MT è supportato da un dottorato di ricerca studentship [rif. 092839/Z/10/Z] e CR da una nuova Investigator Award [rif. 095623/Z/11/Z] dal Wellcome Trust.

1. Facoltativo: Prepara Affi-gel Beads Perline eparina (Gel) per FBM Assay attrattività NOTA: Preparare perline gel almeno 1 giorno prima di iniziare la procedura di espianto. <ol><li> Lavare 100 microlitri gel eparina sospensione di sferette con PBS sterile per 20 minuti su un rullo a temperatura ambiente (RT). </li><li> Perline pellet in una centrifuga da tavolo per 5 min a 13.000 x g. Aggiungi PBS sterile e ripetere la procedura di lavaggio 4x. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere PBS e immergere le perle in un piccolo volume di una soluzione sterile contenente la proteina ricombinante di scelta, avendo cura di coprire le perline con la soluzione. Questo protocollo utilizza 100 ng / ml VEGF165 umano ricombinante in PBS per riprodurre un esperimento pubblicato in precedenza 16. </li><li> Incubare le perline gel eparina con la soluzione di proteina ricombinante per un minimo di 12 ore e un massimo di 1 settimana su un rullo a 4 ° C. </li></ol> 2. Rivestimento della Cultura Inserts Espianti hindbrain sono coltivati ​​sulla cultura Corning inserisce con una dimensione dei pori 8 micron, o inserti equivalenti. Inserti di coltura possono essere riutilizzate dopo il completamento del protocollo, a condizione che siano lavati con acqua distillata, sterilizzati con etanolo, e conservati in etanolo al 70% fino a quando necessario. NOTA: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una cappa a flusso in condizioni sterili. <ol><li> Preparare terreni di coltura espianto costituito Neurobasal mezzo supplementato con B27 (20 microlitri / ml), glucosio (6 mg / ml) e penicillina / streptomicina (5 mg / mL). </li><li> Cultura Wash inserisce con PBS sterile per 5 min e asciutto per 5-10 min sotto la cappa a flusso. </li><li> Mettere un inserto cultura in ogni singolo pozzetto di una piastra 12well. Nota: gli inserti possono avere bisogno di una piccola spinta per adattarsi perfettamente nel pozzo. </li><li> Coprire gli inserti culturali con 10-20 mcg / ml topo laminina in Neurobasal medie e metterli in un tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO <sub&gt; 2) per 1 ora. Nota: rivestimento deve essere effettuata al momento della dell&#39;espianto. </li></ol> 3. La dissezione del Hindbrains da E11.5 embrioni di topo <ol><li> Abbattere cronometrato femmina incinta mouse con una procedura eticamente approvato il giorno embrionale (E) 11.5 e posizionare l&#39;utero contenente gli embrioni in un piatto di plastica 100 millimetri con terreno L15 ghiacciata. NOTA: Tutti i passi dissezione devono essere eseguite in L15 ghiacciata. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione e Dumont orologiaio PINZA numero 5, strappare la parete muscolare dell&#39;utero per esporre gli embrioni, rilasciare ogni embrione, recidere il cordone ombelicale, e con attenzione rimuovere il sacco vitellino. </li><li> Usando una pipetta Pasteur di plastica con apertura wide-bore, trasferire ogni embrione in un piatto di plastica pulita con L15 ghiacciata. </li><li> Utilizzando pinze Dumont, decapitare l&#39;embrione appena sopra le zampe anteriori. Se l&#39;esperimento richiede genotipizzazione degli embrioni, raccogliere campioni di tessuto per l&#39;isolamento del DNA genomico (ad esempio un piccolo piece del sacco vitellino o di coda punta 16,20). </li><li> Girare il lato dorsale testa e identificare il 4 ° ventricolo, che è coperto da uno strato di tessuto sottile (Figura 2B). Perforare con attenzione il roofplate e cominciare a sbucciare via caudalmente lungo la linea mediana sopra il hindbrain posteriore e il midollo spinale, e rostralmente sopra il mesencefalo. Il hindbrain dovrebbe ora essere esposta (Figura 2C). </li><li> Stuzzicare delicatamente via il mesenchima testa rimanente e tutte le meningi che sono attaccati al lato piale del hindbrain (Figura 2D). </li><li> Rimuovere il tessuto del midollo mesencefalo e midollo in modo che il hindbrain dispiega e possono essere piatte in un preparato libro aperto (Figura 2E). </li><li> Utilizzando un ampio tunnel di plastica pipetta Pasteur, trasferire ogni hindbrain sezionato ad una piastra a 12 pozzetti contenenti ghiacciata L15 e memorizzarli sul ghiaccio finché non sono stati sezionati tutti hindbrains. </li><li> Utilizzando un ampio tunnel di plastica pipetta Pasteur, trasferire un peccatogle hindbrain a un piatto vuoto, mantenendo una preparazione libro aperto, lato ventricolare alto, in una goccia di approssimativa di 100 microlitri L15. </li><li> Trasferire alcuni microlitri delle perle gel eparina incubate alla stessa gocciolina. Nota: Poiché le dimensioni di perle sono variabili, si consiglia di trasferire circa 10 perline e quindi scegliere una dimensione ottimale per il trapianto nel cervello posteriore. </li><li> Fare un piccolo strappo nel tessuto hindbrain e inserire delicatamente 1-3 perle di gel nel tessuto hindbrain a livello di r5 / 6, circa a metà strada tra la linea mediana e il bordo laterale del hindbrain, abbassandoli nel tessuto in modo che la tallone è posizionato appena sotto la superficie hindbrain. NOTA: La procedura di dissezione può prendere tra 5-20 min / hindbrain, a seconda dell&#39;esperienza, e può allungare per un lungo periodo se cucciolate sono di grandi dimensioni, in ogni caso, hindbrains dovrebbero essere in cultura non più di 3 ore di post-mortem per bene risultati. </li></ol> 4. HindbrainEspianto Cultura <ol><li> Rimuovere la piastra contenente gli inserti culturali dal termostato, aspirare la soluzione di rivestimento laminina. </li><li> Mettere un inserto cultura in una capsula di Petri separato riempito di ghiaccio freddo L15 e, utilizzando un ampio tunnel di plastica pipetta Pasteur, trasferire ogni lato ventrale hindbrain su sopra l&#39;inserto cultura (Figura 2G). Il hindbrain dovrebbe trovarsi completamente pianeggiante sulla membrana inserto. </li><li> Sollevare delicatamente l&#39;inserto cultura dal piatto e tamponare più volte su carta velina pulita per rimuovere il liquido in eccesso. Questo processo assicura che la hindbrain aderisce l&#39;inserto cultura in un piatto, preparato libro aperto. Se il hindbrain si rannicchia, il suo tessuto può irreversibilmente crescere insieme. </li><li> Riempire il 12-pozzetti originale con 500 microlitri terreni di coltura preriscaldata e posizionare l&#39;inserto posteriore in questo pozzo. Regolare accuratamente il volume con un altro 400-600 ml di mezzi per coprire solo il hindbrain, assicurando che il hindbrain non galleggiala membrana. Se galleggia, tornare al punto 4.4 e ripetere fino a quando il hindbrain rimane attaccato alla membrana. </li><li> In questa fase, è possibile aggiungere inibitori biologici di interesse ai media per studiare il loro effetto sulla migrazione dei neuroni FBM. NOTA: Se l&#39;impianto di perline o di gestione di altri trattamenti, si consiglia di mantenere almeno due espianti di controllo in condizioni di crescita normali per esperimento al fine di garantire che l&#39;esperimento è stato impostato correttamente. </li><li> Incubare espianti per 24-30 ore in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 5. Wholemount immunofluorescenza di romboencefalo espianti <ol><li> Aspirare il supporto da ogni pozzetto, lavare in PBS e fissare per 2 ore a 4 ° C con agitazione in ghiacciata formaldeide al 4% (preparata di fresco o appena scongelati 4% paraformaldeide disciolto in PBS). Nota: Non tentare di rimuovere hindbrain dall&#39;inserto cultura prima del fissaggioè completa. </li><li> Sciacquare 3x con PBS. Facendo attenzione le hindbrains dagli inserti cultura con pinze Dumont. Alcuni espianti sono difficili da staccare, ma di solito possono essere sollevati applicando una leggera pressione attraverso ripetutamente espellere PBS da una pipetta. </li><li> Trasferire i hindbrains a 2,0 ml tubi a fondo rotondo per l&#39;etichettatura immunofluorescenza. Permeabilize hindbrains per 30 min a temperatura ambiente (RT) in PBS contenente 0,1% TritonX-100 (PBT) con dolce rotolamento. </li><li> Incubare per 1 ora a RT in PBT contenente siero di capra 10% inattivato al calore normale con delicata rotolamento. </li><li> Incubare espianti con leggera rotazione a 4 ° C per 5 giorni con anticorpo primario specifico per Isl1, diluito 1:100 in PBT contenente siero di capra normale inattivato al calore 1%. </li><li> Lavare gli espianti a RT 4x con PBT per 15 minuti ciascuno. </li><li> Incubare espianti con leggera laminazione a temperatura ambiente per 3 ore con fluoroforo capra coniugato anticorpo anti-mouse (per esempio Alexa Fluor 488 di capra antitopo, diluito 1:200) in PBT contenente siero di capra normale inattivato al calore 1%. </li><li> Lavare gli espianti 4x a RT con PBT per 15 minuti ciascuno con delicata rotolamento. </li><li> Postfix gli espianti in formaldeide al 4% per 30 min a RT. </li><li> Coprire un vetrino con 3 strati di nastro isolante nero e accise con un bisturi una piccola piazza del nastro a strati per creare una tasca per gli espianti, in alternativa, utilizzare un vetrino depressione. </li><li> Montare ogni hindbrain in SlowFade reagente in una tasca e coprire con un coprioggetto di vetro, evitando accuratamente di intrappolare bolle d&#39;aria e immagini utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. NOTA: In alternativa alla immunostaining, ibridazione in situ con riboprobes che riconoscono FBM (cioè Isl1 o PHOX2B) può essere utilizzato per visualizzare FBM neuroni 16,21. </li></ol> Sintesi dei passaggi e dei tempi Temporizzato accoppiamento di ottenere gravidanze E11.25: ~ 14 giorni Optional: Bead preparazione (Protocol 1): ~ 2 ore, il giorno prima di isolamento embrione Preparare gli inserti della cultura e dei media (Protocollo 2): ~ 30 minuti, prima di isolamento embrione Isolamento embrione e la dissezione hindbrain (passaggi 3,1-3,4): ~ 10 min / embrione Dissezione hindbrain (passaggi 3,5-3,7): ~ 5-10 min / hindbrain Procedura di espianto (passaggi 3,8-3,9): ~ 5-10 min / hindbrain Optional: cordone impianto (passi 3,10-3,11): ~ 5-10 min / hindbrain Cultura espianto (fase 4.7): 24 ore Fissazione per la colorazione anticorpale (fase 5.1): 2 ore Procedura di colorazione e di imaging (protocollo 5): 5 giorni

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Nessuno degli autori ha interessi o conflitto di interessi in competizione.

Questo protocollo descrive la cultura wholemount di hindbrains topo E11.5 in un sistema transwell per studiare la migrazione dei neuroni FBM. Questo protocollo permette motoneuroni del mouse romboencefalo da tenere viva e la migrazione per un periodo di 24 ore, consentendo ex vivo manipolazione. Questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per gli investigatori cercano di identificare i meccanismi molecolari e cellulari della migrazione neuronale. Considerando saggi di migrazione tradizionali espianto piccoli pezzi di tessuto neurale in matrice su piastre di coltura e consentono l&#39;osservazione di singoli neuroni rispondono agli stimoli esogeni, uno dei principali vantaggi del saggio transwell è la sua idoneità per manipolare i neuroni migrano all&#39;interno dell&#39;ambiente organo ospitante e quindi una più contesto fisiologico. È importante sottolineare che le sostanze possono essere facilmente applicati alle ex vivo romboencefalo espianti per testare il loro effetto sulla migrazione neuronale, aggirando i possibili effetti collaterali associati con administesuonare queste sostanze per un mouse incinta. Infine, il modello ex vivo permette anche la sperimentazione di sostanze che non attraversano la barriera placentare, come gli anticorpi funzione di blocco. Grazie a questi vantaggi, la ex vivo hindbrain cultura fornisce un metodo alternativo e complementare a embrioni di zebrafish, che può essere trattata con acqua piccole molecole solubili nell&#39;acqua dell&#39;acquario, o per elettroporazione in utero di cervelli embrionali, che richiede l&#39;uso di speciali attrezzature ed è più difficile da padrone rispetto alla tecnica cultura qui descritta. Un altro vantaggio del protocollo qui descritto è la sua riconducibilità ad impiantare perline imbevuti di proteina ricombinante o altri reagenti, consentendo quindi l&#39;applicazione di un metodo embrionale standard sviluppato per manipolare embrioni di pollo di un modello murino di migrazione neuronale. In particolare, il modello di coltura ex vivo può essere applicato a hindbrains di topi geneticamente ingegnerizzati difettosotiva in molecole specifiche coinvolte nella migrazione neuronale, come i recettori di crescita o fattore di orientamento, e combinato con impianti tallone per verificare se la reattività di leganti è perso. Oltre alla manipolazione farmacologica, ex vivo protocollo cultura può anche essere adattato per l&#39;elettroporazione di vettori di espressione che potrebbero alterare l&#39;espressione di geni di interesse; metodi appropriati per elettroporazione sono stati precedentemente descritti 22,23. Questo protocollo può anche essere adattato per visualizzarne la migrazione dei neuroni mediante microscopia time-lapse in espianti romboencefalo da topi transgenici contenenti neuroni fluorescente FBM, ad esempio Isl1-Cre, Rosa26Yfp 21. Infine, questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare altri tipi di neuroni che migrano nel cervello posteriore, come quelle che formano la oliva inferiore, anche se ciò richiederebbe l&#39;uso di hindbrains nelle fasi embrionali anziani e può richiedere coltura fino a 48 ore, seconda vitalità neuronale <em&gt; Ex vivo. Passaggi critici e risoluzione dei problemi Per il successo di questo protocollo, è fondamentale che gli embrioni sono raccolti nella fase iniziale E11.5 giorno, più vicino al E11.25, quando FBM migrazione dei neuroni è appena iniziata. Tuttavia, non è sempre possibile raggiungere embrioni allo stadio di sviluppo a causa di variabilità naturale accoppiamento di topi, e di conseguenza, ci può essere una certa variabilità nel prolungare di migrazione FBM tra diversi esperimenti. La variabilità della migrazione FBM può osservare anche se l&#39;esperimento non è completato entro il tempo assegnato, circa 3 ore, come si può vedere in Figura 3E. Tessuto hindbrain da E11.25 embrioni di topo è delicato. Quando dissezione e durante tutta la procedura espianto, è importante non strappare il tessuto hindbrain nelle zone di r4-r6 dove sono localizzati i neuroni FBM. A causa della natura delicata della dissprocesso ezione, e perché la velocità con cui hindbrains sono collocati nella cultura influenza il risultato, la procedura potrebbe richiedere un paio di pratica corre da padroneggiare, in particolare prima che siano utilizzati preziosi campioni o reagenti. Infine, è importante che il tessuto hindbrain viene inserito in una configurazione aperta libro sull&#39;inserto cultura, perché ripiegamento del tessuto hindbrain durante la coltura impedirà normale migrazione FBM (vedere Figura 3F).

Neuroni embrionali sono nati nella zona ventricolare del cervello, ma poi migrare verso nuove mete da raggiungere adeguate aree di destinazione che si trovano a grande distanza. Il corretto posizionamento dei corpi cellulari neuronali in punti appropriati lungo gli assi dorso-ventrale e antero-posteriore del cervello di sviluppo è essenziale per il corretto cablaggio, la sopravvivenza e la funzione di questi neuroni dopo la fase migratoria 1-4. Simile ai meccanismi molecolari che controllano l&#39;assone guida 5-7, serie combinatorie di spunti attrattive e repulsive sono pensati per guidare i neuroni migrano 1,8. Tuttavia, a causa delle interazioni tra più tipi di cellule, i segnali che controllano la migrazione neuronale sono stati ampiamente studiati meno di quelli coinvolti nella guida degli assoni, che può essere studiato cellule autonomamente. La hindbrain sviluppo dei vertebrati è stato utilizzato in diversi studi recenti per comprendere i meccanismi molecolari e cellularidella migrazione neuronale, per esempio in pulcino, mouse e zebrafish 1-4,9. Questo organo contiene diversi tipi di neuroni, tra cui diversi sottotipi di precerebellar e motoneuroni 5,7,10,11. Motorneuron hindbrain sono nati nella zona ventricolare vicino al fondello, e differenziarsi in specifici sottoinsiemi in base alla loro rhombomere di origine 1,12. Il branchiomotor facciale (FBM) i neuroni sono generati in rhombomere (r) 4 nel hindbrain ed estendono i loro assoni dorsale attraverso un punto di uscita r4 nel secondo arco branchiale per innervare i muscoli facciali 2,9,13. FBM neuroni di zebrafish ei topi fornire eccellenti modelli per studiare i meccanismi molecolari e cellulari della migrazione neuronale in un processo che viene prontamente visualizzato, perché questi neuroni riproducibile traslocano loro somata in un processo spatiotemporally ben definito. Nei topi, i neuroni FBM primo migrano Caudally attraverso R5 e poi sia caudale e ventrale per raggiungere la loro posizione definitiva sul lato piale del hindbrain nel territorio di r6, dove si formano i nuclei appaiati del VII nervo cranico (VIIn) 10,11,14. In zebrafish, i neuroni FBM inizialmente migrano ventrale e poi cambiano direzione al confine R4-R5 per continuare la migrazione verso la superficie piale in maniera laminina-dipendente 4,12,15,16. Questa migrazione procede nel corso di un periodo di diversi giorni di sviluppo e può essere diviso in fasi di migrazione tangenziale e radiale, che permette l&#39;identificazione di molecole che mediano questi due processi distinti. Al contrario, i neuroni FBM del pulcino hindbrain embrionale rimangono in r4 3,13,17-19. Durante la loro migrazione, i neuroni FBM possono essere identificati, come altri tipi o motoneuroni, attraverso la loro espressione del fattore di trascrizione homoeodomain isolotto 1 (Isl1) 14. Così, commercemount immunofluorescenza o ibridazione in situ per questo indicatore a diversi stadi di sviluppo rivela il flusso migratorio distinto di FBM somata estende da R4 a R6 in zebrafish o il mouse 4,15,16. Inoltre, i giornalisti transgenici fluorescenti come Isl1-GFP sono state utilizzate come strumenti idonei per visualizzarne la migrazione dei neuroni FBM in zebrafish 3,17-19. Oltre alla loro idoneità per l&#39;imaging, molti ricercatori hanno studiato la migrazione dei neuroni FBM nello sviluppo di zebrafish, perché i loro embrioni a vita libera possono essere manipolati facilmente con tecniche di trapianto cellulare e composti farmacologici applicati direttamente l&#39;acqua dell&#39;acquario. Al contrario, l&#39;embrione di topo sviluppa racchiuso in utero, precludendo l&#39;impianto di perline che trasportano segnali di orientamento o la somministrazione di anticorpi funzione di blocco che non attraversano la barriera placentare. Inoltre, i composti farmacologici somministrati alla madre in gravidanza possono avere ONUeffetti collaterali desiderati che possono indirettamente compromettere l&#39;embriogenesi. Eludere questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo di coltura ex vivo per l&#39;intera hindbrain del mouse che è compatibile con la migrazione FBM neurone e la sopravvivenza per 24 ore dopo dell&#39;espianto 7,16. Questo metodo permette la manipolazione farmacologica facile, impianto di perline trasportano segnali o somministrazione di anticorpi funzionali bloccante orientamento e potrebbe anche essere adattato per studiare la migrazione di altri sottotipi neuronali nel hindbrain a diversi stadi di sviluppo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Neuroni embrionali sono nati nella zona ventricolare del cervello, ma poi migrare verso nuove destinazioni per raggiungere obiettivi adeguati. Decifrare i segnali molecolari che guidano cooperativo migrazione neuronale nel cervello embrionale è quindi importante capire come le reti neurali complesse formano che supportano più tardi la vita postnatale. Branchiomotor facciale (FBM) neuroni del topo hindbrain embrione migrano da rhombomere (r) 4 caudalmente a formare i nuclei facciali appaiati nella regione r6-derivati ​​del hindbrain. Qui forniamo un protocollo dettagliato per wholemount ex vivo cultura della hindbrains embrione di topo adatti per studiare le vie di segnalazione che regolano la migrazione FBM. In questo metodo, hindbrains di embrioni di topo E11.5 vengono sezionati e coltivate in una preparazione libro aperto su inserti di coltura cellulare per 24 ore. Durante questo periodo, i neuroni FBM migrano caudalmente verso r6 e possono essere esposti ad anticorpi funzionali-blocking e piccola molecules nei terreni di coltura o perline eparina carichi di proteine ​​ricombinanti per esaminare i ruoli per le vie di segnalazione coinvolte nel guidare migrazione neuronale.

Questa sezione illustra esempi dei risultati che possono essere ottenuti attraverso lo studio FBM migrazione dei neuroni nel hindbrain mouse attraverso ex vivo della cultura. Abbiamo dimostrato che i neuroni FBM in hindbrains espiantati dal giorno 11 embrioni di topo prima subiscono una migrazione tangenziale (Figura 3A) e poi iniziare a montare il motore nuclei facciale (Figura 3B), simile al loro comportamento in utero (vedere Figura 1). Abbiamo inoltre dimostrato che l&#39;impianto di un cordone VEGF165 imbevuto attrae neuroni FBM (Figure 3C e 3D), come precedentemente illustrato 16. È importante sottolineare che questo protocollo permette di studiare la migrazione FBM, in assenza di vasi sanguigni o fattori di vasi-derivati ​​che possono influenzare la migrazione FBM in utero, perché la vascolarizzazione nonperfused degenera nella cultura 16. Pertanto, l&#39;etichettatura globuli aspecifica osservato quando si utilizza l&#39;anticorpo topo Isl1 su frescoisolati hindbrains del mouse (Figura 1) non è più presente nel tessuto hindbrain dopo 24 ore di cultura (figure 3A-F). Infine, vengono mostrati due esempi di hindbrains che non sono stati espiantati correttamente e quindi contenere neuroni FBM in una distribuzione anormale, o perché hindbrain non è stato espiantato abbastanza presto dopo embrione isolamento (Figura 3E) o perché il tessuto hindbrain ripiegato al transwell ( Figura 3F). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Figura 1. FBM migrazione dei neuroni confocale z-stack di hindbrains del mouse tipo selvatico dopo Isl1 immunomarcatura wholemount e flatmounting,.. Alla linea mediana hindbrain è indicato da un asterisco in tutti i pannelli (A) superficie ventricolare di un hindbrain E11.5 nel<html> area contenente neuroni FBM Isl1-positivo (freccia), dimostrando la loro migrazione tangenziale da R4 a R6;. posizione di R4, R5 e R6 è indicato (A &#39;) Pial superficie di una metà dello stesso hindbrain nella zona contenente la anlage . di uno dei nuclei FBM accoppiati (indicati con VIIn), così come altre popolazioni neuronali Isl1-positivo (B) superficie ventricolare di un hindbrain E12.5 contenente neuroni FBM che sta migrando tangenzialmente (freccia); la freccia indica un esempio di un vaso sanguigno contenente cellule circolanti che sono aspecifico etichettati da reazione crociata dell&#39;anticorpo secondario anti-topo utilizzato per rilevare l&#39;anticorpo Isl1 IgG di topo (B &#39;). Pial superficie di una metà dello stesso hindbrain E12.5, che contiene uno dei nuclei FBM accoppiati. La linea mediana è indicato da un asterisco in ogni pannello. Bar Scale (tutti i pannelli): 200 micron. V, ventrale, P, piale./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> Figura 2. Mouse E11.5 hindbrain dissezione e ex vivo della cultura. (AE) passaggi chiave del protocollo di dissezione E11.5 hindbrain; barra della scala: 1. Mm (A) Testa dell&#39;embrione dopo che è stato tagliato fuori dal resto dell&#39;embrione a livello degli arti anteriori (B) La parte rostrale della. testa è stato rimosso e il resto del tessuto testa posizionato in modo che il 4 ° ventricolo (freccia) è orientato verso l&#39;alto. (C) Il tetto del 4 ° ventricolo è stato staccato, e hindbrain è stata esposta da peeling tessuto sotto hindbrain distanza rostralmente e caudalmente. (D) La membrana piale è stato rimosso (si noti che in questa exampio, alcune midollo spinale cervicale (SC) tessuto è rimasto attaccato al hindbrain). (E) mesencefalo eccesso (MB) e del midollo spinale (SC) tessuto è stato rimosso per mantenere solo hindbrain. (inserti F) di coltura sono stati rivestiti con laminina e collocati in una piastra di coltura tissutale ben 12. (G) Ogni hindbrain è stato posto su un inserto e coperto con i media. (H) Rappresentazione schematica del percorso intrapreso dalla migrazione dei neuroni FBM (blu) durante la 24 ore di cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> Figura 3. Hindbrain ex vivo della cultura Mouse. (A, B) Un hindbrain E11.5 è stato coltivato per 24 ore e immunofluoresc<html> pendentemente etichettati per Isl1 illustrare FBM migrazione neuronale in un espianto, sia ventricolare (A) e (B) piale lati hindbrain sono mostrati (C, D) hindbrains E11.5 littermate sono stati coltivati ​​in presenza di eparina tallone impiantato bagnato. in PBS (C) o VEGF165 (D); notare che i neuroni FBM migrati verso e sopra il tallone VEGF165, e il flusso di migrazione pertanto estesa ulteriormente caudalmente rispetto al lato non trattato dello stesso hindbrain o hindbrain contenente sferette di controllo (E. , F) Esempi di insoddisfacenti espianti E11.5 romboencefalo, in cui FBM non sono emigrati da R4 (E), o in cui il tessuto hindbrain ripiegato durante la coltura (F). La linea mediana è indicato da un asterisco in ogni pannello. Barra della scala (per tutti i pannelli): 200 micron. V, ventrale, P, piale.&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.

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Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Neuroni embrionali sono nati nella zona ventricolare del tubo neurale, ma migrano per raggiungere obiettivi adeguati. Branchiomotor facciale (FBM) i neuroni sono un modello utile per studiare la migrazione neuronale. Questo protocollo descrive la wholemount ex vivo cultura della hindbrains embrione di topo per studiare i meccanismi che regolano la migrazione FBM.

Topo romboencefalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per studiare la migrazione Branchiomotor Neuron viso

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

mouse-hindbrain-ex-vivo-culture-to-study-facial-branchiomotor-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

11.1K Views.  University College London.  Neuroni embrionali sono nati nella zona ventricolare del tubo neurale, ma migrano per raggiungere obiettivi adeguati. Branchiomotor facciale (FBM) i neuroni sono un modello utile per studiare la migrazione neuronale. Questo protocollo descrive la wholemount ex vivo cultura della hindbrains embrione di topo per studiare i meccanismi che regolano la migrazione FBM. 

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Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

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Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

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Ricerca

Neuroscienze

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

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The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Il Hindbrain Mouse come modello di studio della neurogenesi embrionale

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Chirurgia del nervo facciale nel modello di ratto per studiare l'inibizione assonale e la rigenerazione

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Imaging in vivo del calcio delle risposte del neurone ganglio genicolato di topo agli stimoli del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...