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1. poliuretano (PU) Sponge Preparazione come modello <ol><li> Utilizzare spugne PU per la produzione di modelli di idrossiapatite contenenti pori comunicanti. Usare ogni spugna per fornire trabecole primario per la formazione dei puntoni modello nonché la formazione di micro-canali all&#39;interno della trabecole. </li><li> Tagliare e tagliare 80 ppi (pori per pollice) le spugne in 2 ponti forme con dimensioni di 3,5 cm di altezza x 5 cm di lunghezza x 1,5 cm di larghezza. Nota: Le dimensioni e forme possono essere scelti in base alle dimensioni dei pori primario desiderato: 100 ppi, 80 ppi, e 60 ppi. </li><li> Effettuare un 100 ml di 4% (w / v) di NaOH utilizzando un becher da 150 ml; quindi immergere e spremere fino a quando le spugne preparate sono completamente inzuppati. </li><li> Dopo l&#39;immersione, posizionare il bicchiere con le spugne nella ultrasonicatore (42 kHz). </li><li> Ultrasuoni pre-trattare le spugne PU per 15-20 minuti senza calore per modificare le proprietà superficiali. </li><li> Sciacquare con acqua distillataacqua per 5-10 min. Durante i risciacqui spremere le spugne e consentire loro di espandersi 5 a 7 volte per rimuovere la NaOH residua all&#39;interno delle spugne. </li><li> Spremere le spugne con tovaglioli di carta per eliminare l&#39;acqua in eccesso; quindi asciugare in stufa a 60-80 ° C. </li></ol> 2. idrossiapatite (HA) Slurry Preparazione per il rivestimento <ol><li> Prima di effettuare l&#39;impasto HA, misurare il peso di un becher con ancoretta magnetica. Questa misura viene utilizzato per calcolare il rapporto polvere / liquido. </li><li> Misura 10 g di polvere di HA nano-dimensioni. </li><li> Aggiungere 20 ml di acqua distillata nel becher da 50 ml. Calore per 120-140 ° C e mescolare con un agitatore magnetico piatto caldo. </li><li> Aggiungere 0,3 g (3% w / w) di alcool polivinilico (PVA) (89,000-98,000 MW) per la polvere in acqua distillata agitando a 300-400 rpm. </li><li> Mescolare fino a quando il PVA si è completamente dissolto. La soluzione deve essere chiara dopo la completa dissoluzione del PVA. </li><li> Girare off calore e aggiungere 0,1 g (1% w / w) di sodio carbossimetilcellulosa (CMC) (ultra-bassa viscosità) per la polvere sotto agitazione a 400-500 rpm. La soluzione deve essere chiara dopo la completa dissoluzione del PVA. </li><li> Mescolare fino a quando la CMC si è completamente sciolto e raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 0,3 g (3% w / w) di poliacrilato ammonio disperdente per polvere sotto agitazione a 300-400 rpm. Mescolare fino a completa dissoluzione. </li><li> Aggiungere 0,2 g (2% w / w) di glicerina per polvere sotto agitazione a 300-400 rpm. Mescolare fino a completa dissoluzione. </li><li> Lentamente disperdere la polvere HA nella soluzione agitando a 600-900 rpm e mantenere agitazione per 5 min. </li><li> Ultrasuoni per 5 minuti usando un ultrasonicatore per assicurare la dispersione di qualsiasi agglomerato della polvere di HA. </li><li> Aggiungere un extra di 5 ml di acqua distillata nella miscela sotto agitazione a 600-900 rpm e scaldare a 90-100 ° C. </li><li> Tenere agitazione la miscela con un agitatore magnetico a 600-800 rpm a 90-100 ° C in order evaporare il contenuto di acqua. </li><li> Misurare l&#39;intero peso compreso becher e la miscela di volta in volta fino ad un rapporto polvere / liquido di 1,75-1,8 si ottiene. </li><li> Formattazione il rapporto polvere / liquido, dividere il peso della polvere per il peso totale della miscela (2.14), compresa la polvere, reagenti, e acqua, meno il peso del bicchiere e agitatore (2.1), e meno la polvere HA (2.2). Nota: Per esempio: se A (intera miscela comprese le polveri, i reagenti e acqua) è 49.05 g, B (bicchiere con agitatore) è 33,5 g, e poi C (HA polvere) è di 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Lasciare che la sospensione si raffreddi per RT prima di utilizzare per il rivestimento. </li></ol> 3. HA rivestimento, Asciugare, e sinterizzazione <ol><li> Rivestire le spugne PU preparati con il rivestimento poltiglia HA con una spatola di acciaio fino a quando l&#39;impasto è omogeneo distribuiti in tutto il spugna PU su una lastra di vetro. Nota: Dopo aver rimosso la legatura in eccessory, alcuni dei pori possono essere ancora ostruiti con slurry a causa della elevata viscosità della sospensione. </li><li> Per garantire l&#39;interconnettività, uniformità, e pori aperti, leggermente soffiare i modelli HA rivestita utilizzando un compressore d&#39;aria. Questo processo assicura che i modelli vengono omogeneamente rivestite sia sulle superfici interne ed esterne di spugna PU. Nota: se un rivestimento omogeneo non viene raggiunta, i modelli rivestiti di HA crolleranno durante il processo di sinterizzazione e possono anche rompere durante la manipolazione a causa della bassa resistenza meccanica. Inoltre, il rivestimento omogeneo è fondamentale nella creazione micro-canali all&#39;interno della trabecole. </li><li> Essiccare i modelli HA rivestite per un minimo di 5 ore in condizioni di raffreddamento (20-25 ° C) con dolce circolazione dell&#39;aria. Tuttavia, prolungare il tempo di asciugatura in base alle dimensioni del modello. Nota: Dopo l&#39;essiccazione, i modelli HA rivestite in genere ridursi di circa l&#39;8% al 10% in ogni dimensione. </li><li> Dopo il processo di essiccazione, posizionare l&#39;HAmodelli rivestiti in un crogiolo di allumina. Poi, metterli in un forno ad alta temperatura e utilizzare i seguenti 8 fase di sinterizzazione profilo. <ol><li> Calore 2 ° C / min fino a 230 ° C. </li><li> Calore 1 ° C / min fino a 280 ° C. </li><li> Scaldate 0,5 ° C / min fino a 400 ° C. </li><li> Calore 3 ° C / min fino a 600 ° C. Mantenere a 600 ° C per 1 ora. </li><li> Calore 5 ° C / min fino a 1230 ° C. Mantenere 1.230 ° C per 3 ore. </li><li> Raffreddare 5 ° C / min a RT. Nota: sinterizzazione si contrarrà ulteriormente i modelli di spugna HA rivestiti da circa il 22% - 25% in ogni dimensione. </li></ol></li></ol> 4. ingresso e Inhabitancy di celle nel modello <ol><li> Cultura pre-osteoblastiche cellule MC3T3 in mezzi non osteogenico costituito da α-MEM, supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotici (streptomicina e penicillina) a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 . </li><li> Aggiungere 10 mldi una sospensione cellulare a 2 x 10 6 densità cellulare in un singolo pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. </li><li> Posizionare il modello a ponte 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalmente nel 6 pozzetti. Mettere una gamba del modello nella piastra contenente la sospensione di cellule, e l&#39;altra gamba in un pozzo vuoto adiacente. </li><li> Lasciare che il modello di assorbire la sospensione cellulare per 10 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di supporto successivo al pozzo originariamente riempita con la sospensione cellulare. </li><li> Riempire il mezzo in entrambi i pozzetti ogni 2 o 3 giorni finché siano trascorsi 7 giorni. </li><li> Determinare l&#39;efficacia della mobilità delle cellule da ematossilina e eosina 11. <ol><li> Fissare le cellule e scaffold immergendo in 100% EtOH per 20-30 min. </li><li> Colorare con ematossilina per 1-2 min. </li><li> Risciacquare con acqua distillata per 1-2 minuti per due volte. </li><li> Disidratare per immersione nel 70%, poi 95%, allora il 100% EtOH per 1-2 minuti ciascuno. </li><li> Colorare con Eosina per 20-30 secondi. </li><li> Risciacquare con acqua distillata per 12 min per due volte. </li><li> Disidratare per immersione in 70%, 80%, 90% e 100% EtOH per 1-2 minuti ciascuno. </li><li> Incorporare l&#39;impalcatura in una resina acrilica per sezionamento e di imaging. </li></ol></li><li> Determinare la vitalità cellulare con i 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) vitalità cellulare test e test dal vivo / Morto (cell Live / morti kit di colorazione MPTP) in fase di punti di giorno 3 e 7 11. Nota: Lo schema di protocolli modello di fabbricazione osso-come sono rappresentati nel &quot;Rappresentante dei risultati&quot; sessione. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

È necessario un modello a più componenti tra cui le cellule, fattori di crescita, sostanze nutritive, ecc per la rigenerazione ossea successo e ripristino funzionale dei grandi difetti ossei critici dimensioni. All&#39;interno di questi fattori, anatomicamente Conformi proprietà biologiche sono essenziali. Per realizzare la funzionalità biologica, il modello deve esibire biocompatibilità, osteoconduttività, integrità meccanica, una superficie, adeguata struttura di superficie, ed i mezzi per ossigeno e trasporto dei nutrienti. A livello cellulare, le seguenti caratteristiche sono particolarmente cruciale per il ripristino funzionale di massicci difetti ossei: penetrazione facilitata nel modello (reclutamento attivo), una distribuzione uniforme in tutto il modello (retention), la proliferazione accelerata e ad alta redditività (abitazione). Infine, la successiva formazione di matrice extracellulare sostanziale e l&#39;attivazione dell&#39;espressione genica sono fondamentali processi biologici essenziali come la rapida vascolarizzazione unosteogenesi nd. Molti diversi tipi di sostituti sintetici sono stati proposti per sostituire automazione / allo- innesti ossei. Tuttavia, l&#39;organizzazione patibolo corrente non presenta un microambiente interno contenente micro-canali e nano-pori, e quindi non facilita attivamente infiltrazione di cellule, la distribuzione, e inhabitance in profondità i sostituti sintetici che sono più grandi di 10 mm. Non forniscono segnali fisici per pionieristico cellule in modo efficiente, migrare rapidamente ed uniformemente profondamente nel modello osso. Invece, il reclutamento passivo limitato di cellule crea un popolazioni cellulari inegualmente distribuiti tra le aree esterne e interne del patibolo. Questo aggrava non solo la sfida iniziale delle cellule raggiungono il nucleo interno del template, ma impedisce anche il flusso di nutrienti e comunicazione cellulare con l&#39;altra estremità del sostituto sintetico. Questo tipo di cellule sproporzionato di reclutamento e di abitazione risultati nella cella death e ossa incompleta crescita dopo il ponteggio è stato impiantato nel corpo 14,15. Così, abbiamo introdotto il concetto di azione capillare come spunto fisico primario per affrontare questi ostacoli. Abbiamo micro-canali accuratamente progettato nel BMT per indurre l&#39;azione capillare che rappresenteranno la forza di trascinamento primario responsabile per attivamente reclutando cellule in profondità nel BMT. La tecnica di rivestimento in PU spugna presenta diverse proprietà uniche. In primo luogo, permette una facile preparazione di strutture trabecolari porose ben controllati, che si dipendono strutture template predefiniti (ad esempio, 80 dei pori per ogni modello pollici per 300-400 micron). Questo è molto importante per ottimizzare la dimensione dei pori di 15 osteoblasti infiltrazione. In secondo luogo, la tecnica consente la costruzione di micro-canali interconnessi, che rappresentano il ruolo significativo di inizializzazione delocalizzazione cella 11. In terzo luogo, non ci sono quasi limiti quando si utilizza la spugna PU in termini di creazione di forme personalizzate e dimensioni dei modelli. Il produttore può utilizzare una forbice per le forme semplici o taglio laser anche calcolato per geometrie complesse. Utilizzando queste tecnologie controllate precisamente, abbiamo creato la BMT. HA è stato scelto come materiale di partenza per la sua biocompatibilità e osteoconduttiva capacità 17. In questo studio, ci sono diversi passaggi critici che devono essere evidenziati. Durante la preparazione slurry HA, se la temperatura è troppo alta e la velocità di agitazione è troppo bassa, la poltiglia HA diventerà bloccato sui bordi inferiori del becher e asciugare. Dopo il processo di rivestimento quando soffia l&#39;eccesso HA slurry, troppo alta di una pressione dell&#39;aria può indurre crepe sulla superficie del BMT. È importante mantenere la pressione dell&#39;aria relativamente bassa per aerare adeguatamente l&#39;eccesso HA slurry solo. Infine, la seconda e terza fase del processo di sinterizzazionesono più importante (Heat 1 ° C / min fino a 280 ° C e calore di 0,5 ° C / min fino a 400 ° C). In questo intervallo di temperatura, la spugna PU sarà completamente brucia mentre l&#39;HA diventa denso. Se questo protocollo non è seguito da vicino, la BMT sarà crollato o sbriciolato dopo la sinterizzazione. Il BMT descritto in questo studio offre diversi vantaggi. In primo luogo, i macro-pori interconnessi (300-400 micron) imitano quelli di osso trabecolare umano e permette di regolare il flusso del midollo osseo. In secondo luogo, i modelli sono composti da micro-canali (25-50 micron) all&#39;interno di ogni setto trabecolare per accelerare la penetrazione iniziale di cellule ossee tramite azione capillare. Come dimostrato mediante simulazione computazionale 13, se il modello aveva solo 300 micron pori (pori primari) e nessuna microcanali, l&#39;azione capillare sarebbe insufficiente per la piena saturazione del modello con midollo osseo. Ciò soprattutto sostenere per i difetti di grandi dimensioni che richiedono lmodelli di dimensioni arge. Di dimensioni micrometriche canali mostra altamente efficace assorbimento di liquidi, e quindi ci aspettavamo le micro-canali di essere i principali responsabili per l&#39;azione capillare nel nostro studio. In terzo luogo, i nostri BMTs sono strategicamente posizionati nano-pori. I dati della letteratura indicano che le cellule sono particolarmente sensibili alla nano-patterns 18,19; Pertanto, ci aspettavamo i nano-pori sulle pareti dei micro-canali a svolgere un ruolo per aumentare l&#39;adesione cellulare. Pori di dimensioni nanometriche (100-400 nm) sulla superficie dei setti trabecolare ammessi cellule per ancorare immobilizzati. Nel complesso, l&#39;effetto combinato di queste tre strutture interne portato a mobilizzazione delle cellule maggiore e l&#39;adesione in tutto il modello. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni del protocollo e le misure fondamentali per fabbricare la perfetta BMT. Ad esempio, vi è spesso una grande quantità di HA sospensione preparata a causa della difficoltà di mantenere una viscosità omogenea mentre rivestimento. Inoltre vi è una limitazione nel faremodelli maggiori di 5 cm 3 di volume dovuto al tempo di lavoro, mentre il rivestimento. Lo spessore del rivestimento è fondamentale che varia a seconda del produttore di tecniche. I risultati del nostro studio suggeriscono che la BMT in grado di assorbire e trattenere le cellule offriranno vantaggi potenziali rispetto alloplastico convenzionale (o sintetico) impalcature. Uno studio prospettico viene presa in considerazione per verificare i benefici di BMT su osteogenesi e / o angiogenesi con fattori di crescita dell&#39;osso legati. Pertanto, sosteniamo che la nostra unica funzionalità BMT impalcatura può affrontare le principali barriere di osso insufficiente osseo infiltrazione nei costrutti sintetici e rigenerazione ossea incompleta in grandi difetti. L&#39;obiettivo finale di questo studio è quello di semplificare l&#39;attuale paradigma della bioingegneria per la ricostruzione ossea e ripristino funzionale di difetti ossei di dimensioni critiche, eliminando la necessità di tempo- / stroma del midollo osseo alta intensità di lavoroprocessi di cellule l isolamento e di espansione. Infine, ci proponiamo di utilizzare anatomicamente conforme 3D costrutti con micro-canali e nano-pori, che inducono un rapido assorbimento delle cellule, la distribuzione omogenea, e inhabitance per la ricostruzione dell&#39;osso.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

Senza, fiorente popolazione attiva cella che è ben distribuito e stabilmente ancorata al modello inserito, rigenerazione ossea eccezionale non si verifica. Con i modelli convenzionali, l&#39;assenza di micro-canali interni provoca la mancanza di infiltrazione di cellule, la distribuzione, e inhabitance nel profondo i modelli. Quindi, un modello altamente porosa e uniforme interconnessi trabecolare-simile all&#39;osso con micro-canali (modello microambiente biogeni; BMT) è stato sviluppato per affrontare questi ostacoli. Il romanzo BMT è stato creato da concetti innovativi (azione capillare) e fabbricato con una tecnica di rivestimento spugna-modello. La BMT è costituito da diversi componenti strutturali: primarie-pori interconnessi (300-400 micron), che imitano i pori in osso trabecolare, micro-canali (25-70 micron) all&#39;interno di ogni trabecula e nanopori (100-400 nm) sul di superficie per permettere alle cellule di ancoraggio. Inoltre, la BMT è stato documentato da studi di prova meccanica per avere simili proprietà di resistenza meccanica a quelle dell&#39;osso trabecolare umano (~ 3,8 MPa) 12. La BMT esposto elevato assorbimento, ritenzione, e abitazione di cellule in tutto il (¸) modelli a forma di ponte (tre centimetri di altezza e 4 cm di lunghezza). Le cellule che inizialmente sono state seminate in una estremità dei modelli immediatamente mobilitate verso l&#39;altra estremità (10 cm di distanza) per capillarità del BMT sul supporto cellulare. Dopo 4 ore, le cellule omogeneamente occupato l&#39;intera BMT ed esposti comportamento cellulare normale. L&#39;azione capillare rappresentato per l&#39;infiltrazione di cellule sospese in media e la distribuzione (migrazione attiva) in tutto il BMT. Dopo aver osservato questi capacità della BMT, proiettiamo che BMTs assorbirà cellule del midollo osseo, fattori di crescita e sostanze nutritive dalla periferia in condizioni fisiologiche. Il trapianto di midollo osseo può risolvere le limitazioni attuali via infiltrazione rapida, distribuzione omogenea e inhabitance di cellule in grandi modelli volumetrici per riparare enormi difetti scheletrici.

La struttura complessiva del BMT presenta un modello tridimensionale unico con trabecolari strutture interne simile all&#39;osso. La BMT contiene macro-pori, micro-canali e nano-pori. Configurazioni chiare di completamente interconnessi macro-pori (dimensione media di 320 micron), micro-canali (diametro medio di 50 micron) e nano-pori (dimensione media di 100 nm) sono stati verificati con un microscopio elettronico a scansione (EVO-40; Zeiss) nonché attraverso micro-tomografia. Figura 1 mostra protocolli dettagliati stepwise creando un BMT. Attraverso un preciso controllo dei protocolli dalla preparazione delle spugne PU al processo di sinterizzazione (P1 - P7; Figura 1), le seguenti funzioni possono essere raggiunti: una superficie altamente densa e liscia dopo il rivestimento di HA e di essiccazione; un preciso forma e dimensioni 3-D del modello; una rete trabecolare porosa completamente interconnesso simile a quella dell&#39;osso trabecolare; e micro-canali ingegnohin ogni trabecula che imitano i canali intra-ossee come canali di Havers e canali di Volkmann (figure 2 e 3). Inoltre, relativamente ad alta resistenza meccanica (~ 3,8 MPa) simile a quella dell&#39;osso trabecolare umano è stata misurata mediante una prova di resistenza alla compressione. Parametri istomorfometrici altamente simili con quelli di lombari umano vertebre osso trabecolare sono stati confermati da analisi di micro-CT 12. Diversa entità azione capillare è stata dimostrata attraverso diversi diametri capillari in figura 4 utilizzando la simulazione computazionale. Attraverso queste simulazioni, abbiamo proiettato che la BMT mostrerebbe diversi tassi di assorbimento all&#39;interno delle primarie-pori (300-400 micron) e micro-canali (25-70 micron) in base ai diametri. Capillari più piccoli esposti capacità di assorbimento più forti. Questa ipotesi è stata verificata in questo esperimento come mostrato in Figura 5. La BMT esposto altamente efficaceassorbimento e ritenzione di fluido attraverso l&#39;azione capillare delle strutture micro-channel; blu macchia di stevenel stato utilizzato come mezzo fluido di monitorare facilmente il flusso (figura 5). Sulla base di simulazione computazionale, la BMT con queste configurazioni sono stati visti di assorbire e trattenere sospensioni cellulari fino a 8,5 cm di distanza totale entro 10 sec. A causa di una forte azione capillare indotta dalle strutture interne, il mezzo tinto raggiunto l&#39;estremità opposta di un 3 cm (altezza) x 4 cm (lunghezza) x 1 cm (larghezza) modello a ponte entro 1 min e 40 sec. Inoltre, la mobilizzazione delle cellule attiva e incorporazione nella BMT è stata osservata (Figura 6). Successivamente, la mobilizzazione delle cellule omogeneo e attacco provocato maggiore proliferazione e formazione della matrice in una formazione uniformemente distribuito. Inoltre, a lunga distanza (~ 10 cm) migrazione delle cellule attraverso il BMT è stato convalidato immediatamente dopo BMT era satura della sospensione cellulare. Se<html> cellule EDED sopravvissuti nel segmento template che è stato esposto all&#39;aria e non immerso nel mezzo di coltura. In questo esperimento, il terreno di coltura è stato fornito alle cellule esclusivamente nei pozzetti toccano solo le gambe del ponteggio. L&#39;azione capillare esposti da microcanali poi consentito per mezzo fresco per raggiungere la cima, porzione ponte del patibolo. Dopo 3 giorni di cultura, il modello venne occupato con le cellule in rapida proliferazione. Dopo 7 giorni di coltura, ogni trabecula era avvolto da matrici extracellulari e integrato con celle 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Figura 1. Il protocollo template fabbricazione complessiva simile all&#39;osso dal pre-trattamento di PU spugna (P1) per il trattamento termico finale (P7). Mantenendo il profilo sinterizzazione precisa dopo P7 è fondamentale per ottenere una resistenza meccanica favorevole.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Figura 2 Rappresentante stereo microscopio (AmScope, SM-2TZ-M) immagini (x4) di un 80 ppi dimensioni PU spugna (a sinistra), HA rivestito ed essiccato BMT (al centro), e sinterizzato BMT (a destra) (Dimensioni: 3. cm di altezza x 4 cm di lunghezza x 1 cm di larghezza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> Figura 3. SEM e micro-CT immagini di un modello biogenico: (A) una immagine complessiva di un modello biogenico, <st<html> rong&gt; (B, C, D) le immagini per i micro-canali. Al fine di evidenziare chiari micro-canali del trabecole, il modello è stato granulato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Figura 4. calcolo computazionale di azione capillare con differenti diametri di canale entro lo stesso periodo di tempo (0,4 ms), mentre il più grande capillare (d = 300 micron: si riferisce primaria pori) assorbita medio (blu) fino a 0,16 mm in altezza, il più piccolo capillare (d = 30 micron: si riferisce alla micro-channel) assorbito il supporto fino a 0,415 mm di altezza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figura 5. Le immagini mostravano differenze di capacità di assorbimento capillare basati su diverse dimensioni di primari-pori e micro-canali (primary size-pori si riferisce al diametro medio: 60 ppi ≈ 470 micron, 80 ppi ≈ 320 um, 100 ppi ≈ 200 micron). Le linee gialle rappresentano l&#39;azione capillare indotta dalla combinazione di primari-pori e micro-canali. Le linee rosse rappresentano l&#39;azione capillare indotta da prevalentemente micro-canali esposte in ogni trabecula. Come mostrato in (F), il modello 100 ppi indotto la forte azione capillare, con conseguente completa saturazione del modello entro 39 sec. I modelli 80 ppi e 60 ppi sono stati testati da allora in poi. (B) 0 sec, (C) 0,5 sec, (D) 1,5 sec, (E) 17.0 sec, (F) 39,0 sec, (G) 50,0 sec, e (H) 1 min 18 sec dopo l&#39;immersione. (Dimensione Template: 1cm x 1 cm x 4 cm di altezza cubica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;ingresso e l&#39;immigrazione di cellule dai pozzi teste di serie (parte I) per i pozzi non teste di serie (parte V) attraverso i modelli biogene indotte per azione capillare. Le cellule inizialmente seminate raggiunto la fine della gamba testa di serie (parte V) subito dopo piena saturazione. Dopo 3 giorni, la confluenza delle cellule era evidente in tutto l&#39;intero modello. Dopo 7 giorni, la formazione di matrice di collagene spazio-temporale si è verificata entro popolazioni cellulari (H &amp; E macchia). (Dimensione Template: 3 cm di altezza x 4 cm di lunghezza x 1 cm di larghezza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a>ick qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

Modelli Distinctive capillare azione da micro-canali in osso, come può migliorare reclutamento di cellule per il Restauro di grande Bony difetto

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Views.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Ricerca

Bioingegneria

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Metodi rapidi ed enzimatici per l'amplificazione di modelli minimi e lineari per la prototipazione di proteine utilizzando sistemi privi di cellule

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...