L'obiettivo di questo protocollo è quello di semplificare l'esperimento knock-in mediato CRISPR / Cas9 in linee di macrofagi e cellule T, con l'aiuto di reporter fluorescenti e influenzare lo smistamento cellulare. ROSA26 Locus è noto come sito genomico safe harbor per l'inserimento di transgeni. È un normale esprimere proteine di interesse con o senza attacco nel mondo topo di 26 locus, o nel log ortopedico umano.
Parte 1: Progettazione e costruzione di plasmidi di sgRNA destinati a Rosa26 Locus. In primo luogo, progettare sgRNA dal locus Rosa26 del topo, utilizzando sequenze dall'informatica del genoma del topo e Dall'Ensemble Genome Browser, quindi scaricare la sequenza genomica del gene Rosa26 del topo. Vai allo strumento web online, CRISPOR, incolla 100 coppie di basi della sequenza di input dal Rosa26 Locus.
Quindi selezionare un genoma, ad esempio, Mus musculus-mouse reference genome 2011. Quindi, selezionare il tipo di PAM. Utilizzare il motivo NGG"PAM a 20bp, riconosciuto da spCas9.
Fai clic su Invia. Scegli la guida con un punteggio di specificità elevato, un punteggio di attività elevato e un minor numero di obiettivi fuori bersaglio. Le guide indicate come inefficienti dovrebbero essere evitate.
In particolare, è preferibile selezionare due guide con sequenze sovrapposte, che possono aumentare l'efficienza di knock-in come riportato. Per la sequenza di cena calda, sintetizzare un illegale in avanti e un illegale di inversione, che ricotto fosforato e pronto per la clonazione a fattore. Preparare la diminuzione linearizzata per Vactor a cui potrebbe esprimere è devo reporter da BBS una digestione, come ottenere il Neal, i legali al vettore linearizzato per generare il costrutto finale, che esprime simultaneamente l'RNA guida e il CAS nove nucleo collegato con un DSRIP due reporter fluorescenti.
Parte seconda: Costruzione del vettore di targeting come modello di ricombinazione omologa. Per l'espressione della proteina di interesse. Ad esempio, l'umano è durato.
Si desidera sintetizzare la sequenza di cDNA per fonte commerciale e il tag OST di affinità o altro attacco comunemente usato per la purificazione delle proteine può essere fuso alla sequenza cDNA. Ricordarsi di includere la sequenza di consenso kazako prima dell'inizio del cDNA. Digerito dall'enzima di restrizione Asc1, e come ottenere il CD e l'inserto nella spina dorsale.
Vactor, vale a dire pKhR26-IBFP IBP che produce il targeting finale concentrare il contenitore, ciascuno, KB di cinque bracci omologhi primi e tre primi. Il set di cast di espressioni include un promotore CG, il ristorante UST, se si desidera che la regione koonin sia collegata a un Iris, se il reporter VFD e un poly AC fondi. Infine, all'orizzonte, prendendo di mira il vettore utilizzando enzimi di taglio unici, come EcoR1 o BamH1, i digest e il prodotto vengono purificati in un negozio che meno 20 gradi sulle note di elettroporazione.
Si raccomanda di ottenere un'alta concentrazione di DNA vettoriale linearizzato. Parte terza: L'elettroporazione delle linee di macrofagi e cellule T prepara la coltura cellulare seguita alla separazione per le cellule geritalk. La densità cellulare ottimale era di circa 0,5 milioni di cellule per ML al momento della trasfezione.
L'elettroporazione completa in dieci macro piccoli formati di punta di moda nucleare prepara una piastra a 24 pozzetti contenente 500 microlitro di crescita completa, mezzo senza antibiotici in ogni pozzetto. Preriscalda le piastre in umidificate a 37 gradi, il 5% coprendo quell'incubatore di impostazione. Abbassare i parametri di elettroporazione di ingresso del sistema di funzionamento elettrico per jet cat o Rosales.
Preparare i follow-up della miscela di DNA cellulare o l'operazione raccogliere le cellule di pollo. Curchin 25 centimetri quadrati celle di trasferimento del pallone nei 15 animali. Dal momento che tu tubo, quindi Phillip le cellule per centrofugazione a 90 volte G per otto minuti a temperatura ambiente, chiedilo, i supernatanti.
Per il lavaggio, sospendare le cellule con i cinque ML PBS, quindi ruotare la sospensione cellulare mediante centrifugazione utilizzando la stessa condizione del passaggio precedente. Rimuovere i DPP. E risuspendare i cuscini delle cellule usando due ML di DBS.
Si rimane micro piccola cella sospensione e mescolare con lo stesso volume di 0,2% Trepan Ballou per stimare il conteggio delle celle carico campione in termini di conteggio slot inserire Connie slide nella cella automatizzata Connor e visualizzare l'immagine stessa. Quindi ottenere un risultato di conteggio delle celle. Calcola 2 milioni di celle troverà la reputazione di elettroporazione per esperimento di knocking trasferire il numero di celle in 1,5 ML.Centrifugare due celle a pellet mediante centrifugazione.
Per risparmiare tempo, la miscela di elettroporazione può essere preparata durante la centrifugalizzazione che aggiunge 2,5 microgrammi di ciascuno di CRISPR CAS nove vettori 2,4 microgrammi di riso Belinda, vettore loquace e risosoluzione bufalo. Il nostro volume totale totale di 55 macro lettiera in un nuovo tubo centrifugato da 1,5 ML vertex delicatamente e. Stare brevemente in piedi per mescolare bene.
Lasciare la miscela a pressione Luxor e la temperatura ambiente prima dell'uso. Dopo la rotazione aspart, il DTB è questo essenzialmente fusibile per altri 30 secondi, rimuovere il maggior numero possibile di surnatante riaspensere le celle aggiungendo delicatamente la pipetta della miscela di elettroporazione preparata su e giù. L'elettroporazione ha chiesto che il miscelatore di elettroporazione della cella utilizzasse 10 micro piccole punte di fazione nucleare era importante per le pipette.
Evitare bolle d'aria durante il pi petting costerà un guasto galvanica. Premere start. dopo di che l'operazione trasferisce il campione in un po '.
Pozzo di 24, le piastre del pozzo con un pre-avvertimento del mezzo lordo eseguono la stessa pressione elettrica e le stesse procedure di cui sopra sui restanti quattro campioni replicati, scuotere delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme delle celle. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi per 48-72 ore. Prima del fatto, lo smistamento delle cellule A 24 ore dopo la trasfezione, esaminare l'espressione di interruzione due per il reporter del ristorante utilizzando la microscopia fluorescente staccata dal rappresentante per noi stessi indica che l'elettroporazione funziona correttamente.
Parte 4: ordinamento delle celle per isolare le cellule putative knock-in. Prima di preparare la selezione delle cellule, in 96 piastre di pozzetto con 150 micro piccole di mezzo lordo specifico del tipo di cella per pozzo utilizzare il micro posto inferiore sbagliato per la coltura e se stesso e il micro posto a fondo piatto per tutte le cellule trasferiscono le cellule in un FACS sterile per mantenere il tubo sul ghiaccio e per mettere la scatola nel percorso attraverso la finestra, collegamento alla sala di selezione delle cellule quando applicabile impostare il sorter cellulare con ugello da 85 micrometri e bassa portata per lo smistamento delle cellule immunitarie per ottenere una valutazione e una sopravvivenza ottimali delle cellule, prendere brevemente i campioni dal vertice della finestra passante e caricare il campione nelle acquisizioni. Champer ha impostato il pattinaggio di fatto per lo smistamento delle celle prima ha definito gli imbuti di vendita per lo scatter Ford e lo scatter laterale, quindi ha definito le cellule di vita ottenendo il set parla di cellule rosse negative.
Successivamente, trovano una singola cellule vive per singolo singoletto gating usando l'FSC H contro FSE un blocco multi-vario. Infine impostare un gate per i DSR desiderati due e B se la sottopopolazione Volvo positiva, che indica che le cellule sono co-trasfettate con successo con il vettore CRISPR e il vettore tascabile. Quindi 10 cellule singole in ciascun pozzetti del 96, piastra di pozzo integrata con il preguerra, il mezzo di crescita completo usando la modalità periodo o la modalità a singola cellula dopo lo smistamento incubano le 96 piastre di pozzo nell'incubatore di colture cellulari per l'espansione cellulare.
Parte quinta: screening dell'elevazione delle cellule knock-in positive Dopo circa due settimane di espansione cellulare oltre la sopravvivenza, le cellule nella piastra a 48 pozzetti valutano l'espressione di BFP o citometria a flusso utilizzando una piccola percentuale di proliferano se stessa utilizzando le cellule di tipo a parete come popolazioni cellulari di controllo negative, possedendo una percentuale più elevata di cellule positive BFP sono mantenute per soddisfare l'estratto di convalida il DNA genomico dalle cellule che dovremmo esprimere BFP passa il DNA genomico isolato mediante PCR con primer che coprono ciascun lato dei bracci omologhi, vale a dire uno primario individua nella sequenza genomica, esterno al vettore di targeting. Il lato visto per parlare con il vettore in questo esperimento, la dimensione prevista del prodotto PCR amplificato con il primario è 1,2 KV. E con F due e R due è 1.2 KB Risultati di sequenziamento Sanger. Quindi i prodotti PCR mostrano le sequenze di ogni giunzione di integrazione dimostrando la posizione corretta e di bussare nel Rosa 26 Lucas.
Dico come l'immuno blotting consente la convalida del corretto bussare a livello proteico parte sei risultati rappresentativi. Ad esempio, pubblicato in uno studio precedente, abbiamo espresso che ottenere 45 molecole tack che l'inter con un tag OSD, e c'era un 26 locus nel checkout delle cellule T successivamente USD tatto. Ottengo 45 e direttori di incidenti o abbattuti dalla purificazione dell'affinità e un soggetto alla spettrometria di massa.
I dati di proteomica hanno rivelato l'interazione delle cellule T. Pertanto questo pool di prodotti ha notevolmente facilitato la ricerca di nuovi intercalatori per chiarire la funzione di una determinata proteina. Questa presentazione tecnica ha mostrato che per espresso transitoriamente aumentato per linea di cast RFP con il vettore parlante co-espresso e BFP per Rosa 26 locus.
Abbiamo generato linee cellulari knocking con espressione genica permanente sia nelle cellule T che nei macrofagi, che sono difficili da eseguire nelle manipolazioni genetiche. Questi metodi e raccomandazioni sono applicabili a Chris consentiti nelle asserzioni di ampio segmento di DNA per studi meccanicistici delle cellule immunitarie, come per l'identificazione di proteine, studio di interazione proteica.
