli di confidenza per accoppiamento Durata per le tre specie effettuati studi singolo maschio, quando i maschi sono stati anestetizzati (barre chiare) o non anestetizzati (barre scure) quando raccolti come Virgins prima della maturità sessuale. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Trattamento </td><td> Specie </td><td> No. prove </td><td> No. mosche colorate che si sono accoppiati </td><td> p-value </td><td> No. mosche gassate che si sono accoppiati </td><td> p-value </td></tr><tr><td rowspan="3"> Collezione di CO 2 </td><td> D. mel </td><td> 73 </td><td> 36 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 0,0344 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td>79 </td><td> 41 </td><td> 0,8221 </td><td> 44 </td><td> 0,3682 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 71 </td><td> 40 </td><td> 0,3425 </td><td> 33 </td><td> 0,6353 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Esposto alla CO 2 18 ore prima </td><td> D. mel </td><td> 57 </td><td> 28 </td><td> 1 </td><td> 19 </td><td> 0,0163 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 65 </td><td> 32 </td><td> 1 </td><td> 31 </td><td> 0,8043 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 68 </td><td> 38 </td><td> 0,3961 </td><td> 35 </td><td> 0,9036 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Esposto a CO 2 due giorni. </td><td> D. mel </td><td> 56 </td><td> 19 </td><td> 0,0222 </td><td> 32 </td><td> 0,3497 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 70 </td><td> 32 </td><td> 0,5504 </td><td> 33 </td><td> 0,7202 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 56 </td><td> 29 </td><td> 0,8939 </td><td> 26 </td><td> 0,6889 &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table> Tabella 1. I risultati di due esperimenti Maschio Choice in tutte le specie e trattamenti esaminati. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Specie </td><td> Tratto </td><td> df </td><td> t-valore </td><td> p-value </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. melanogaster </td><td> Latenza </td><td> 58 </td><td> 1.379 </td><td> 0,174 </td></tr><tr><td> Durata </td><td> 58 </td><td> 1.243 </td><td> 0,221 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. pseudoobscura </td><td> Latenza </td><td> 109 </td><td> 0,419 </td><td> 0,676 </td></tr><tr><td> Durata </td><td> 109 </td><td> 0,436 </td><td> 0,664 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. subobscura </td><td> Latenza </td><td> 83 </td><td> 0,098 </td><td> 0,922 </td></tr><tr><td> Durata </td><td> 83 </td><td> 1.767 </td><td> 0,081 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. I risultati di esperimenti di accoppiamento singoli a studiare gli effetti della raccolta di CO 2 Anestesia sulla latenza di accoppiamento e la durata. Le prove sono state effettuate su tre specie di Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura e D. subobscura).

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Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tintoria Insetti per comportamentali saggi: il comportamento di accoppiamento di anestetizzati<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

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Neuroscience

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

9.7K Views.  University of Liverpool. This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Video: Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

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Neuroscienze

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

Studiare le basi neurali del comportamento adattivo Locomotore in Insetti

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Metodi per la determinazione strutture UV-riflettenti e determinare la loro importanza nella Mate Preferenze utilizzando il Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantificazione del comportamento del grooming di Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...