I metodi per la quantificazione di varie particelle rappresentano un aspetto critico della maggior parte degli studi di biologia. Questo protocollo permette una quantificazione precisa dei dati virali in tempo reale. Questa tecnica sostituisce la tradizionale misurazione dei dati virali.
Con dati oggettivi in tempo reale, siamo al di sotto del nostro intervallo di confidenza, evitando la valutazione degli endpoint ad alta intensità di lavoro. Questo metodo può essere utilizzato per tutti i virus che inducono un effetto citopatico. A dimostrare la procedura sarà Quentin Grassin, un tecnico di laboratorio del nostro laboratorio.
Per propagare e amplificare i virus H1N1, seminare 7,5 volte 10 alle 6 cellule MDCK su due palloni di coltura tissutale di 75 centimetri quadrati secondo protocolli standard e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius per raggiungere il 90-100% di confluenza. Il giorno successivo, lavare le celle due volte con cinque millilitri di PBS sterile per pallone per lavaggio ed etichettare un pallone come controllo. Quindi, diluire una fiala scongelata di stock di virus dell'influenza A alla concentrazione sperimentale appropriata in un tubo da 1,5 millilitri contenente un mezzo di propagazione del virus fresco.
Utilizzare un millilitro dello stock diluito per infettare le cellule MDCK a una molteplicità di infezione da 1 volte 10 al negativo 3, o 1 volte 10 al negativo 4 unità di formazione della placca per cellula, e aggiungere un millilitro di mezzo di propagazione del virus al pallone di controllo. Assorbire il virus alle cellule per 45 minuti a temperatura ambiente, mescolando ogni 15 minuti. Alla fine dell'incubazione, rimuovere l'inoculo e sostituirlo con 15 millilitri di terreno di propagazione del virus integrato con un microgrammo per millilitro di tripsina TPCK per facilitare la scissione dell'emoagglutinina virale HA0 nelle subunità HA1 e HA2.
Quindi posizionare il pallone nell'incubatrice a 35 gradi Celsius per tre giorni. Alla fine dell'incubazione, confrontare le cellule in ogni coltura sotto un obiettivo 40x su un microscopio ottico per valutare gli effetti citopatici sulle cellule. Quando l'effetto citopatico è completo, aggiungere i supernatanti di coltura cellulare a un tubo di 15 millimetri e raccogliere i detriti cellulari da ogni coltura mediante centrifugazione.
Quindi, trasferire il surnatante di coltura del virus chiarito in un tubo da 15 millilitri e aliquotare i virus della progenie in fiale criogeniche sterili monouso per una conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per determinare la quantità cellulare appropriata per l'infezione cellulare, preparare colture cellulari MDCK confluenti per circa l'80% 24 ore su 24, come dimostrato, prima di lavare le cellule con PBS e raccoglierle con un'incubazione di 45 minuti in tre millilitri di 0,25% tripsina-EDTA per pallone a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con sette millilitri di terreno di coltura fresco per pallone e contare le cellule di ogni coltura.
Diluire le cellule a 4 volte 10 alla quinta cella per millilitro di terreno di coltura cellulare ed eseguire due diluizioni seriali delle cellule come indicato. Posizionare una piastra E a temperatura ambiente per diversi minuti prima di aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto senza toccare gli elettrodi della piastra E. Sblocca le culle e inserisci l'estremità anteriore della piastra nella tasca della culla dello strumento di misurazione dell'impedenza.
Chiudi la porta dell'incubatore e apri il software. Nell'impostazione predefinita del modello di esperimento, evidenziare le culle selezionate e fare doppio clic sulla pagina superiore per immettere il nome dell'esperimento. Fare clic su Layout e immettere le informazioni di esempio necessarie per ogni pozzetto selezionato della piastra.
Fare clic su Pianifica, Passaggi e Aggiungi un passaggio. Il software aggiungerà automaticamente un passaggio di un secondo per misurare l'impedenza di sfondo Fare clic su Esegui e avvia, continua. Fate clic su Plot (Plot) e Aggiungi (Add) per selezionare i pozzetti appropriati, confermando che l'impedenza di sfondo è compresa tra 0,1 e 0,1 negativi prima di procedere al passaggio successivo.
Quindi, rimuovere la piastra dalla culla e aggiungere 100 microlitri di ciascuna sospensione cellulare ai pozzetti appropriati in duplice copia. Lasciare la piastra E nella cappa a flusso laminare per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire una distribuzione uniforme delle celle sul fondo dei pozzetti prima di caricare la piastra E nella tasca della culla. Fare clic su Pianifica e aggiungi passaggio e immettere i valori per monitorare le celle ogni 30 minuti per 200 ripetizioni prima di selezionare Avvia, Continua.
Per controllare e tracciare i dati di impedenza cellulare, fare clic su Traccia e selezionare la concentrazione di cellule che si trova appena prima della fase stazionaria 24 ore dopo la semina per ottenere cellule che sono ancora in una fase di crescita durante l'infezione virale. Per determinare la correlazione tra i valori CIT50 e la molteplicità dell'infezione, dopo aver coltivato 3 volte 10 alla quarta cella MDCK appena divisa in ciascun pozzetto della piastra microtitolatrice elettronica per 24 ore, lavare le cellule due volte con 100 microlitri di terreno di propagazione del virus fresco per pozzetto, per lavaggio, e utilizzare una pipetta a canale singolo per aggiungere 100 microlitri di sospensione virale a ciascun pozzo. Quando tutte le diluizioni del virus sono state aggiunte, caricare delicatamente la piastra nella tasca della culla dello strumento a 35 gradi Celsius e iniziare a monitorare l'impedenza cellulare ogni 15 minuti per almeno 100 ore, come dimostrato.
Dopo due cicli di misurazioni, fare clic per mettere in pausa l'apparecchio e rimuovere la piastra elettronica dalla culla. Aggiungere 100 microlitri di terreno di propagazione del virus integrati con tripsina TPCK a ciascun pozzetto e restituire la piastra E nella tasca della culla. Quindi, avviare l'analisi.
Per valutare la cinetica di sopravvivenza del virus dell'influenza A, aggiungere cloruro di sodio a una concentrazione finale di 35 grammi per litro in acqua distillata e aggiungere 900 microlitri della soluzione salina risultante a due criotubi di millilitri. Aggiungere 100 microlitri virali a ciascun criotubo e posizionare i tubi nell'incubatore a 35 gradi Celsius per il periodo di tempo sperimentale appropriato. Il giorno prima della fine dell'incubazione, seminare 3 volte 10 al 4 ° cellule MDCK appena divise e 100 microlitri di terreno di propagazione del virus per pozzetto in una piastra di microtitolazione a 16 pozzetti in fasi ripetute, consentendo la misurazione dell'impedenza di fondo e la distribuzione uniforme delle cellule sul fondo dei pozzetti.
Quindi far crescere le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, lavare le cellule due volte, quindi infettare le cellule con 100 microlitri del virus distillato con soluzione salina diluiti 10 volte in terreno di coltura fresco, come dimostrato, e monitorare l'impedenza cellulare ogni 15 minuti per almeno 100 ore. Qui vengono mostrati i dati grezzi ottenuti dopo 120 ore con diverse concentrazioni di cellule MDCK.
Dopo 24 ore, le misurazioni dell'indice cellulare hanno rivelato che le cellule nei pozzetti seminati con 3 volte 10 alle 4 cellule erano ancora nella fase esponenziale di crescita, quindi questa concentrazione cellulare è stata utilizzata per esperimenti successivi. Le colture cellulari MDCK dimostrano una chiara relazione lineare tra il CIT50 e la molteplicità iniziale dell'infezione da virus dell'influenza. I risultati di un tipico esperimento cinetico di sopravvivenza mostrano una diminuzione dell'indice cellulare a causa dell'effetto citopatico indotto dal virus.
Il CIT50 può essere utilizzato per calcolare la pendenza di inattivazione virale per ciascun virus in ogni condizione per la determinazione di quale virus ha avuto la maggiore stabilità nell'ambiente studiato. La stabilità del virus è indirettamente correlata alla pendenza di inattivazione, consentendo, ad esempio, di identificare i residui di amminoacidi nella glicoproteina emoagglutinina coinvolti nella sopravvivenza del virus dell'influenza A al di fuori dell'ospite. Questa tecnica è molto sensibile alle piccole variazioni.
Pertanto, l'utilizzo di un contatore automatico di cellule è incoraggiato al fine di ottenere risultati riproducibili tra gli esperimenti. Questo metodo può anche essere utilizzato per confrontare la replicazione di diversi virus, per studiare il tropismo del virus per diverse linee cellulari alla volta o per studiare fasi specifiche del ciclo del virus.
