Perfusione della macchina epatica ex-vivo normomica nel topo. La perfusione epatica ossigenata normadremica è una strategia promettente per salvare gli organi marginali ed è stata recentemente introdotta nella pratica clinica. Tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti non sono ben compresi.
È necessario un modello murino per studiare ulteriormente i percorsi molecolari, sfruttando animali geneticamente modificati, come i topi transgenici, quindi in attesa di stabilire un sistema di perfusione normotermica ossigenata per fegati di topo. Ecco uno schema del nostro intero sistema. Innanzitutto, l'intero sistema è controllato a 37 gradi centigradi da un controller termostatico attraverso la circolazione dell'acqua.
Il perfulato viene pompato dal serbatoio da una pompa peristaltica in un ossigenatore. C'è un flusso di gas ininterrotto del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica nell'ossigenatore. Il perfusato passa quindi attraverso una trappola a bolle.
Il perfusato con bolle d'aria viene pompato nel serbatoio sotto pressione. Il perfusato rimanente scorre verso la camera dell'organo dove il tubo è collegato alla vena porta. Il perfusato viene drenato dal fegato attraverso il cava sopraepatico nella camera dell'organo.
Il deflusso del perfulato dalla camera dell'organo viene diretto verso il serbatoio dalla pompa peristaltica. Un tubo di drenaggio della bile è collegato alla camera dell'organo per raccogliere la bile. Questo è il nostro tavolo operatorio.
Tutti gli interventi chirurgici vengono eseguiti al microscopio. Manteniamo condizioni operative semi-sterili durante tutta la procedura chirurgica. Tenere la cannula del tubo francese con una pinza.
Penetrare la parete della cannula con un ago da 30G a un centimetro di distanza dall'estremità della cannula. Spingere l'ago attraverso la cannula fino a quando la punta dell'ago diventa visibile. Ecco un'immagine di confronto del catetere 26G e della cannula autocostruita; Entrambi sono adatti per l'incannulamento del portale del mouse.
Preparare 25 millilitri di soluzione salina eparinizzata con una concentrazione finale di 2.500 unità internazionali per millilitro e posizionare la siringa nell'incubatore impostato a 40 gradi centigradi. Ecco i componenti principali del sistema di perfusione della macchina normotermica ex-vivo. I componenti includono principalmente la camera dell'organo, la macchina termostatica, la pompa a rulli, l'ossigenatore e il serbatoio.
Qui puoi vedere una configurazione dettagliata della nostra camera d'organo. Fondamentalmente, è composto da un corpo della camera dell'organo, un sensore di pressione, uno scambiatore di calore e una trappola a bolle. Abbiamo installato un ingresso di perfuso, un'uscita di perfuso e una porta di drenaggio della bile.
Questo è il sistema di monitoraggio ADI che utilizziamo per monitorare la pressione della vena porta. Il sistema ADI è costituito da un sensore di pressione, un controller centrale e display. Attiva il programma LabChart per il monitoraggio della pressione.
La calibrazione e l'azzeramento sono necessari prima di ogni utilizzo del sensore di pressione. Utilizzare mercurio da zero millimetri e mercurio da 20 millimetri come indicatori per calibrare il sensore di pressione per la calibrazione in due fasi. Sulla base del monitoraggio costante della pressione del portale, possiamo regolare il flurano del portale in base alle variazioni di pressione.
A volumi uguali di perfulato al serbatoio e alla camera dell'organo per innescare il sistema, è necessario prestare particolare attenzione al mantenimento della sterilità durante il processo di riempimento. Collegare la camera di induzione con una presa a muro. Portare l'ossigeno a 0,5 litri al minuto.
Portare l'isoflurano al 3%Posizionare l'animale in camera fino a raggiungere l'anestesia profonda. Utilizzare micro siringa per applicare la dose adattata al peso corporeo di analgesia. Qui, sette microlitri di buprenorfina.
Ora, iniziamo l'operazione chirurgica. Fai un'incisione trasversale nella zona addominale del topo. L'incisione cutanea si estende alla linea ascellare bilaterale della carne su entrambi i lati.
Fare con attenzione un'incisione longitudinale lungo la linea alba. Tagliare lo strato muscolare addominale con elettrocoagulazione e forbici. Posizionare con cura un pezzo di garza bagnata per proteggere il fegato dall'elettrocoagulazione.
Esporre completamente la cavità addominale del topo. Spostare con attenzione l'intestino tenue fuori dalla cavità addominale con un batuffolo di cotone bagnato per esporre completamente l'ilo. Di seguito è mostrato un diagramma schematico dell'incannulamento della vena porta e dell'incannulamento del dotto biliare.
Fondamentalmente, scegliamo la cannula appropriata in base alle dimensioni del mouse e utilizziamo la sutura di seta 6-0 per la fissazione della cannula. Liberare con cura il dotto biliare comune usando una pinza curva fine senza denti. Il dotto biliare comune è molto facilmente danneggiato e si rompe.
Una volta che si rompe, non può essere incannulato. A causa della direzione della posizione anatomica, le pinze curve sono più facili da usare. Posizionare due anelli di sutura di seta 6-0 sul dotto biliare comune in preparazione per il passaggio successivo.
Forare accuratamente il dotto biliare con un ago da 30 G. Utilizzare una pinza curva appuntita per allargare i piccoli fori, in modo che possa alimentare l'incannulamento del dotto biliare. Utilizzare una pinza per l'incannulamento dei vasi attraverso la cannula del dotto biliare e spingerla nel dotto biliare. Nota.
Al momento dell'incannulamento, sentirai la resistenza portata dalla bile. Se la forza non è ben controllata, la cannula verrà spinta fuori dalle vie biliari dalla pressione del deflusso biliare. Regolare con attenzione la profondità della cannula.
Se è troppo profondo, può danneggiare il dotto biliare e, se non è abbastanza profondo, potrebbe scivolare fuori. Il flusso biliare può essere osservato nella cannula dopo l'incannulamento riuscito. Bloccare la vena porta con una pinza piatta e liberare con cura il tessuto connettivo con una pinza curva.
Non tirare forte qui, in modo da non causare lacerazione della vena porta. Una volta che la vena porta è danneggiata, è difficile rec cannulare la vena porta. Posizionare due 6-0 setura Loop sulla vena porta libera.
Utilizzare una clip arteriosa per chiudere la vena porta distale. Forare con molta attenzione la vena porta con una delle cannule della vena porta di cui sopra. Il flusso sanguigno può essere chiaramente osservato all'interno della cannula dopo una puntura di successo.
Prendi la soluzione salina di eparina preriscaldata dall'incubatore. Rimuovere tutte le bolle d'aria. Fissare la siringa con soluzione salina eparinizzata preriscaldata nella pompa della siringa.
Collegare il tubo di prolunga della pompa a siringa alla cannula della vena porta. Regolare la velocità a due millilitri al minuto e avviare il lavaggio del fegato. Aumentare l'isoflurano al 5% e eutanasia del topo con un'inalazione di isoflurano in sovradosaggio.
Osservare il colore del fegato alla fine della procedura di lavaggio. Asportare il fegato una volta che il colore è diventato un giallo omogeneo. Trasferire con cautela il fegato nella camera dell'organo usando una capsula di Petri.
Tenere una piccola quantità di soluzione salina nella capsula di Petri per evitare che il fegato venga schiacciato. Nota. La vena porta e il dotto biliare possono essere facilmente attorcigliati durante questa procedura, che può influenzare la perfusione epatica e la raccolta della bile. Infondere lentamente la soluzione salina normale nella cannula della vena porta con una siringa per evacuare le bolle d'aria nella cannula.
Collegare la cannula della vena porta nel tubo di deflusso del perfulato nella camera dell'organo. La cannula del dotto biliare del topo viene guidata attraverso una valvola della camera dell'organo, che è chiusa con un cappuccio di gomma. Quindi, il tubo biliare viene inserito in un micro tubo da 0,5 millilitri pre-preparato con un piccolo foro nel piombo.
Dopo aver collegato tutto, accendere la pompa peristaltica. Controllare la lettura della pressione della vena porta per regolare la portata. Mantenere la pressione della vena porta tra sette e 10 millimetri di mercurio regolando la portata. Nota.
La portata nominale può variare leggermente a seconda dell'età e del posizionamento dei tubi. Questa è la selezione del mezzo di perfuffato, del volume del perfusato e della pressione di perfusione sulla base di un workup della letteratura di studi di perfusione normothermic oxygenated rat machine perfusion. Questa è una prova passo-passo per stabilire il modello di perfusione del mouse.
Ci sono voluti circa 14 esperimenti per selezionare i cateteri più adatti. Nelle nostre mani, l'utilizzo di due cateteri in gomma francese per la vena porta, insieme a un catetere in gomma francese per il dotto biliare, è la migliore combinazione per ottenere una perfusione omogenea con tutti i cateteri in posizione. Il livello di pH e il livello di potassio sono rimasti stabili durante la perfusione di 12 ore.
Il livello di pH variava da 7,26 a 7,71 e il livello di potassio variava da 5,9 a 6,8 millimole per litro. La colorazione HE mostra che dopo 12 ore di perfusione, l'integrità istologica del fegato di topo era relativamente ben conservata. Nel loro insieme, abbiamo dimostrato qui il successo della creazione di un sistema di perfusione normotermica ossigenata per il fegato del topo.
La perfusione di un fegato di topo per 12 ore ha portato a una buona conservazione della morfologia del fegato, anche se non in tutto l'organo. Sono necessari ulteriori sforzi per ottenere una perfusione omogenea completa per un periodo di tempo più lungo. Una volta raggiunto questo obiettivo, può essere preso in considerazione l'uso di animali geneticamente modificati, come l'uso di topi IL-2-knockout per studiare il ruolo dell'infiammazione.
