The authors thank Mike Crickmore, Dragana Rogulja, and Michelle Frank for comments on the manuscript. Pavel Gorelik provided technical support for manufacturing the behavioral arenas. This work was conducted in Mike Crickmore's lab and is also supported by the Whitehall Foundation (Principal Investigator: Dragana Rogulja). S.X.Z. is a Stuart H.Q. and Victoria Quan Fellow at Harvard Medical School.

NOTA: Questo protocollo descrive la preparazione (sezioni 1 - 3), esecuzione (sezione 4), e le analisi (sezione 4) di saggi sazietà 2-D. Quindi, utilizzando la stimolazione dopaminergica come esempio, la sezione 5 mostra come combinare la stimolazione thermogenetic con saggi sazietà 2-D per indurre ipersessualità. Sezione 6 descrive 3 modi per verificare i risultati dei dosaggi sazietà 2-D. Infine, la sezione 7 mostra come misurare il recupero delle unità di accoppiamento nei moscerini maschi. 1. Realizzazione 8- e 32-camera Arenas comportamentali NOTA: Ogni ambito comportamentale costituita da più strati di fogli di plastica tagliati al laser tenuti insieme da viti esagonali e dadi ad alette a ciascuno dei quattro angoli (Figura 1A). <ol><li> Realizzare gli strati della scena. Realizzare ogni strato con un cutter laser per tagliare fogli di plastica acrilica alla forma appropriata (vedere Figura 1B, 1C per prodotti). NOTA: Molte ricerche Institutions hanno taglio laser nelle loro officine meccaniche o spazi creatore. Se l&#39;istituzione ha accesso ad un taglio laser, continuare con i seguenti passaggi. In caso contrario, seguire le istruzioni nella fase 1.2 invece. <ol><li> Per ogni strato, aprire il modello di progettazione nel software del taglio laser. NOTA: I disegni possono essere trovati nei file PDF in modo appropriato nome (ad esempio, 8-Camera Arena - Layer 2 - Doors.pdf) in materiale supplementare 1. Questo file contiene anche le annotazioni per il tipo di plastica da utilizzare (ad esempio, 1 / 8 pollici (vale a dire 3,175 millimetri) acrilico trasparente). L&#39;esatto spessore di ciascuno strato non è critica. Il requisito principale è quello di permettere 0,12 pollici (3 mm) o più di spazio verticale libero nelle camere. </li><li> Regolare le impostazioni laser (potenza, fuoco, ecc) per il tipo e lo spessore di plastica da utilizzare. Plastica posto nel letto laser cutter ed eseguire il taglio laser. NOTA: Queste impostazioni variano ampiamente basato sulla cutte laserr modello e la forza della sua laser. Trova impostazioni appropriate basate su esperienze passate o effettuando tagli di prova su plastica di scarto. Le incisioni esagonali profonde sono inclusi nel disegno di recesso le teste delle viti esagono. Questa funzione consente una sola mano serraggio dei dadi in e permette arene di riposare piatta sulla panca (senza sporgere testa delle viti). Tuttavia, rendendo incisioni profonde è spesso difficile da realizzare, e che richiede tempo, con un cutter laser. Questo passaggio è facoltativo e può essere saltato senza influenzare i risultati comportamentali. </li><li> Quando si taglia il telaio della porta (Layer 2, Figura 1A), utilizzare anche le impostazioni appropriate laser per incidere i numeri da camera incluse nel disegno (come in Figura 1B, 1C). </li></ol></li><li> Un ordine con un costruttore taglio laser in linea. Caricare tutti i file di progetto in formato PDF per l&#39;arena 8 e / o 32-camera e specificare il tipo di materiale (ad esempio, 1/8 di pollice (vale a dire 3,175 millimetri) CLEAR acrilico) sulla base delle annotazioni nei file. I risultati appariranno come nelle figure 1B (Arena 8-camera) e 1C (Arena 32-camera). </li><li> Montare arene usando quattro viti a testa esagonale e quattro dadi in per allineare e tenere insieme gli strati di plastica (Figura 1A). Le arene appariranno come in figura 1D, 1E (8-camera) e la Figura 1F, 1G (32-camera). NOTA: La parete cibo (Layer 4 in Figura 1A) è usata solo per dosaggi sazietà 2-D e viene omesso in arene 32 a camera, che vengono utilizzati in saggi corteggiamento. </li></ol> 2. Preparazione del cibo per 2-D sazietà Assay NOTA: Perché un saggio sazietà 2-D estende 4,5 h, volare cibo viene utilizzato in campo per fornire nutrimento e acqua. Questo protocollo utilizza, ma non è limitato a, la farina di mais convenzionale-agar cibo volare. <ol><li> Parzialmente assemblare la sazietà Arena 2-D (8-camera) con i livelli 3-6(si veda la Figura 1A per le assegnazioni di livello) e serrare con i dadi ad alette e le viti esagonali. </li><li> Mettete il cibo fresco volare in una bottiglia pulita, al microonde. Aggiungere acqua quanto basta per coprire la superficie inferiore della bottiglia (Figura 2A). </li><li> cibo a microonde in alto per 30 - 45 s. Controllare il progresso e mescolare ogni 15 s fino al fuso (Figura 2B). ATTENZIONE! Vola alimentare bolle facilmente sopra. </li><li> Utilizzare un smussato 1.000 microlitri pipetta punta (Figura 2C) per trasferire lentamente ~ 1 ml fuso cibo in ciascuna camera (Figura 2D). </li><li> Lasciare cibo per resolidify a 4 ° C per ~ 10 minuti (Figura 2E) prima del montaggio completamente l&#39;arena (Figura 2F). </li><li> Utilizzare l&#39;arena completata per esperimenti (vedi sezione 4) o conservare a 4 ° C. </li><li> Conservare il cibo avanzato a 4 ° C e il riutilizzo. </li></ol> 3. Preparazione Virgin femmine per comportamentali Assays NOTA: 2-D saggi di sazietà utilizzano un gran numero di mosche femmine vergini (~ 120 - 160 per un&#39;arena comportamentale completo) che sono difficili da raccogliere utilizzando metodi standard. Questa sezione descrive un approccio alternativo utilizzando il transgene hs-HID sul cromosoma Y 28, che è stato usato con successo in saggi corteggiamento 25, 29. Il magazzino utilizzato per generare femmine vergini bianchi dagli occhi ha il genotipo w1118 (X) / HS-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington magazzino Numero 24638). <ol><li> Flip vola in una nuova bottiglia, una volta 20 - 50% delle pupe hanno eclosed (vedi Figura 3A per esempio) e ci sono abbastanza maschi (5 - 10) per propagare il brodo. </li><li> Heat Shock bottiglia originale in un bagno di acqua calda a 37 ° C per 1 h per attivare sufficientemente hs-HID uccidere maschi (Figura 3B). Dopo lo shock termico, solo femmine ECLOSE da queste bottiglie e così rimarrà vergine fino alsaggi. NOTA: Assicurarsi che tutti i lati della bottiglia sono riscaldati in modo uniforme (vedi Figura 3A per linea di galleggiamento). Estendere questa volta per un massimo di 2 ore se 1 h non è sufficiente per tutti i maschi eutanasia. </li><li> Isolare le femmine raccolti per almeno 3 d prima di esperimenti per garantire che essi siano abbastanza vecchio per essere sessualmente recettiva 25, 29. NOTA: i maschi del cromosoma Y-less di tanto in tanto nascono da questo stock. Questi maschi hanno gli occhi bianchi e non sono influenzati dal calore shock, perché non contengono il transgene hs-HID. Non possono produrre spermatozoi e pertanto non può diminuire ricettività nelle femmine 30, 31. </li></ol> 4. Esecuzione e segnando 2-D sazietà saggi NOTA: È importante controllare l&#39;età del maschio vola mentre al disco di accoppiamento con l&#39;età. Questo protocollo utilizza i maschi che sono 3 - 4 d vecchio 25 </sup&gt;. <ol><li> Impostare l&#39;incubatore alla temperatura desiderata (ad esempio, 23 ° C per il campione, esperimenti RT) e umidità (&gt; 30%). Per incubatrici senza controllo dell&#39;umidità, lasciando una tazza di acqua in incubatrice è sufficiente. </li><li> Inserire un 2-D assay sazietà scena in incubatrice per ~ 30 minuti per equilibrare la temperatura e per evitare la condensazione nelle camere durante il corso dell&#39;esperimento. Le porte rotanti devono essere in posizione aperta. </li><li> Utilizzare una mosca aspiratore 32 per aspirare 15 - 20 femmine vergini in ciascuna camera dell&#39;arena (figura 4). NOTA: È importante che le femmine e maschi non vengono anestetizzati lo stesso giorno come il test. Nella nostra esperienza, ciò potrebbe avere un impatto ricettività femminile e comportamento di accoppiamento maschio. </li><li> Aspirare 1 maschio in ciascuna camera. </li><li> Posizionare l&#39;arena caricato in incubatrice sotto una videocamera consumer standard (Figura 5) e il film per 4.5 h. </li><li> Punteggio video notando quando ogni Male vola inizia e finisce ogni accoppiamento (cioè copulazione). Questo passaggio potrebbe richiedere molto tempo in un primo momento. Con la pratica, si possono segnare i video a velocità 5x o superiore. NOTA: Dal momento che le mosche si accoppiano per ~ 20 min a ~ 23 ° C (durata inferiore a temperature più elevate) 29, si può sfogliare i primi 15 minuti di ogni accoppiamento. </li><li> Dopo l&#39;accesso tutti i tempi di accoppiamento, sommare il numero di accoppiamenti per ogni volo (vedi risultati rappresentativi). </li><li> Utilizzare il codice fornito per generare un etogramma. Vedere supplementare Materiale 2 per il codice, le istruzioni e dati di esempio. </li><li> Usare CO 2 o la temperatura fredda per anestetizzare le mosche prima di rimuoverli. </li></ol> 5. Utilizzo di manipolazione thermogenetic per invertire sazietà in 2-D sazietà Assays NOTA: Questo protocollo test se la stimolazione thermogenetic di una popolazione neuronale definito può superare sazietà. Il fli sperimentalees esprimere il canale cationico termosensibile TRPA1 in popolazioni di neuroni definiti (UAS-TRPA1). I passaggi riportati di seguito valgono per la stimolazione dei neuroni dopaminergici (TH-GAL4), che hanno dimostrato di promuovere unità di accoppiamento 25. Questi passaggi possono essere utilizzati in combinazione con altri piloti neuronali per scoprire altre popolazioni che promuovono unità di accoppiamento. <ol><li> Per indurre thermogenetically comportamenti di accoppiamento in linea sazi, aumentare la temperatura nell&#39;incubatrice (ad esempio, da 23 ° C a 28,5 ° C) dopo aver completato un completo 4.5 h 2-D esperimento sazietà. </li><li> Dopo l&#39;incubatore raggiunge la temperatura desiderata, continuare la stimolazione di calore e segnare gli accoppiamenti (es. Copulazioni) dei maschi per 1 ora (vedi Rappresentante dei risultati). NOTA: La temperatura e la durata della stimolazione può variare a seconda del genotipo per cui è necessario risolvere le condizioni ottimali che impediscono sovrastimolazione dei neuroni pur continuando a produrre un Robust fenotipo. </li></ol> 6. Utilizzando Corteggiamento e Locomotion per verificare sazietà NOTA: Questa sezione descrive 3 metodi opzionali che possono essere utilizzati per verificare i risultati delle analisi sazietà 2-D. Essi non sono necessari per ogni test. <ol><li> Utilizzare saggi di corteggiamento per verificare la sazietà. <ol><li> Aspirare un maschio e una femmina vergine in ciascuna delle 32 camere in un&#39;arena corteggiamento. </li><li> Filmare le mosche per ~ 20 minuti utilizzando una videocamera consumer standard. </li><li> Punteggio l&#39;indice di corteggiamento (CI) per quantificare il corteggiamento 25; questa è la frazione di tempo impiegato corteggiamento (canto, in seguito, ecc.) e l&#39;accoppiamento (cioè copulazione) su una finestra 5 min. Questa finestra inizia dalla prima istanza di corteggiamento. Se una mosca maschio non inizia il corteggiamento nei primi 15 minuti, la sua CI è 0. Naïve WT mosche dovrebbero mostrare un CI superiore a 0,9, mentre una mosca completamente sazi dovrebbe avere un CI below 0.2. Altre misure di corteggiamento possono essere considerati 23, 33. </li></ol></li><li> Segnando il corteggiamento in saggi sazietà 2-D <ol><li> Nota la quantità di tempo che una mosca maschio trascorre corteggiare, per un periodo di un saggio sazietà 2-D (per esempio, la prima h). Corteggiamento è definito come il maschio eseguendo qualsiasi fase del rituale (canto, in seguito, etc.). A differenza nella sezione 6.1.3, questo passaggio non include il tempo trascorre il maschio di accoppiamento. </li><li> Dividere il tempo di corteggiamento sopra per il tempo totale il maschio non è stato corrispondente (cioè non copulare) nello stesso periodo di tempo. Ad esempio, se un maschio vola giudice 15 min e compagni per 20 min sul primo h, il rapporto è 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Il rapporto viene visualizzato come &quot;Frazione di nonmating tempo nel corteggiamento&quot; di Rappresentante dei risultati. </li></ol></li><li> Utilizzando test di locomozione per valutare esaurimento <ol><li> Parzialmente assemblare il 32-Arena da camera con tutte le parti, ma il foglio di contrasto. </li><li> Aspirare un moscerino maschio (mosche femmine) in ciascuna delle 32 camere in un&#39;arena corteggiamento. </li><li> Filmare le mosche per ~ 10 minuti utilizzando una videocamera consumer standard. </li><li> Traccia le mosche con il plugin MTrack2 in ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html). </li></ol></li></ol> 7. Recupero accoppiamento rigido dopo 2-D sazietà Assay <ol><li> Eseguire un test sazietà 2-D, come descritto al punto 4, ma aspirare il maschio vola al termine del test. </li><li> Isolare le mosche maschio a 23 ° C per il numero desiderato di giorni. </li><li> Eseguire un test di sazietà 2-D con i maschi recuperati e segnare i loro accoppiamenti (cioè accoppiamenti) per appena 1 ora (vedi Rappresentante dei risultati). </li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Sensillum+Recordings+in+the+Insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).</li><li>Cook, R., Cook, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Attractiveness+to+males+of+female+Drosophila+melanogaster:+effects+of+mating,+age+and+diet.">The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet.</a> Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).</li><li>Toates, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).</li><li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mating+of+a+fly.">The mating of a fly.</a> Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).</li><li>Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+manipulating+neural+circuits+in+the+fly+brain.">Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain.</a> Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).</li><li>Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+Genes+and+Cells+in+the+Nervous+System+of+the+Fruit.">Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BDGP+gene+disruption+project:+single+transposon+insertions+associated+with+40%+of+Drosophila+genes.">The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes.</a> Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).</li><li>Spradling, A. C., Stern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).</li><li>Parks, A. L., Cook, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+generation+of+high-resolution+deletion+coverage+of+the+Drosophila+melanogaster+genome.">Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome.</a> Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).</li><li>Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resources+for+Drosophila:+the+expanding+universe.">Research resources for Drosophila: the expanding universe.</a> Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).</li><li>Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics.">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li><li>Ni, J. Q., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila.">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature. 8 (5), 405-407 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Stati motivazionali possono essere saziati, mantenuti e recuperati 34. Vi presentiamo un test sazietà 2-D che misura in modo rapido e robusto tutti questi aspetti di accoppiamento auto in tempo reale. Questo test apre la possibilità di utilizzare mosca advanced manipolazioni genetiche per studiare le componenti molecolari e circuitali di un comportamento motivato. Il test si basa sulla capacità di sazietà del maschio in tribunale con successo e copulare, e di inte...

Il lavoro in Drosophila ha fornito una visione profonda e pionieristico in molti fenomeni biologici, compresa la natura del gene 1, i principi dello sviluppo embrionale 2, ritmi circadiani 3, e lo sviluppo e il cablaggio del sistema nervoso 4, 5, 6. La motivazione resta molto meno ben compreso che questi fenomeni, forse a causa delle limitazioni sui sistemi che sono stati studiati finora. La motivazione e la mosca è studiato principalmente nel contesto della fame, che presenta molte sfide a causa della loro irrisorio assunzione di cibo per attacco di alimentazione e di esoscheletro che esclude i segni evidenti di deposizione di grasso. Di conseguenza, vi è la necessità di ampliare i sistemi utilizzati per studiare motivazione in volo. Descriviamo un quadro comportamentale per lo studio di azionamento accoppiamento inDrosophila. Questo sistema sfrutta gli strumenti neurogenetic in volo e l&#39;accessibilità 7, 8, 9, 10, 11, 12 e la connettoma putativo del suo circuito dimorfismo sessuale 8, 13. Inoltre, gran parte della innata 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e ho imparato 22, 23, 24 circuiti senso-motorio che controlla il corteggiamento è stato elaborato in dettaglio, offrendo una rara opportunitàper individuare il nodo circuitale esatta su cui incide motivazione. Abbiamo recentemente riportato che, nel volo, come negli esseri umani, i livelli di dopamina sono fondamentali per unità di accoppiamento 25, 26, 27. Abbiamo ottenuto l&#39;accesso genetica al relativo dettagliata a livello di circuito molecular- e che producono la dopamina e la ricezione di neuroni al volo, facilitando l&#39;analisi di questo fenomeno conservato utilizzando i saggi che descriviamo qui 25. Aggiungiamo ai test comportamentali nei Zhang et al. 25 una nuova arena comportamentale piatta che permette di video di punteggio, che noi chiamiamo un test di sazietà a 2 dimensioni (2-D), un importante miglioramento rispetto ai metodi precedenti. Di conseguenza, il nuovo saggio è più scalabile e quantificabile e quindi più adatto per schermi genetiche di geni e neuroni coinvolti nella motivazione. Usiamo questo nuovo test, insieme a saggi di corteggiamento e neurogemanipolazioni tiche, per dimostrare come misurare e modificare unità di accoppiamento in volo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/16 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8589K12</td>
			<td style="width:743px;">Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/8 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8589K42</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3/16 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8560K219</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/32 inch black delrin</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8575K132</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hex screws, 1 inch long (50x)</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>92314A115&#160;</td>
			<td>Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thumb nuts (25x)</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>92741A100</td>
			<td>Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Camcorder</td>
			<td style="width:119px;">Canon</td>
			<td>Vixia HF R700</td>
			<td>Can be replaced by any consumer comcorder.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and altering mating drive in male drosophila melanogaster

Nonostante decenni di ricerca, le basi neuronali e molecolari degli stati motivazionali rimangono misteriose. Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo, riduzionista, e il sistema scalabile per un&#39;indagine approfondita della motivazione utilizzando l&#39;unità di accoppiamento del maschio Drosophila melanogaster (Drosophila), i metodi per la quale abbiamo dettaglio qui. Il paradigma comportamentale centra sulla constatazione che l&#39;unità di accoppiamento maschio diminuisce la fertilità a fianco nel corso di accoppiamenti ripetuti e recupera oltre ~ 3 d. In questo sistema, gli strumenti potenti neurogenetici disponibili nei fly convergono con l&#39;accessibilità genetica e schema elettrico putativo disponibile per comportamento sessuale. Questa convergenza consente un rapido isolamento e l&#39;interrogatorio di piccole popolazioni neuronali con specifiche funzioni motivazionali. Qui si dettaglio la progettazione e l&#39;esecuzione del test sazietà che viene utilizzato per misurare e modificare la motivazione di corteggiamento nel moscerino maschio. l&#39;utilizzo di questotest, abbiamo anche dimostrato che rasoterra accoppiamento maschio può essere superata attraverso la stimolazione dei neuroni dopaminergici. Il saggio sazietà è semplice, economico e robusto per le influenze di background genetico. Ci aspettiamo che il saggio di sazietà per generare molte nuove intuizioni nella neurobiologia degli stati motivazionali.

Per caratterizzare unità di accoppiamento Drosophila, 3 giorni di età, maschi WT Canton-S sono stati testati in un saggio sazietà 2-D. Nel corso del test (4.5 h), i maschi si accoppiano una media di 4,8 ± 0,3 (media ± errore standard della media, SEM) volte. Accoppiamenti iniziano soprattutto nei primi 2 h (78%) (Figura 6A, 6B) e diventano meno frequenti come il saggio progredisce (Figura 6A, 6B). Questa diminuzione non è dovuta alla manca...

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Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Questo articolo descrive un test comportamentale che utilizza unità di accoppiamento maschio in Drosophila melanogaste R per studiare la motivazione. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono utilizzare mosca avanzate tecniche neurogenetiche per scoprire i meccanismi genetici, molecolari e cellulari che sono alla base questa motivazione.

Misurazione e l&#39;alterazione di accoppiamento Drive a Maschio<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

measuring-and-altering-mating-drive-in-male-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

11.0K Views.  Boston Children’s Hospital.  Questo articolo descrive un test comportamentale che utilizza unità di accoppiamento maschio in Drosophila melanogaste R per studiare la motivazione. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono utilizzare mosca avanzate tecniche neurogenetiche per scoprire i meccanismi genetici, molecolari e cellulari che sono alla base questa motivazione. 

Video: Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Ricerca

Neuroscienze

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Assay Semplice per la quantificazione della Social Prevenzione in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tintoria Insetti per comportamentali saggi: il comportamento di accoppiamento di anestetizzati<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condizioni che influiscono spazio sociale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Le larve

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...