Vorremmo ringraziare il Dott Garry Nolan dalla Stanford University per la fornitura della linea cellulare di packaging Phoenix GP per la produzione di particelle retrovirali. Ringraziamo il Dr. Roger Tsien presso l&#39;Università della California a San Diego per la fornitura di td Tomato. Vorremmo anche ringraziare il Fondo San Diego State University Citometria a flusso di base per il loro servizio e aiuto.

1. Preparazione di cellule di mammifero, produzione virale e trasduzione per codici a barre genetico <ol><li> Tavola 2.5 x 10 6 cellule aderenti in un piatto di 10 cm (o intorno 50-60% confluenza) un giorno prima di trasfezione in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero di vitello fetale del 10% (FCS). Per retrovirale uso di produzione imballaggi linea cellulare di scelta, come Phoenix-GP (un gentile dono da Gary Nolan, Stanford University). NOTA: La linea cellulare di packaging esprime stabilmente Gag e Pol proteine ​​per la formazione di particelle retrovirali in trans. Assicurarsi cellule sono sani e aderito alla piastra in un monostrato, prima trasfezione. </li><li> 24 ore più tardi, preparare la miscela di trasfezione DNA. <ol><li> Per 125 ml di DMEM senza siero aggiungere 3 g Busta Virus stomatite vescicolare vettore glicoproteina (PCI-VSVG) e 3 mg di trasferimento vettore che trasporta il gene della proteina fluorescente di interesse. Mescolare e aggiungere 15 ml di polyethylimine (2 mg / ml). </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 min e aggiungere alle cellule goccia a goccia. NOTA: Polyethylimine viene aggiunto alla miscela omogenea DNA come reagente di trasfezione per la formazione di polyplexes. Al fine di ottenere particelle virali che trasportano diversi marcatori proteici fluorescenti, eseguire ogni trasfezione indipendentemente con il marcatore di scelta. Ricordate che il trasferimento vettore retrovirale è di circa 7 Kb di lunghezza e non può essere confezionato se superiori a 10 kb. </li></ol></li><li> Incubare le piastre a 37 ° C. Per aumentare virali Consiglio produzione piastre a 30 ° C invece o 32 ° C. NOTA: 24 mezzi trasfezione hr postali possono essere sostituiti con 7 ml di mezzi freschi, e anche se questo può migliorare la salute delle cellule che possono diminuire la carica virale nel surnatante. </li><li> 48 ore dopo la trasfezione raccogliere le particelle virali-surnatante contenente e filtrare con un filtro da 0,45 micron politetrafluoroetilene. Utilizzare surnatante virale raccolto di recente per la trasduzione. Othaltri- mantenere surnatante in aliquote a -80 ° C ed evitare di gelo-disgelo. Ricorda che titolo virale diminuirà probabilmente fino al 50% con ogni ciclo di congelamento-scongelamento. </li><li> Linea cellulare Piatto di scelta 24 ore prima della trasduzione se aderenti, o immediatamente prima trasduzione se non aderente. Seed 2.0 x 10 5-3,0 x 10 5 cellule aderenti (qui Huh 7.5.1 e HEK 293T) o 5,0 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule non aderenti (qui SupT1) per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. NOTA: Assicurarsi di calibrare il numero di cellule per essere seminati prima trasduzione, specialmente per cellule aderenti, cellule così raggiungere una confluenza di circa il 60% al momento della trasduzione. </li><li> Aggiungere 5 mg / ml Polybrene (hexadimethrene bromuro) a cellule seminate e poi aggiungere surnatante virale precedentemente raccolti per ottenere intorno al 20-40% di infezione (qui 2 ml). NOTA: Il MOI o la percentuale di infezione è in gran parte arbitraria, in quanto l&#39;ordinamento consente di amplificare qualsiasi subpopulatione delle cellule. Ovviamente, un più alto tasso di infezione facilita e velocizza il processo di amplificazione. </li><li> Trasdurre cellule mediante centrifugazione in un rotore secchio appeso a 1.500 xg per 120 min a 32 ° C. Risospendere le cellule non aderenti con mezzi freschi prima dell&#39;incubazione. Per le cellule aderenti, sostituirlo con fresco supporti 24 ore post-trasduzione. NOTA: Si raccomanda di sigillare le piastre prima della centrifugazione con parafilm per evitare fuoriuscite sopra. Per aumentare la diversità delle cellule geneticamente con codice a barre, trasdurre cellule con particelle virali che trasportano le proteine ​​fluorescenti diversi (ottenuti dal punto 1.4). Quando si sceglie marcatori fluorescenti, assicurarsi che siano compatibili con la strumentazione e hanno parametri fluorescenti distinguibili. </li></ol> 2. Selezione e Amplificazione delle Cellule geneticamente con codice a barre <ol><li> Analizzare le cellule di mammifero trasdotte mediante citometria di flusso di almeno 72 ore dopo la trasduzione per quantificare la percentuale di trasduzione. Utilizzare una linea paragonabile cellule non trasdotte come controllo negativo. NOTA: Come ordinamento verrà utilizzata per purificare singole popolazioni cellulari a barre, una percentuale elevata di trasduzione iniziale, mentre non necessario, dovrebbe accelerare il processo di amplificazione. </li><li> Utilizzare la cellula-sorter di scelta per ottenere le cellule che esprimono la proteina di interesse. <ol><li> A tal fine, verificare le porte siano impostati correttamente nei canali giusti. <ol><li> Per fare ciò utilizzare la stessa linea cellulare naive come controllo negativo e impostare la tensione parametro / canale in modo che la popolazione negativo è inferiore al valore di 10 3 su ciascun asse fluorescente. Determinare gating per fluorescenza positiva come eventi che appaiono sopra quella del controllo negativo per ciascun canale fluorescente. </li></ol></li><li> Essere consapevoli del fatto che ogni strumento può variare e la tensione corretta per determinare gating deve essere adeguato di conseguenza, rendendo i controlli positivi e negativi in ​​ogni imperativi expinstallazione erimental. <ol><li> Per il rilevamento della fluorescenza in questo setup sperimentale utilizzare il canale FITC (530/30 filtro passa banda proceduto da una lunga filtro passa 502) per eGFP, il canale di PE (585/42 filtro passa banda proceduto da un filtro 556 passaggio lungo) per td Tomato , e il canale di APC (660/20 filtro passa banda) per E2 Crimson. NOTA: Il laser 488 nm eccita eGFP e td pomodoro mentre E2 Crimson è eccitato dal laser 633 nm. </li></ol></li></ol></li><li> Ordina in 15 ml provette coniche con 1 ml di 100% FCS. NOTA: Il processo di smistamento popolazioni di cellule fluorescenti non è obbligatoria, come si può procedere direttamente con il tipo di singoli cloni (vedi sotto). Ordinamento popolazioni strette basate sulla fluorescenza scelta garantisce una popolazione di backup per la futura selezione dei singoli cloni. Tenere presente che le cellule individuali sono talvolta difficili a crescere, mentre una grande popolazione di cellule può essere facilmente congelato, e poi scongelato e amplificato in una fase successiva. </li><li> Spin giù per le popolazioni ordinati in un rotore di centrifuga appeso secchio a 524 g a 32 ° C per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere in 1 ml di mezzi freschi, e ri-piastra cellule in modo che confluenza cella è inferiore al 60% per consentire la crescita e la divisione per almeno due giorni. <ol><li> Ad esempio, piastra cellule aderenti a circa 3 x 10 5 cellule in 2 ml di media per bene in un 6-pozzetti e 2 x 10 6 cellule in 2 ml di media in un 6 centimetri. Utilizzare DMEM per cellule aderenti e RPMI per le cellule non aderenti (o qualsiasi supporto specificato, se necessario). Inserire cellule piastrate in un incubatore a 37 ° C per diversi giorni per consentire l&#39;amplificazione. </li></ol></li></ol> 3. Ottenere clonali popolazioni di cellule geneticamente con codice a barre a diverse intensità <ol><li> Ottenere popolazioni clonali di cellule originariamente trasdotte (punto 1.7) o dalla popolazione ordinata (punto 2.3). NOTA: Ciò garantirà livello uguale o simile di espressione proteina fluorescente fra tutti la cellas all&#39;interno della popolazione (una popolazione stretto con una piccola CV in media intensità di fluorescenza di fino al 40%). <ol><li> A tal fine, le cellule singole specie in piastre da 96 pozzetti con una unità di deposizione delle cellule automatizzato (ACDU). Set porte per l&#39;ordinamento in base alle popolazioni di interesse. Assicurarsi che cancelli sono fissati almeno un log scala a parte per ottenere popolazioni distinguibili quando si sceglie cellule a diverse intensità di fluorescenza. Per la procedura qui illustrato, utilizzare la stessa citofluorimetria sperimentale impostato come quello descritto nel passaggio 2.2. </li></ol></li><li> Amplifica singoli cloni in un incubatore a 37 ° C per almeno 2 settimane. Attraverso il processo di amplificazione analizzare le cellule sotto il microscopio per garantire che le popolazioni crescenti derivano da singole cellule e non da più di uno. NOTA: Ricordare che la selezionatrice inserirà una cella per pozzetto in media, e mentre alcuni pozzetti non possono avere qualsiasi cella affatto, altri possono avere più di una. <ol><li> Per garantire che un popopo- deriva da una cellula sola, essere estremamente gentile con la piastra e non disturbare i pozzetti pipettando. Osservare la piastra, così da bene, al microscopio. NOTA: Mentre le cellule individuali possono a volte essere difficili da identificare, una volta che iniziano dividendo che sarà facilmente riconoscibile. </li><li> Essere consapevoli del fatto che spesso cellule &#39;gruppo&#39; lungo i bordi. Eliminare quei pozzi, dove si possono osservare diverse popolazioni clonali e mantenere quelle che hanno una popolazione stretto. NOTA: Si consiglia di trasferire in piastre quelli più grandi per l&#39;amplificazione. </li></ol></li><li> Schermo popolazioni clonali putativi analizzando loro mediante citometria a flusso. Confronta loro di un controllo negativo utilizzando la stessa citometria a flusso setup sperimentale. <ol><li> Analizzare solo una percentuale del campione e mantenere il resto come backup. Scegli le popolazioni più nettamente separati in base intensità media e la tenuta della popolazione. Amplificarli come necessario o congelare le scorte incongelamento supporti con 20% glicerolo a -80 ° C per brevi periodi di tempo o azoto liquido per più. NOTA: Ricordate che un &#39;vero&#39; popolazione clonale dovrebbe avere un modello di fluorescenza molto stretto. </li></ol></li></ol> 4. Garantire capacità multiplexing per High Throughput Screening (HTS) <ol><li> Combinare come molte popolazioni clonali distinte come necessario che può essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplexati. Scegli cloni con distinguibile assorbimento / spettri di emissione e / o intensità diverse. Se viene utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, che è adatto per HTS, seme 50.000 cellule in 200 microlitri per pozzetto. NOTA: tenere presente che il numero di cellule è solo una stima e può variare in base a tipo cellulare e se è aderente o meno. </li><li> Analizzare il campione usando citometria a flusso per garantire che ciascuna delle linee cellulari fluorescenti indipendenti stabiliti possono essere distinte tra loro. Prima dell&#39;analisi preparare negativee controlli singoli colori per impostare i parametri ei valori di compensazione. NOTA: L&#39;impostazione dei parametri per distinguere chiaramente le popolazioni miste li permetterà di essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplex. </li></ol> 5. Adattare linee cellulari geneticamente con codice a barre per l&#39;applicazione biologica della scelta <ol><li> Trasdurre stabilite linee cellulari geneticamente di codici a barre con particelle virali che contengono gli elementi di analisi di scelta, come descritto qui in Stolp et al., 2013 59. Ricordare che il saggio di scelta dovrebbe occupare un canale fluorescente aggiuntivo e distinguibili e quindi deve essere trasferito alla linea cellulare appropriata codice a barre. NOTA: Ogni linea cellulare codice a barre può sopportare un test diverso. </li><li> Celle a barre Ordina geneticamente fluorescenti per quelli che contengono elementi di analisi. NOTA: Elementi test può essere progettati accoppiato ad un tag o proteina fluorescente (come una fusione o tramite un sito di entrata ribosoma interna) fo il rilevamento diretto attraverso western blotting, citofluorimetria e microscopia. Il sistema utilizzato in questo protocollo si basa su HA espressione di superficie epitopi da solo, o con l&#39;aggiunta di espressione FLAG epitopi. <ol><li> Colorare le popolazioni clonali contenenti i test con gli anticorpi accoppiati HA e APC-modo fluorescente. Poi analizzare le popolazioni clonali con anti-FLAG e FITC-coniugato colorazione anticorpi. </li><li> Per rintracciare il test, analizzare o &#39;decodificare&#39; le popolazioni del canale appropriato caso è possibile distinguere le linee cellulari geneticamente distinte di codici a barre. Qui, decodificare la natura del substrato analizzando nel canale PE per td rilevamento pomodoro. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui sono stati combinati due procedure consolidate; l&#39;ingegneria genetica attraverso la tecnologia retrovirali e l&#39;individuazione di proteine ​​fluorescenti che utilizzano citometria a flusso. Codici a barre a base di proteine ​​fluorescenti genetica per la produzione di linee cellulari uniche fornisce un modo semplice e affidabile per applicazioni multiplex. Generazione di codici a barre cellule geneticamente modificate attraverso la tecnologia retrovirale, è inizialmente un processo lungo, ma permette...

Tecnologie come spettroscopia di fluorescenza, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso, tutti si basano su di fluorescenza, una proprietà ampiamente sfruttato in applicazioni biochimiche, biomediche, e chimici. Fluorescenza, sia intrinseca o tramite l&#39;etichettatura, è stata sfruttata per l&#39;analisi dei pattern di espressione di proteine ​​e profili, destino cellulare, interazioni proteina e le funzioni biologiche 1-9, e attraverso di fluorescenza / Förster trasferimento di energia di risonanza per la rivelazione di interazioni biomolecolari e cambiamenti conformazionali 10-13. Dal momento che l&#39;isolamento del victoria proteina fluorescente verde Aequorea (GFP) 14, la scoperta di proteine ​​fluorescenti aggiuntivi presenti in natura provenienti da altri cnidari, in particolare i coralli, ha ampiamente aumentato il numero di proteine ​​fluorescenti esistenti con spettri di eccitazione / emissione distinguibili. Questi, insieme con l&#39;introduzione di mutazioni nei loro geni 15-19, HAVe ulteriormente ampliato le possibilità, ottenendo una vera tavolozza di proteine ​​fluorescenti a disposizione degli scienziati che sfruttano la microscopia, citometria a flusso e altre tecnologie basate sulla fluorescenza per le loro ricerche. In parallelo, anche se in maniera indipendente, lo sviluppo della tecnologia ha drasticamente retrovirale facilitato l&#39;espressione stabile di informazioni genetiche ectopica in cellule di mammifero 20-23. Non è quindi sorprendente che questa tecnologia è stata utilizzata per trasferire geni di proteine ​​fluorescenti in un ampio numero di tipi di cellule e tessuti 24-28 o per la produzione di animali transgenici 29-31. Seguendo la natura dei retrovirus, l&#39;informazione genetica della proteina fluorescente ectopica viene introdotto all&#39;interno del genoma della cella 32 e la cella diventa fluorescente `per ever&#39;. La struttura, ha permesso il monitoraggio del destino delle cellule, o di una singola cella all&#39;interno di una popolazione di cellule. La cella ora fluorescente così acquicolore rosso proprio BioSignature e può essere definito come codice a barre. La sua unica BioSignature identifica da altre cellule, e, soprattutto, la distingue dalle cellule geneticamente manipolate per esprimere proteine ​​fluorescenti diversi con spettri di assorbimento / emissione distinguibili. Applicazioni biologiche quali il monitoraggio dei fattori di riprogrammazione verso pluripotency 33, l&#39;analisi dei fattori subnucleari per la delucidazione della localizzazione nucleolare 34, la costruzione dei plasmidi reporter fluorescenti per studi trascrizionali 35 o l&#39;etichettatura genetica dei neuroni per lo studio di architettura di rete neuronale 36 , sono solo quattro esempi dei molti che hanno sfruttato diversi geni di proteine ​​fluorescenti per lo stesso apparato sperimentale. La citometria a flusso è stato ampiamente utilizzato per l&#39;analisi dei processi biologici a livello di singola cellula, come l&#39;espressione genica, ciclo cellulare, apoptosi, e segnalazione attraverso fosforilzione 37-43 .Il espressione stabile di geni di proteine ​​fluorescenti in cellule di mammifero ha ulteriormente migliorato l&#39;utilità di citometria a flusso per l&#39;analisi delle cellule 38,44 e ligando-recettore interazioni 45. Capacità avanzate hanno permesso di citometria a flusso per diventare una metodologia ampiamente utilizzata per high-throughput e alto contenuto di screening 46. Nonostante il numero ampliato di fluorometers e robotica tecnologie che possano sistemi per la lettura paio piastre, imaging e citometria a flusso, sembra che ci sia una mancanza di disegno sperimentale che può sfruttare e montare queste capacità tecnologiche avanzate. Metodologie basate sulle cellule veloci, affidabili, semplici e robuste sono drasticamente necessari per le applicazioni canalizzate che migliorano ulteriormente la capacità high-throughput. Questo è particolarmente vero nel campo della scoperta di farmaci in cui saggi cellulari di ingegneria in un formato multiplex può migliorare la potenza di high-throughput di screening 39,47-50 </sup&gt;. Multiplexing, in quanto permette analisi simultanee in un campione, migliora ulteriormente le funzionalità high-throughput 51-54. Barcoding genetica fluorescente permette non solo elegante multiplexing, ma anche, una volta costruito, elude la necessità di protocolli in termini di tempo, riduce i costi accompagnate da anticorpi, perline e macchie 39,52,55, e può ridurre il numero di schermi necessari per alto applicazioni di throughput. Abbiamo recentemente descritto come la tecnologia può migliorare retrovirale multiplexing attraverso barcoding genetica fluorescente per applicazioni biologiche, esprimendo un test precedentemente sviluppato per monitorare HIV-1 proteasi 56,57 con diverse varianti clinicamente prevalenti 58. La metodologia è illustrata in modo più descrittivo concentrandosi su come selezionare e amplificare le celle a barre geneticamente fluorescenti e come produrre pannelli di popolazioni clonali che esprimono proteine ​​fluorescenti distinte e / o diversa intensit fluorescenzaIES. Pannelli di popolazioni di cellule distinguibili in base alle loro caratteristiche fluorescenti aumentano funzionalità multiplexing, che possono essere ulteriormente sfruttati in combinazione con saggi cellulari che affrontano diverse questioni biologiche. Il protocollo inoltre descritto come ingegnere di un gruppo di cellule con codice a barre che recano uno dei saggi cellulari precedentemente sviluppate in laboratorio, come ad esempio 59. Questo protocollo non è quindi lo scopo di mostrare la consolidata tecnologia retrovirale / lentivirali per il trasferimento genetico, il valore delle proteine ​​fluorescenti o le applicazioni di citometria a flusso 60,48 ma piuttosto per mostrare la potenza migliorando di combinare tre per le applicazioni canalizzate.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Multiplexing fluorescenti geneticamente codice a barre cellule a fini di applicazioni biologiche possono essere realizzati solo dopo che siano stati generati singole popolazioni clonali. Multiplexing è più efficace quando le popolazioni di codici a barre hanno caratteristiche distinte fluorescenti nitide con il minimo sovrapposizione spettrale. L&#39;esempio illustrato nella figura 1 con popolazioni clonali di cellule di mammifero SupT1 illustra che le cellule a barre con mCherry e proteina fluorescen...

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

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Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute Quantum la misurazione del rendimento dei campioni di polvere

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Barcoding genetica con proteine fluorescenti per applicazioni multiplexati