The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono conformi alle linee guida NIH in conformità con le linee guida indicate dalla University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. 1. neonatale materna Separation (NMS) <ol><li> Monitorare le dighe in gravidanza al giorno per le nascite lettiera. Nota: Il giorno la lettiera è nato è considerato P0. </li><li> Il P1, rimuovere la diga dalla gabbia di casa e mettere in un contenitore secondario pulito. </li><li> Strofinare una manciata di assestamento tra le mani pulite guantate per mantenere il profumo della gabbia di casa. </li><li> Aggiungere una profondità di 1-2 cm della biancheria da letto gabbia a casa in un ambiente pulito, adeguatamente etichettati 2 bicchiere L vetro. Aggiungere circa metà di qualsiasi arricchimento lettiera aggiuntivo che è presente nella gabbia casa, per esempio, nestlet, carta crespa, il bicchiere di vetro. </li><li> Posizionare delicatamente tutti i cuccioli da un&#39;unica cucciolata, singolarmente, nello stesso becher. </li><li> Immediatamente postoil becher in un incubatore tenuto a 33 ° C e 50% di umidità per 180 min. </li><li> Rimuovere la diga dal contenitore secondario e il suo ritorno alla gabbia di casa. Riportare la gabbia a casa per la sua posizione appropriata alloggiamento all&#39;interno del vivaio. </li><li> Ripetere questa procedura per ogni disordine in fase di NMS, utilizzando guanti puliti e contenitori secondari per ogni disordine / bacino. </li><li> Alla fine del periodo di separazione 180 min, restituire cucciolate alle loro gabbie a casa nello stesso ordine in cui sono stati rimossi. </li><li> Recuperare la gabbia a casa della prima cucciolata che è stato separato in precedenza nel corso della giornata. Rimuovere diga dalla gabbia di casa e mettere in un contenitore secondario pulito. </li><li> Rimuovere il primo bicchiere dal termostato e strofinare una manciata di assestamento tra le mani guantate pulite per mantenere il profumo della gabbia di casa durante la manipolazione dei cuccioli. </li><li> Spostare delicatamente i cuccioli, individualmente, dal bicchiere alla gabbia di casa. </li><li> Rientro arricchimento e biancheria da letto rimanendo nel bicchiere perla gabbia di casa. </li><li> Ritorno alla diga dal contenitore secondario alla gabbia a casa e tornare alla sua posizione appropriata alloggiamento all&#39;interno del vivaio. </li><li> Sciacquare il bicchiere con acqua e restituirlo al incubatrice. Utilizzare lo stesso bicchiere per ogni disordine durante tutta la procedura di separazione. </li><li> Ripetere questa procedura per ogni cucciolata subire NMS nello stesso ordine in cui sono stati messi in incubatrice. </li><li> Ripetere l&#39;intera procedura per ogni sottoposti cucciolata NMS ogni giorno attraverso P21. </li><li> Wean cuccioli NMS e naif su P22 mettendo nidiata dello stesso sesso insieme in gabbie pulite complete di cibo e acqua. Cuccioli ingenui dovrebbero nascere e alloggiati sotto le stesse condizioni dei topi NMS, ma subiscono nessun trattamento aggiuntivo al di fuori delle normali attività di allevamento. </li></ol> 2. perigenitale Sensibilità meccanica <ol><li> Setup Apparecchio von Frey <ol><li> Portare i topi alla camera di prova e consentire loro di acclimatare per 30min pur rimanendo nelle loro gabbie a casa. </li><li> Preparare l&#39;area di prova mettendo un underpad assorbente sotto un filo di elevata tavolo maglia-top (79 centimetri x 28 cm) che offre spazio sufficiente per consentire al ricercatore di avvicinarsi dal lato inferiore, senza sorprendente topi, circa 55 cm di altezza. </li><li> Posizionare fino a 12 topi, individualmente, in base a chiare, le camere di plastica forata (11 centimetri x 5 cm x 3.5 cm) sulla parte superiore del tavolo rete metallica. Posizionare un oggetto pesante sulla parte superiore delle Camere per evitare che i topi di fuggire. </li><li> Acclimatare topi per altri 30 min sullo schermo prima valutazione soglia di ritiro. </li></ol></li><li> Valutazione perigenitale sensibilità meccanica <ol><li> Eseguire il metodo up-down con un set standard di graduati monofilamenti von Frey 43. Utilizzare i seguenti monofilamenti: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g, e 4,74 g. <ol><li> Tenere la base del 3,22 g monofilamento ed esporre il mono retrattafilamento. Nota: alcuni modelli non possono avere un monofilamento retratta. </li><li> Collocare la sonda in modo che il monofilamento è orientato verticalmente e quando il mouse è vigile, immobile, e il suo peso corporeo è distribuito uniformemente tra le zampe posteriori applicare sia al lato sinistro o destro dello scroto, evitando la linea mediana, fino ad un lieve bend è osservata nel filamento. </li><li> Tenere il monofilamento in posizione per 10 secondi o finché l&#39;animale mostra una risposta positiva. Nota: Una risposta positiva è considerato uno scatto veloce o salto in risposta all&#39;applicazione monofilamento o leccare o comportamenti mordere diretta verso il monofilamento. Se il mouse si muove durante l&#39;applicazione monofilamento 10 secondi senza visualizzare questi comportamenti, il monofilamento devono essere ritestati dopo un periodo di riposo 1 min a lungo minimo. Se un topo né mosse né mostra uno dei comportamenti elencati sopra durante l&#39;applicazione monofilamento 10 sec, viene considerata una risposta negativa. </li><html><li> Registrare la risposta, negativo o positivo, in un quaderno di laboratorio o portatile e ripetere questa procedura su tutti i rimanenti topi utilizzando il 3,22 g monofilamento. </li><li> Testare tutti i topi utilizzando nuovamente la prossima monofilamento appropriata. Nota: Se il mouse esibito una risposta negativa al 3,22 g monofilamento, applicare il 3,61 g monofilamento nello stesso modo e registrare la risposta. Se il mouse esibito una risposta positiva al 3,22 g monofilamento, applicare il 2,83 g monofilamenti e registrare la risposta. </li></ol></li><li> Continuare il test ogni mouse usando la prossima monofilamento maggiore o minore, a seconda dei casi, per altri 4 applicazioni dopo la prima risposta positiva si osserva. </li><li> Topi Ritorno a gabbie a casa. </li><li> Utilizzare il valore della finale von Frey monofilamento applicata nella serie processo in unità logaritmiche per calcolare una soglia g recesso 50% come descritto nel Chaplan et al. 43. </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 3. Colorazione cellulare acidificati toluidina blu Mast <ol><li> Tissue Processing <ol><li> Sezionare prostata tessuto 44 da topi che sono stati intracardiaca perfusi con ghiacciata 4% paraformaldeide 45. Postfix il tessuto in 4% paraformaldeide per 1 ora a RT e poi cryoprotect nel 30% di saccarosio in 1x PBS a 4 ° CO / N. </li><li> Preparare una piccola (30 ml) bagno di eptano e posizionarlo sul ghiaccio secco. </li><li> Sciacquare il tessuto prostatico in 1x PBS e asciugare con un panno leggeri. </li><li> Inserire il tessuto prostatico in eptano freddo fino a quando non è congelato. </li><li> Porre immediatamente il tessuto prostatico congelato in un cryomold contenente mezzi di montaggio e posto in ghiaccio secco fino congelati. </li><li> Conservare cryomolds a -20 ° C. </li><li> Trasversalmente tagliare il tessuto prostatico in 7 criosezioni micron di spessore con un criostato. </li><li> Inserire 8 - 12 criosezioni non seriali che estendono la lunghezza del tessuto, su vetrini da microscopio caricati positivamente. </li><li> Conservare finito diapositive a -20 ° C, fino al procedimento. </li></ol></li><li> Preparazione acidificata toluidina blu <ol><li> Aggiungere 1 g di blu di toluidina O a 100 ml 70% di etanolo e vortice fino a soluzione per preparare una soluzione madre 1%. La soluzione madre può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di tre settimane. </li><li> Aggiungere 1 g di NaCl a 100 ml di acqua in un becher posto sulla sommità di una piastra di agitazione. </li><li> Regolare il pH della soluzione NaCl usando HCl 12 M fino a pH compreso tra 0,5 - 1,0 si ottiene. </li><li> Preparare la Toluidine Blu soluzione di lavoro 0,25% combinando 8 ml della soluzione madre blu di toluidina e 32 ml di soluzione NaCl 1%. Pipetta su e giù per garantire integrazione totale della soluzione stock blu di toluidina e miscelare con un vortice. La soluzione di lavoro deve essere preparata fresca e scartato dopo l&#39;uso. </li></ol></li><li> Colorazione criosezioni prostata <ol><li> Rimuovere i vetrini da elaborare dal freezer e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per circa 30 min. </li><li> Lavare le sezioni di tessuto immergendo singolarmente i vetrini per circa 1 secondo in una provetta conica da 50 ml contenente un volume sufficiente di 1x PBS per assicurare che le sezioni di tessuto montati scorrevoli saranno completamente sommerse. Lasciare i vetrini per asciugare sul un tovagliolo di carta. </li><li> Posizionare i vetrini in una vaschetta di colorazione di vetro contenente abbastanza 0,25% la soluzione di blu di toluidina per garantire che le sezioni di tessuto montati diapositive saranno completamente sommerse e incubare per 10 - 15 minuti, mentre su una sedia a dondolo piattaforma fissato a 15 giri al minuto. </li><li> Immergere i vetrini in PBS 1x per circa 1 secondo per lavare l &#39;eccesso di toluidina blu. </li><li> Posizionare i vetrini in una scatola diapositiva o rack in modo tale che i vetrini sono sui loro lati per permettere il drenaggio. </li><li> Essiccare i vetrini in un forno a 37 ° C per un minimo di 2 ore o O / N a RT. </li><li> Disidratare scivoli rapidamente utilizzando alcol, permettendo i vetrini per asciugare completamente tra le esposizioni di alcol. Diapositive Dry drenando su un tovagliolo di carta unnd spalle asciugandosi e bordi con un light duty wipe. <ol><li> Immergere i vetrini in 95% EtOH per circa 1 secondo e lasciare asciugare completamente. Ripetere questa procedura 1-10 volte fino tessuto asciuga più azzurro che viola. </li><li> Immergere i vetrini in 100% EtOH per circa 1 secondo e lasciare asciugare completamente. Ripetere questa procedura 1-10 volte fino tessuto è scuro al blu medio, ma non viola. </li></ol></li><li> Fissare la macchia incubando i vetrini in 100% xilene per 3 min. Lasciare asciugare. </li><li> Coverslip le diapositive con glicerolo, PBS, o un supporto di montaggio permanente basato xilene. Scolare l&#39;eccesso dei media e conservare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Quantificare mastociti <ol><li> Visualizzare le sezioni di tessuto blu-tinto toluidina a 20X di ingrandimento tramite microscopio ottico (Figura 2). </li><li> Contare il numero totale di cellule presenti all&#39;interno della zona visualizzata albero e distinguere tra mastociti non degranulati e degranulati. 40X magnificatione può essere necessario confermare lo stato di granulazione in alcuni mastociti. Nota: mastociti non degranulati presentano denso metacromasia senza o con profilo debole nucleare e / o non estrusione granuli intorno alla cellula. Mastociti degranulati esporre meno intenso metacromasia e hanno un evidente chiara descrizione del nucleo e / o granuli liberi all&#39;interno del citoplasma e al di fuori del bordo della cella. </li><li> Continuare per valutare il numero totale dei mastociti non degranulati e degranulati nell&#39;interezza della sezione di tessuto corrente. Ripetere questa procedura su almeno 7 ulteriori sezioni distinte, che lo porterà lungo ogni tessuto. </li><li> Calcolare la percentuale di degranulati (DG) per mastociti totali per ciascun tessuto / mouse in base alla seguente equazione: (DG mastociti / Totale mastociti) x 100. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo prevede una metodologia per l&#39;utilizzo di stress neonatale, sotto forma di NMS, per indurre sintomatologia indicativa di CP / CPPS nei topi maschi adulti. Da adulti, i topi NMS mostrano significativo allodinia meccanica perigenitale, così come prova della degranulazione dei mastociti nel tessuto della prostata. L&#39;uso di NMS è un nuovo approccio allo sviluppo di un modello preclinico di CP / CPPS in quanto riproduce lo stress primi anni di vita che viene spesso segnalato dai pazienti con dolor...

Dolore pelvico cronico, non è di per sé una malattia, ma piuttosto un termine associato con il dolore in corso spontaneo e / o evocata vissuta dai pazienti con diagnosi di sindrome dell&#39;intestino irritabile (IBS), cistite interstiziale / sindrome della vescica dolorosa (IC / PBS), vulvodinia, o prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS). Queste sindromi sono spesso coesistenti e condividere molte caratteristiche che non hanno patologia associata o identificati eziologia, anche se disfunzioni all&#39;interno del sistema immunitario, sistema nervoso centrale e del sistema nervoso periferico ha dimostrato di contribuire al mantenimento e la progressione di questi disturbi 1 -3. I pazienti con dolore pelvico cronico sono più propensi a presentare sintomi di addizionale, non pelvico relativi disturbi del dolore funzionali e disturbi dell&#39;umore, tra cui ansia, depressione, attacchi di panico e 4-6, che è stato associato con alterata funzionamento del ipotalamo ipofisisurrene (HPA) 7-10. L&#39;esposizione a presto lo stress della vita o trauma è un fattore di rischio significativo per lo sviluppo di anomalie HPA e associati sindromi da dolore cronico 10,11 e, in quanto tale, un sottoinsieme significativo di pazienti con disturbi del dolore pelvico funzionali dichiara di aver sperimentato eventi avversi dell&#39;infanzia come l&#39;abuso o negligenza 12-14. Modelli di roditori neonatale separazione materna (NMS), che comporta la rimozione dei cuccioli dalla loro madre per un determinato periodo di tempo durante il periodo preweaning, sono stati utilizzati negli ultimi due decenni a studiare i risultati di stress primi anni di vita. In generale, la NMS ha dimostrato di aumentare la HPA asse di attivazione, e comportamenti ansiosi come risultanti, influenzando direttamente l&#39;espressione genica all&#39;interno dell&#39;ipotalamo, così come disturbare regolazione a valle di strutture limbiche 15-18. Interruzione del buon funzionamento dell&#39;asse HPA ha dimostrato di contribuire a un aumento del colon-retto 19-22 </sup&gt; E vaginale 16 sensibilità visualizzata roditori NMS modelli, ma nonostante estesa caratterizzazione degli effetti a lungo termine di postnatale infiammazione della vescica 23-25, l&#39;impatto dello stress primi anni di vita è in gran parte andata non studiato negli organi urogenitali. Pertanto, il seguente studio descrive come eseguire NMS nei topi e poi valutare perigenitale sensibilità meccanica e l&#39;infiltrazione dei mastociti / attivazione nella prostata per validare l&#39;uso di topi maschi NMS come modello preclinico per CP / CPPS. Di tutti i disturbi del dolore pelvico cronico diagnosi, CP / CPPS è forse la sindrome almeno ben riconosciuto e caratterizzato, pur avendo una prevalenza una tantum di circa il 14% 26 e costo annuo dei pazienti stimati a 4.400 dollari (il doppio di quella di lombalgia o reumatoide artrite 27). I pazienti con CP rapporto / CPPS dolore nel perineo, del retto, della prostata, pene, testicoli, e / o l&#39;addome 28, l&#39;esperienza di un hiGrado gher di stress psicologico rispetto ai pazienti di controllo 29, e comunemente presenti con sintomi di o con diagnosi di comorbidità del dolore o disturbi dell&#39;umore pelvici cronici 5,29-31. Infezioni ricorrenti, epitelio che perde, l&#39;infiammazione neurogena e autoimmunità sono stati tutti ipotizzato come potenziali cause sottostanti di CP / CPPS 2,32,33, così come l&#39;attivazione dei mastociti e degranulazione 34. Espresso secrezioni prostatiche da uomini con CP / CPPS erano aumentati triptasi mastocitaria e fattore di crescita nervoso (NGF) livelli di 34, e uno studio successivo confermato che triptasi e carbossipeptidasi A (CPA3), un marker di attivazione dei mastociti, sono stati aumentati nel urine dei pazienti CP / CPPS 35. Il ruolo potenziale di mastociti nella insorgenza e la manutenzione di CP / CPPS è stato un importante centro di ricerca animale su questa sindrome finora. Il modello di roditore più comunemente impiegato utilizzato per studiare CP / CPPS è una prostatite autoimmune sperimentale (EAP) Modello genazionata mediante iniezione sottocutanea di antigene prostatico in adiuvante completo di Freund, che si traduce in vari gradi di infiammazione prostatica seconda specie e ceppo usati 34,36-39. Infiltrazione dei mastociti e l&#39;attivazione / degranulazione ha dimostrato di aumentare dopo induzione di EAP 34,35,40. Topi transgenici carenti in entrambi i mastociti 34 o il recettore triptasi PAR2 35 non sviluppano prostatica sensibilità tattica seguente EAP, a differenza di topi di tipo selvatico EAP. Anche se questo modello preclinico replica molte delle caratteristiche della CP umana / CPPS, il protocollo di induzione non è indicativo della condizione umana, che ha un&#39;eziologia diverse e spesso non comporta l&#39;infiammazione diretta, infezioni o lesioni della prostata. L&#39;influenza dello stress primi anni di vita sullo sviluppo del CP / CPPS negli esseri umani ha in gran parte andato uninvestigated; tuttavia, uno studio di Hu, et al. 41, ha dimostrato che men che ha riportato una storia di infanzia fisico, emotivo, e / o di abusi sessuali erano significativamente più probabilità di avere sintomi suggestivi di CP / CPPS. Inoltre, essi hanno dimostrato che sia il dolore e decine urinari sono aumentati nei pazienti con una storia di abuso fisico ed emotivo. Abbiamo precedentemente dimostrato che lo stesso paradigma NMS in femmina C57BL / 6 topi produce ipersensibilità vaginale e l&#39;espressione genica anormale sia nella vagina e vescica suggestiva HPA disfunzionale uscita asse 16. Questa evidenza combinata con l&#39;alta prevalenza di pazienti CP / CPPS presentano altre patologie concomitanti, tra cui 42 IC / PBS e disturbi dell&#39;umore, che sono state più chiaramente dimostrato di essere collegati con l&#39;esposizione allo stress primi anni di vita 12-14, fornisce il razionale per l&#39;utilizzo di un modello di NMS per indagare CP / CPPS nei topi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS) ha una prevalenza una tantum del 14% ed è la diagnosi urologica più comune per gli uomini di età inferiore ai 50 anni, ma è la malattia dolore pelvico cronico meno compresi e studiati. Un sottoinsieme significativo di pazienti con la relazione del dolore cronico pelvico avendo sperimentato presto lo stress della vita o di abuso, che può notevolmente influenzare il funzionamento e la regolamentazione del (HPA) dell&#39;asse ipotalamo-ipofisi-surrene. L&#39;attivazione dei mastociti, che ha dimostrato di aumentare sia nelle urine e ha espresso secrezioni prostatiche di CP pazienti / CPPS, è parzialmente regolato dall&#39;attivazione valle dell&#39;asse HPA. Neonatale separazione materna (NMS) è stato utilizzato per oltre due decenni a studiare i risultati di stress primi anni di vita in modelli di roditori, compresi i cambiamenti di HPA e la sensibilità viscerale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;utilizzo di NMS come modello preclinico di CP / CPPS in maschi C57BL / 6 topi. Descriviamo la metodologiaper l&#39;esecuzione di NMS, valutando perigenitale allodinia meccanica, ed evidenza istologica di attivazione dei mastociti. Inoltre forniamo la prova che presto lo stress psicologico può avere effetti di lunga durata sul sistema urogenitale maschile in topi.

I topi che hanno subito NMS ha mostrato la prova del comportamento indicativa di CP / CPPS. Quando la prova con una serie graduata di monofilamenti von Frey, a 8 settimane di età topi NMS (n = 4) visualizzato perigenitale allodinia meccanica rispetto alle controparti ingenui (n = 5, figura 2). Ciò è evidenziato come una riduzione significativa (p &lt;0.01; test t) del limite meccanico recesso che ha suscitato una risposta comportamentale positiva, iscritto a scatto veloce o salto in risposta...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Stiamo misurando la sensibilità e l&#39;albero di attivazione perigenitale cella meccanico nella prostata maschile C57BL / 6 topi che ha subito un paradigma di stress primi anni di vita - la separazione materna neonatale, al fine di indurre un modello preclinico di sindrome da dolore pelvico / cronico prostatite cronica.

Valutazione della perigenitale Sensibilità e prostatica Mast attivazione delle cellule in un modello murino di Neonatale separazione materna

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K Views.  University of Kansas Medical Center.  Stiamo misurando la sensibilità e l'albero di attivazione perigenitale cella meccanico nella prostata maschile C57BL / 6 topi che ha subito un paradigma di stress primi anni di vita - la separazione materna neonatale, al fine di indurre un modello preclinico di sindrome da dolore pelvico / cronico prostatite cronica. 

Video: Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

Un modello di asfissia neonatale suina

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Un modello di Piglet neonatale Hypoxic-ischemica Encefalopatia

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Una serie di test a motore in neonatale topo modello di paralisi cerebrale

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarto del miocardio in topi neonati, un modello di rigenerazione cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modello di criolesionismo per studiare l'infarto miocardico nel mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Un modello murino BALB/c neonatale di enterocolite necrotizzante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...