Name: functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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Finanziamenti dei National Institutes of Health (concede R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 e F32 DK103500), CIMIT progetto n 12-1732 e gli ospedali Shriners per i bambini è riconosciuto con gratitudine. Vorremmo riconoscere con gratitudine il Organ Bank New England per sostenere questo lavoro.

L&#39;uso di tessuti umani deve essere rivista da un comitato istituzionale (IRB) o equivalente. Il lavoro qui descritto è stato approvato e dichiarato esenti dal Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (n 2011P001496). 1. Soluzione Preparazione <ol><li> Aggiungere asetticamente integratori per fenolo rosso-libero Williams &#39;medium E come indicato nella tabella 1. La soluzione deve essere preparato fresco prima dell&#39;uso. L&#39;insulina deve essere aggiunto al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Torna Tabella Preparazione del fegato <ol><li> Inserire un ciotola organo pieno di ghiaccio su una sterile superficie drappeggiato. Rimuovere il fegato dalla scatola, lasciando nel sacchetto di soluzione di conservazione a freddo. Tenere il fegato per lo più sommerso. </li><li> Identificare l&#39;arteria epatica (HA), che sarà situato distale alla patch aortica. Sezionare libera l&#39;arteria di rivelare diversi rami tagliati nel senso della lunghezza con le forbici Metzenbaum. Attenzione Dissect l&#39;intera lunghezza dell&#39;arteria per impedire recidere una nave che alimenta il fegato. Non tagliare o legare i rami che non hanno una fine visibile. </li><li> Tie off tutti i rami arteriosi non forniscono fegato con sutura di seta dimensioni che vanno da 0 a 4-0, a seconda della dimensione del vaso. Chiudi rami che sono troppo brevi per legare o fori nella arteria con un punto di 7-0 prolene. Tie e tagliare le arterie gastriche milza e di sinistra vicino alla loro origine sul tronco celiaco. </li><li> Rimuovere la patch aortica tagliando il tronco celiaco direttamente sotto la patch. Incannulare il tronco celiaco con la cannula aortica. </li><li> Identificare la vena porta (PV) e senza mezzi termini sezionarlo gratuito. Legare i rami e incannulare il fotovoltaico con il segmento preparata di dimensioni 24 tubi. </li><li> Rimuovere sezioni della membrana dalla vena cava sovraepatica, senza tagliare la vena stessa. Deflusso di fogna cavali direttamente nella camera di organo. </li><li> Cut 2 full-circonferenza ticampioni SSUE (2-3 mm di lunghezza) dalla fine del dotto biliare comune; SNAP congelare uno in azoto liquido (conservare a -80 ° C) e conservare l&#39;altra in 10% formalina tamponata, per il tessuto e l&#39;analisi istologica, rispettivamente. Incannulare il dotto biliare comune con la cannula nave e un tubo di scarico in tubolare di membrana ossigenatore. </li><li> Identificare e legare il dotto cistico con una cravatta di seta 0. Il dotto cistico si trova tra il dotto biliare comune e la cistifellea. </li><li> Collegare il tubo di colore impostato su borse di ghiaccio freddo di Ringer lattato (LR) e riempire il tubo, rimuovendo tutta l&#39;aria. </li><li> Impostare il regolatore di flusso sul tubo a filo con un filo lento. Prima di collegare il tubo filo alla cannula vena porta, occlude la vena porta con le dita al ilo e riempire la cannula e la vena con filo per rimuovere l&#39;aria dalla vena porta. Non elevare la borsa più di 20 cm sopra l&#39;altezza del fegato durante lavaggio fredda per evitare un&#39;eccessiva pressione sulvena. </li><li> Durante brevemente filo occludere il PV nel punto più basso. Esaminare il PV di perdite. Rami vaso può essere chiusa come descritto sopra. Lavare il fegato attraverso il PV con un totale di 2 L di LR ghiacciata. </li><li> Ripetere i punti 2.10, 2.11 per l&#39;HA con 1 L di LR. </li></ol> 3. Adescamento del sistema SNMP <ol><li> Prime dispositivo perfusione aggiungendo 2 L di perfusato (21 ° C) per la ciotola organo e avviare il dispositivo per riempire il tubo. Seguire le istruzioni del dispositivo di prepararsi per la perfusione, impostare la temperatura a 21 ° C. Iniziare con pressioni di 3 mmHg e 30 mmHg sul fotovoltaico e HA, rispettivamente. Aprire il serbatoio e regolato ad una portata di 3 L / min. </li><li> Prelevare un campione di sangue dal gas sia al flusso HA e PV tracciando un campione dai porti campione 0,3 ml e in esecuzione nella macchina emogasanalisi secondo le istruzioni del produttore. Conferma un&#39;adeguata ossigenazione (pO 2&gt; 700 mmHg) e pH (7,35-7,45). </li><li> Prima fegato è collegato prelevare un campione del perfusato 1,0 ml al = 0 misurazione in una provetta Eppendorf e conservare a -80 ° C. Tagliate due ± 250 biopsie cuneo mg dal fegato con una lama singola taglio di acciaio; SNAP congelare uno in azoto liquido (conservare a -80 ° C) e conservare l&#39;altra in 10% formalina tamponata. Pesare il fegato prima di perfusione. </li></ol> 4. umano Fegato Perfusion <ol><li> Trasferire il fegato al dispositivo. Collegare l&#39;afflusso PV alla cannula PV, dopo la rimozione dell&#39;aria dal PV come al punto 2.10. Collegare il HA in modo simile. Impostare PV e pressione HA a 3 e 30 mmHg. Il fegato dovrebbe essere quasi sommersa dal perfusato. Coprire tutte le superfici asciutte, compresi i vasi di afflusso, con bagnato garza sterile per prevenire la disidratazione </li><li> Lasciate che lo scarico tubo bile in un contenitore di raccolta. Assicurarsi che l&#39;apertura dello scarico bile è a livello del fegato o inferiore per consentire bile eseguire out liberamente. </li><li> Le portate di destinazione sono rispettivamente 275-325 ml / min.kg e 50-100 ml / min.kg per il fotovoltaico e HA una volta che il fegato si è riscaldata a 21 ° C. Poiché ogni fegato reagisce in modo diverso a perfusione, monitorare il flusso vicino durante i primi minuti. Aumentare o diminuire la pressione su una delle navi, se non sono raggiunte le portate di destinazione. Non superare i 50 mmHg sul HA e 5 mmHg sul fotovoltaico. </li><li> I campioni possono essere prelevati dal tessuto epatico, perfusato e bile presso la preferenza investigatori. Si consiglia come minimo il seguente regime di raccolta del campione durante la perfusione. <ol><li> Biopsie tissutali, n = 2 x 250 mg, ogni ora. Conservazione: scatto congelare uno in azoto liquido e conservare a -80 ° C a lungo termine. Inoltre, prendere un altro biopsia prima e dopo perfusione e fissare nel 10% formalina tamponata (n = 1) </li><li> Campioni perfusato, n = 2x 1 ml ogni 15 minuti per la prima ora e successivamente ogni 30 min. Disegnare campioni dalla inf PVbasso porta di campionamento. Conservazione: -80 ° C a lungo termine. </li><li> Analisi dei gas del sangue di PV e HA afflusso e deflusso vena cava. n = 3 x 0,3 ml ogni 30 min. Disegna campioni sia dal fotovoltaico e porti campione HA. Disegnare un campione dalla vena cava 0,3 ml inserendo una siringa nella vena ed eseguire direttamente nel emogasanalizzatore. Utilizzare l&#39;uscita per assicurare un&#39;adeguata ossigenazione e pH. </li><li> La produzione di bile, n = 1 x 1 ml, ogni ora. Visivamente quantificare la produzione di bile ogni ora e prendere un campione dal contenitore di raccolta. Rinnova il contenitore dopo il prelievo. Conservazione: il ghiaccio secco e -80 ° C a lungo termine. </li></ol></li><li> Continuare perfusione per 3 ore. Monitoraggio della pressione, pH e l&#39;ossigenazione e prendendo campioni in tutto. Regolare il pH che aggiungendo bicarbonato di sodio al perfusato. </li><li> Al termine della perfusione prendere campioni finali mentre il fegato viene perfuso. Scollegare il fegato e rimuovere la cannula dotto biliare. Take 2 campioni di tessuto post-perfusione deldotto biliare come descritto prima per lo stoccaggio a -80 ° C in 10% formalina tamponata. </li><li> Eliminare il fegato umano secondo le linee guida di smaltimento corretto rischio biologico. </li></ol>

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DRS. ESSERE Uygun, K Uygun e Yarmush sono inventori su un attesa di brevetto che è rilevante per questo studio (WO / 2011/002926), e Drs. ESSERE Uygun, K Uygun e Yarmush sono inventori su un attesa di brevetto che è rilevante per questo studio (WO / 2011/35223). DRS. K Uygun e Bruinsma hanno una domanda provvisoria di brevetto relative a questo lavoro. Dr. K Uygun e BE Uygun hanno un interesse finanziario in Organo Solutions, una società focalizzata sullo sviluppo di tecnologie di conservazione degli organi. Dr. K Uygun e BE interessi Uygun sono gestite dal MGH and Partners HealthCare in conformità con il loro conflitto di interessi politiche.

Nel tentativo di recuperare fegati feriti durante ischemia abbiamo sviluppato un sistema SNMP che può essere impiegato dopo un periodo di conservazione frigorifera. Subnormothermic perfusione macchina offre una valida alternativa allo stoccaggio a freddo convenzionali, così come le modalità della macchina di perfusione ipotermia e normotermici. Esistono vari sistemi diversi; tutti offrono diversi vantaggi e svantaggi 3,9,20. SNMP permette di perfusione senza un vettore di ossigeno, come le richieste di ossigeno metaboliche a 21 ° C sono soddisfatte da ossigenazione attiva del perfusato. Anche se ridotte in condizioni subnormothermic, il metabolismo è sostanziale e richiede il supporto di una soluzione di perfusione ricco di sostanze nutritive. Soluzioni perfusione tradizionali, come la soluzione macchina perfusione Belzer, sono generalmente minima composizione e sono progettati per perfusione fredda. Williams &#39;medio E&#39; stato utilizzato come mezzo di coltura di epatociti per molti anni, e contiene componenti che sono universali per sostenere la funzione cellulare, in particolare in condizioni di caldo ex vivo. Misure effettuate durante macchina perfusione sono riflettenti della funzione dell&#39;organo. Parametri direttamente osservabili come la produzione di bile e consumo di ossigeno sono misurazioni in tempo reale che possono essere utilizzati per valutare il fegato pre-trapianto. Allo stesso modo, i marcatori di danno cellulare e ischemia (K +, il rilascio di lattato) possono essere misurati direttamente nella soluzione di perfusione e possono essere indicativi della funzione dell&#39;organo 20. Come la tecnologia della macchina di perfusione sviluppa ulteriormente e raggiunge più vasta applicazione clinica, correlazioni precise tra ex vivo la funzione e il risultato clinico possono essere fatte e parametri di perfusione saranno utili nel favorire decisioni di trapiantare o respingere fegati marginali qualità. Inoltre, come punto di assistenza strumenti analitici anticipo, un&#39;analisi più sofisticata sarà disponibile direttamente in macchina perfusione 21. In questo lavoro abbiamo dimostrato che i fegati possono essere supportati nel sistema SNMP con lesioni minime al fegato, riflessa da istologia e il rilascio di ALT. Il recupero funzionale del fegato è meglio riflessa da ATP, che ha dimostrato di correlare la redditività fegato ed è fortemente indicativi del successo del trapianto in modelli animali 22. Ex vivo e recupero pre-trapianto di fegati consentirebbe una significativa espansione del donatore piscina fegato, correggere la disparità tra domanda e offerta di fegati donatori nel trapianto.

Il trapianto di fegato è l&#39;unico trattamento curativo per decine di migliaia di pazienti che soffrono di malattia epatica allo stadio terminale. Per facilitare il trapianto successo, conservazione ottimale del fegato dal momento in cui viene procurato dal donatore fino al momento in cui viene impiantato nel ricevente è necessaria per evitare un rapido deterioramento del trapianto. L&#39;attuale standard per la conservazione del fegato è chiamato &#39;frigoconservazione static&#39;: il fegato viene raffreddato in una soluzione di conservazione ghiacciata, riducendo così il metabolismo del fegato e rallentare gli effetti deleteri di ischemia. Sebbene questa tecnica di stoccaggio a freddo ha permesso per il trapianto di successo, gli organi di qualità marginale, come organi DCD danneggiati da ischemia calda o steatosi spettacolo paziente inferiore esiti 1. C&#39;è un corpo in rapida espansione di prove che ex vivo macchina perfusione di fegati come modalità di conservazione alternativo può potenzialmente imdimostrare i risultati per questi organi marginali 2,3. Il trapianto di fegato è diventato una vittima del suo stesso successo. Far più pazienti sono indicati per il trapianto di fegati sono disponibili, e di morire in lista d&#39;attesa negli Stati Uniti ogni anno. Data la realtà della scarsità fegato del donatore e il crescente utilizzo di fegati di qualità non ottimale per i destinatari bisognosi, è opinione diffusa che ex vivo macchina perfusione di innesti di fegato prima dell&#39;impianto mantiene la promessa di un cambiamento di paradigma nel trapianto di fegato. C&#39;è stato un notevole aumento di interesse della ricerca in questo tema negli ultimi anni 4-8. In diversi centri europei e nordamericani macchina ipotermico perfusione ha fatto una clinica introduzione 8 e normotermica macchina perfusione a temperature fisiologiche è stata recentemente applicata al fegato umano scartati e viene tradotto in uso clinico e 9.Ampia sviluppo ha portato allo sviluppo di diversi protocolli, mentre l&#39;ottimizzazione continua identifica i parametri della perfusione ottimale 10-12. L&#39;uso di innesti marginale qualità è aumentato più di 10 volte negli ultimi dieci anni 13. Quando confrontato con l&#39;attuale standard per la conservazione del fegato (celle frigorifere statiche), ex vivo macchina di perfusione offre numerosi vantaggi potenziali, i quali si traducono in tanto necessaria espansione della piscina organo e potenzialmente diminuire l&#39;incidenza di complicanze post-trapianto. In particolare, le complicazioni biliari che attualmente affliggono fegati non ottimale di qualità dopo il trapianto rimangono una questione sostanziale 14-18. Macchina perfusione a condizioni subnormothermic fornisce una finestra di tempo per valutare la funzione del trapianto oggettivamente per idoneità al trapianto 19. Mentre il fegato viene perfuso in un circuito ex vivo, sia il perfusato unnd la bile prodotta durante la perfusione può essere campionato per la misurazione dei marker della funzione dell&#39;organo. In questo modo &#39;gravemente compromesse&#39; fegati che vengono scartati per il trapianto in base ai criteri attuali possono essere oggettivamente valutati in merito alla loro idoneità per il trapianto. Valutazione della vitalità economica potenzialmente permette per molti di questi organi da utilizzare per il trapianto. Un altrettanto potente beneficio della macchina perfusione è la riparazione e il miglioramento della fegati che sono stati danneggiati da caldo / freddo ischemia. ATP è esaurito molto rapidamente durante ischemia fredda calda e successiva e può essere repleted durante un periodo di macchina di perfusione prima dell&#39;impianto del fegato 20. Il fegato, con le sue riserve di energia e lo stato metabolico rifornito, è condizionato e meglio preparati per gli effetti pregiudizievoli del danno da riperfusione dopo l&#39;impianto nel ricevente. Questo lavoro descrive un metodo ex vivo macchina perfusione del fegato umano grafts in laboratorio, che saranno utili per i ricercatori che vogliono studiare sia la tecnica e effetti benefici della macchina perfusione ex vivo. Noi facciamo uso di fegati donatori umani che sono state diminuite per il trapianto e sono quindi destinati a fini di ricerca. Standard tecnica appalti fegato comporta in filo arteriosa situ del fegato dopo clampaggio aortico in donatori morti cerebrali (DBD) o dopo l&#39;arresto circolatorio in donatori circolatori morte (DCD), descritti in dettaglio altrove 20. Inoltre, il fegato è raffreddato durante il prelievo riempiendo cavità addominale del donatore con ghiaccio. Preferenze soluzione Flush variano tra le regioni, con la maggior parte degli appalti con l&#39;Università del Wisconsin o soluzione istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK). Un ulteriore back-tavolo a filo della vena porta migliora la washout di sangue residuo. Livers sono spesso acquistati lasciando un sur segmento aorticoarrotondando il tronco celiaco. La colecisti è incisa, la bile viene aspirato, e il dotto biliare viene svuotata. I fegati sono confezionati in sacchetti sterili contenenti soluzione di conservazione ghiacciata e trasportati in scatole o refrigeratori designati. Per risultati rappresentativi tempo di ischemia calda e fredda dovrebbe essere limitato a 60 min e 12 ore, rispettivamente. Nonostante lo screening sierologico di routine per gli agenti patogeni trasmissibili, precauzioni standard devono essere prelevati al momento della consegna di organi umani, campioni ottenuti da organi umani, e tutti i prodotti di scarto. Il protocollo qui descritto perfusione macchina subnormothermic utilizzando un dispositivo di perfusione del fegato in commercio. L&#39;uso di un tale dispositivo permette di traduzione più rapida l&#39;impostazione clinica e cross-validazione di diversi protocolli e le impostazioni del dispositivo tra i gruppi di ricerca e centri di trapianto.

<table><tbody><tr><td>Liver Assist perfusion device</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>Liver Assist disposable set</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist disposable</td><td></td></tr><tr><td>Williams&amp;rsquo; Medium E</td><td>Sigma</td><td>W1878&amp;ndash;6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Eli Lilly &amp;amp; Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>MGH pharmacy</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas tank 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Specialty gas regulator</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&amp;rsquo;s solution</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral buffered formalin</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Toothed Adson forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Debakey tissue forceps, 7.75&amp;rdquo;, 2.25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors 7&quot; Curved SureCut Tungsten</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle holder 5.5&amp;ndash;7&amp;rdquo;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 blackbraided silk sutures</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>Blood gas analysis machine</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Balance scale</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pressure display box</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pressure display sets</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 and EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Irrigation set flush tubing</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Mixing bowl, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

Un certo numero di osservazioni e analisi può essere eseguita sul fegato durante la perfusione, comprese osservazioni dirette in tempo reale, quali portate e produzione di bile; misurazioni in tempo reale, come l&#39;analisi dei gas del perfusato, e le misure post-hoc che sono fatti dopo la raccolta del campione compresa l&#39;analisi biochimica del perfusato e tessuti e l&#39;analisi istologica. I risultati qui menzionati sono da 22 perfuso fegato umano. I fegati sono state respinte per il trapianto per vari motivi, tra cui l&#39;età del donatore, eccessivo tempo di ischemia calda, risultati della biopsia (steatosi, infiammazione, fibrosi) e per motivi logistici. 18 fegati sono stati acquistati dopo la morte cardiaca, e 4 dopo la morte cerebrale. In entrambi i casi, i donatori sono stati pretrattati con 30.000 unità di eparina e lavati in situ e la tabella indietro con la soluzione UW. Il tempo medio di ischemia fredda era 531 ± 237 (SD) min e il tempo di ischemia calda media era 27 ± 10 (SD) min, misurata dal ritiro di vitasupporto a filo freddo. Osservazioni tempo reale e misurazioni possono essere utilizzati per valutare fegato durante la perfusione, mentre misurazioni post-hoc vengono rivelate dopo la perfusione. Aggiornamento in tempo reale Flusso attraverso il fegato inizia inferiore le portate di destinazione, come risultato di una maggiore resistenza nel fegato freddo. Utilizzando una pressione di 3 mmHg sul PV e 30 mmHg in HA flussi destinazione possono generalmente essere raggiunto quando gli fegato è scaldato fino a 21 &#160; ° C dopo 60 min di perfusione (Figura 1A). Il flusso di bile può essere generalmente rispettato entro 10 min di perfusione ed è prodotto costantemente durante la perfusione (Figura 1B). Bile quantità dipende dalla qualità del fegato e varia da 0,3 ml / h / kg di fegato a 18 ml / min / kg. In fegatini con più tempo di ischemia calda, il flusso biliare tenderà a diminuire, mentre brevi calde risultati in tempo ischemici in un più stabile o addirittura in aumentola produzione di bile. Misurazioni in tempo reale Misura diretta e frequente del perfusato mediante analisi dei gas del sangue in essenziale sia per scopi sperimentali e mantenere condizioni di perfusione adeguate, soprattutto ossigenazione e pH. Disciolto pressione parziale di ossigeno dovrebbe essere maggiore di 700 mmHg sull&#39;afflusso sia del PV e HA. Pressione di ossigeno Outflow, misurata nella vena cava, generalmente diminuisce con perfusione più, riflettendo un consumo di ossigeno crescente. Tassi di assorbimento di ossigeno possono essere calcolate come descritto in precedenza 13 e variava 0,5-2,2 ml O 2 / min / kg all&#39;inizio della perfusione di 2,4-9,7 ml O 2 / min / kg a t = 3 ore (Figura 1C). Una goccia del pH si osserva nei primi 30 min (Figura 1D), principalmente per effetto del rilascio di lattato nel perfusato. Questo può essere sostenuto da supplementazione con 8,4% di sodio bicarbonate e dopo circa 90 minuti il ​​pH ricade nel range di normalità. Comunemente, 30-50 ml di 8,4% di bicarbonato di sodio è richiesto. Concentrazione aumenta rapidamente lattato nel primo 15-30 min, ma comincia a decesso dopo la prima ora (Figura 1E). Misurazioni post-hoc Transaminasi epatiche, come ALT possono essere misurate nel perfusato. Nei primi 30 minuti un grande aumento di ALT è generalmente osservato che riflette il dilavamento di ALT che è stato rilasciato durante ischemia (Figura 1F). ALT ha dimostrato di correlare bene con il caldo tempo ischemico 13. Perfusione macchina aumentato contenuto di ATP 2,8 volte, riflettendo lo stato di energia di recupero (Figura 1G). H &amp; E l&#39;analisi istologica rivela alcun pregiudizio addizionale subito durante macchina di perfusione (Figura 1H, I). Va notato che il regime biopsia proposto in questo protocollo è per resfinalità earch e non possono essere applicabili per scopi clinici. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figura 1:. La valutazione di fegati umani durante macchina perfusione flusso attraverso il fotovoltaico e HA durante SNMP (A), la produzione di bile, quantificato per ora di perfusione (B), l&#39;ossigeno tasso uprate (OUR), calcolata in base alla differenza di afflusso (PV + HA) e deflusso (vena cava), interrotte le linee mostrano pressioni parziali di ossigeno nel in- e deflusso durante perfusione (C), pH e del lattato durante perfusione (D, E), rilascio di ALT nel perfusato (F), ATP contenuto misurata nel tessuto da biopsie orarie (G) e H &amp; E macchie di fegato (54 anni DCD, 19 min ischemia calda, 559 min ischemia fredda) prima (H) e dopo (I) perfusione. I risultati sono presentati come media ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Descriviamo un metodo di ex vivo macchina perfusione di innesti di fegato umano a temperatura subnormothermic (21 ° C).

Umana Funzionale Fegato Conservazione e recupero mediante Subnormothermic macchina di perfusione

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

functional-human-liver-preservation-recovery-means-subnormothermic

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K Views.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School.  Descriviamo un metodo di ex vivo macchina perfusione di innesti di fegato umano a temperatura subnormothermic (21 ° C). 

Video: Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for liver transplantation die without receiving an organ transplant or are delisted for disease progression. One strategy to increase the donor pool is the utilization of marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or donation after cardiac death (DCD). The current preservation technique of cold static storage is only poorly tolerated by marginal livers resulting in significant organ damage. In addition, cold static organ storage does not allow graft assessment or repair prior to transplantation.
These shortcomings of cold static preservation have triggered an interest in warm perfused organ preservation to reduce cold ischemic injury, assess liver grafts during preservation, and explore the opportunity to repair marginal livers prior to transplantation. The optimal pressure and flow conditions, perfusion temperature, composition of the perfusion solution and the need for an oxygen carrier has been controversial in the past.
In spite of promising results in several animal studies, the complexity and the costs have prevented a broader clinical application so far. Recently, with enhanced technology and a better understanding of liver physiology during ex vivo perfusion the outcome of warm liver perfusion has improved and consistently good results can be achieved.
This paper will provide information about liver retrieval, storage techniques, and isolated liver perfusion in pigs. We will illustrate a) the requirements to ensure sufficient oxygen supply to the organ, b) technical considerations about the perfusion machine and the perfusion solution, and c) biochemical aspects of isolated organs.

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or livers retrieved after cardiac death (DCD) tolerate conventional, cold static storage only poorly. We developed a novel model of subnormothermic ex vivo liver perfusion for preservation, assessment, and repair of marginal liver grafts prior to transplantation.

Tecnica di Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fegato perfusione per la Conservazione, valutazione e riparazione dei marginali fegato innesti

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Ricerca

Medicina

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedura per la safena umane Veins<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusione e rinforzo esterno

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic agent melphalan. Briefly, the procedure starts with the setup of a percutaneous veno-venous bypass from the femoral vein to the external jugular vein. Via a laparotomy, catheters are then inserted into the proper hepatic artery and the caval vein. The portal vein and the caval vein, both supra- and infrahepatically, are then clamped. The arterial and venous catheters are connected to a heart lung machine and the liver is perfused with melphalan (1 mg/kg body weight) for 60 min. This way it is possible to locally perfuse the liver with a high dose of a chemotherapeutic agent, without leakage to the systemic circulation.
In previous studies including patients with isolated liver metastases of uveal melanoma, an overall response rate of 33-100% and a median survival between 9 and 13 months, have been reported. The aim of this protocol is to give a clear description of how to perform the procedure and to discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Here, we present a protocol how to perform an isolated liver perfusion (IHP) with melphalan and we also discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Isolata epatica perfusione come Trattamento di metastasi epatiche di melanoma uveale

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Ingegneria

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a serious problem. Therefore, the acceptance criteria for organ donors have been extended leading to the usage of marginal kidney grafts. These marginal organs tolerate cold storage poorly resulting in increased preservation injury and higher rates of delayed graft function. To overcome the limitations of cold storage, extensive research is focused on alternative normothermic preservation methods.
Ex vivo normothermic organ perfusion is an innovative preservation technique. The first experimental and clinical trials for ex vivo lung, liver, and kidney perfusions demonstrated favorable outcomes.
In addition to the reduction of cold ischemic injury, the method of normothermic kidney storage offers the opportunity for organ assessment and repair. This manuscript provides information about kidney retrieval, organ preservation techniques, and isolated ex vivo normothermic kidney perfusion (NEVKP) in a porcine model. Surgical techniques, set up for the perfusion solution and the circuit, potential assessment options, and representative results are demonstrated.

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

The severe organ shortage has resulted in increased use of marginal kidney grafts for transplantation. This has triggered interest in alternative storage methods, since marginal grafts especially tolerate cold storage poorly. The technique of normothermic ex vivo kidney perfusion (NEVKP) represents a novel preservation method for kidney grafts prior to &#160;transplantation.

Normotermica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Rene perfusione per la Preservazione della Kidney Innesti prima del trapianto

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Conservazione ortotopica del trapianto di fegato di maiale mediante perfusione meccanica

Preservation of Porcine Donation after Circulatory Death (DCD) Liver by Perfusion and Orthotopic Liver Transplantation

Conventional static cold storage (SCS) exacerbates ischemic injury in the DCD liver, leading to severe complications for transplant recipients. To address this issue, clinical application of MP technology for donor liver preservation is underway. Simultaneously, efforts are focused on the development of various MP instruments, validated through relevant animal model experiments. Effective large animal trials play a pivotal role in clinical applications. However, challenges persist in the ex vivo preservation of DCD livers and the transplantation procedure in pigs. These hurdles encompass addressing the prolonged preservation of donor livers, conducting viability tests, alleviating ischemic injuries, and shortening the anhepatic phase. The use of a variable temperature-controlled MP device facilitates the prolonged preservation of DCD livers through sequential Dual Hypothermic Oxygenated Machine Perfusion (DHOPE) and Normothermic Machine Perfusion (NMP) modes. This protocol enhances the porcine OLTx model by improving the quality of DCD livers, optimizing the anastomosis technique, and reducing the duration of the anhepatic phase.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Progressi e sfide nella perfusione meccanica per il trapianto di fegato

This protocol outlines the methodology of establishing a porcine model utilizing variable temperature-controlled Machine Perfusion (MP) for the preservation of the donor liver, followed by orthotopic liver transplantation (OLTx). It aims to promote the success rate of OLTx using donor donation after circulatory death (DCD) liver and establish a stable model.

Conservazione della donazione suina dopo morte circolatoria (DCD) Fegato mediante perfusione e trapianto ortotopico di fegato

Conventional static cold storage (SCS) exacerbates ischemic injury in the DCD liver, leading to severe complications for transplant recipients. To address ...

Umana Funzionale Fegato Conservazione e recupero mediante Subnormothermic macchina di perfusione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Tecnica di Subnormothermic

Procedura per la safena umane Veins

Isolata epatica perfusione come Trattamento di metastasi epatiche di melanoma uveale

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori

Normotermica

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

Conservazione della donazione suina dopo morte circolatoria (DCD) Fegato mediante perfusione e trapianto ortotopico di fegato

Conservazione della donazione suina dopo morte circolatoria (DCD) Fegato mediante perfusione e trapianto ortotopico di fegato

Conservazione della donazione suina dopo morte circolatoria (DCD) Fegato mediante perfusione e trapianto ortotopico di fegato