Name: curtain flow column: optimization of efficiency and sensitivity
Uploaded: 2016-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
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One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Attenzione: Si prega di fare riferimento alle schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell&#39;uso (ad esempio, scheda di sicurezza per il metanolo). Garantire l&#39;uso di tutte le pratiche di sicurezza appropriate durante la manipolazione di solventi e ad alte prestazioni cromatografia liquida eluente (HPLC). Garantire un uso appropriato di controlli tecnici di HPLC, analitica equilibrio e rilevatore di strumentazione, e garantire l&#39;uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, e scarpe chiuse). Nota: Questo protocollo contiene le istruzioni su come utilizzare una colonna CF su un sistema HPLC accoppiato con un rivelatore UV-Vis. Il protocollo è stato scritto assumendo che il lettore abbia una conoscenza di base ed esperienza in cromatografia. 1. Configurazione dello strumento HPLC Nota: Questa sezione può essere modificato in base alle esigenze degli analisti, vale a dire, la scelta dei solventi, rilevatore di lunghezza d&#39;onda e velocità di flusso cheappropriate per il campione di interesse. <ol><li> Preparazione dello strumento HPLC con acqua ultrapura 100% (esempio acqua Milli-Q) per la linea A e 100% di metanolo per la linea B come fase mobile e spurgare le pompe secondo il requisito produttore. </li><li> Impostare il rivelatore UV-Vis a 254 nm. </li><li> Scegliere una modalità split flusso pre-iniezione di set-up, o una doppia portata della pompa di set-up. Per la modalità split-flow passare al punto 2, per la modalità dual pompa passare alla Fase 3. </li></ol> 2. Installazione del sistema Split-flow <ol><li> Scollegare la linea della pompa dalla valvola dell&#39;iniettore della auto-campionatore. </li><li> Collegare un raccordo a T alla linea pompa. </li><li> Fissare un pezzo a 15 cm da 0,13 millimetri tubi id a ogni porta della T-pezzo. </li><li> Collegate un tubo dal raccordo a T per iniettore valvola di auto-campionatore. </li><li> Impostare la pompa 1,0 ml min -1. </li><li> Prima di collegare le linee pompa all&#39;ingresso della colonna CF, ottimizzare il rapporto della segmentazione del flusso al 40%: 6<html> 0% (linea centrale: linea periferica) come segue al punto 2.7. </li><li> Messa a punto del rapporto di entrata CF sul sistema split-flow <ol><li> Misurare la massa dei due recipienti di raccolta vuoti utilizzando una bilancia analitica ed etichettare un recipiente di raccolta centrale e l&#39;altra periferica (una per la linea dal autocampionatore per centrare porta e uno per la linea dal T-pezzo porta periferica) . </li><li> Per 1,0 min, raccogliere la fase mobile esce dalla linea proveniente dall&#39;iniettore (al punto che verrà collegato alla colonna) nel recipiente di raccolta, la cui massa è stata misurata in 2.7.1. </li><li> Pesare nuovamente il serbatoio di raccolta sulla bilancia analitica e determinare la massa di fase mobile raccolti. </li><li> Ripetere i passaggi 2.7.2 al 2.7.3 per l&#39;eluente uscita dalla linea dalla T-pezzo che deve essere collegato alla porta periferiche. </li><li> Determinare la percentuale di flusso (ml min -1) da ciascuna linea di flusso secondo le seguenti equazioni: 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Regolare il rapporto di flusso al 40%: 60% (± 2%) (la linea da iniettore a porta centrale: la linea di T-pezzo porta periferica). Se la linea dall&#39;iniettore alla percentuale flusso porto centrale è superiore al 40%, aumenta la caduta di pressione diminuendo il diametro interno del tubo, o aumentando la sua lunghezza. Se la linea dall&#39;iniettore alla percentuale flusso porta centrale è inferiore al 40%, aumentare il diametro interno del tubo o diminuire la lunghezza del tubo. </li><li> Una volta che i rapporti di flusso sono sintonizzati girare la pompa a flusso fuori. </li><li> Collegare la linea dall&#39;iniettore alla porta centrale del ingresso della colonna e la linea dal pezzo a T alla porta periferica del ingresso della colonna. </li><li> Lentamente rampa la portata di 1,0 ml min -1 a 100% linea B. </li><li> Equilibrare la colonna (4,6 mm Lunghezza id x 100 mm), consentendo100% di metanolo (linea B) fase mobile di fluire attraverso la colonna a 1,0 ml min -1 per 10 min. Questo tempo è scalato in base alle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li><li> Per la messa a punto della presa CF passare al punto 4. &#39;Ottimizzazione del flusso in uscita CF&#39;. </li></ol></li></ol> Setup 3. Sistema Dual Pump <ol><li> Collegare la pompa del sistema HPLC all&#39;iniettore e quindi collegare la linea dall&#39;iniettore alla porta di entrata centrale della colonna. </li><li> Collegare la pompa aggiuntiva direttamente alla porta periferica all&#39;ingresso della colonna. Si noti che questa seconda pompa by-passa l&#39;iniettore. </li><li> Rampa la portata della pompa dell&#39;impianto collegato alla porta centrale per 0,4 ml min -1 (rappresentante il 40% della portata totale di 1,0 ml min -1) al 100% di metanolo (linea B). </li><li> Allo stesso tempo, come Fase 3.3, rampa la portata della pompa periferica 0,6 ml min -1 (rappresentante il 60% della portata totale1,0 ml min -1) al 100% di metanolo (linea B). </li><li> Equilibrare la colonna (4.6 mm Lunghezza id x 100 mm), consentendo 100% metanolo (linea B) fase mobile a fluire attraverso la colonna a 1,0 ml min -1 per 10 min. Questo tempo è scalato in base alle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li><li> Per la messa a punto della presa CF passare al punto 4. &#39;Ottimizzazione del flusso in uscita CF&#39;. </li></ol> 4. Ottimizzazione di CF Mandata <ol><li> Collegare la porta di uscita centrale per il rivelatore UV-Vis con un pezzo a 15 cm da 0,13 millimetri tubi id. </li><li> Collegare un pezzo 15 cm da 0,13 millimetri tubo id alla porta di uscita periferica della colonna CF. </li><li> Pesare la massa di due navi insieme vuoto sulla bilancia analitica ed etichettare una nave centrale e l&#39;altra periferica. </li><li> Per 1,0 min, raccogliere la fase mobile in uscita dal rivelatore (flusso centrale) UV-Vis nell&#39;etichetta recipiente di raccolta centrale, la cui massa è stata misurata in 4.2. </li><li> Pesare nuovamente il serbatoio di raccolta contenente l&#39;eluente raccolta sulla bilancia analitica e determinare la massa di fase mobile raccolti. </li><li> Ripetere i punti 4.4 a 4.5 per l&#39;eluente uscita dalla linea dalla porta di uscita periferica. </li><li> Determinare la percentuale di flusso da ciascuna linea di flusso secondo le seguenti equazioni: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53471/53471eq2.jpg" /></li><li> Regolare il rapporto portata al 21%: 79% (± 2%) (flusso di uscita centrale da UV-Vis: flusso di uscita periferica dalla linea). Se la percentuale di flusso centrale dal UV-Vis è superiore a 21%, aumenta la caduta di pressione diminuendo il diametro interno del tubo collegato al l&#39;uscita del rivelatore UV-Vis, o aumentando la sua lunghezza. Se la percentuale di flusso centrale dal UV-Vis è inferiore a 21%, aumentare il diametro interno del tubo collegato al l&#39;uscita del rivelatore UV-Vis, o diminuire la lunghezza del tubo. Ogni volta che la lunghezza del tubo è stata modificata, ripeterepassi 4,3-4,7. Nota: La colonna CF in modalità id &#39;virtuale&#39; 2,1 millimetri è pronto per l&#39;analisi. </li></ol>

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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific.

Questo studio ha coinvolto l&#39;analisi interlaboratorio di CF colonne cromatografiche per verificare la prestazione analitica in termini di efficienza e sensibilità. La colonna CF è stato istituito con un doppio sistema di pompaggio, come descritto nella sezione &#39;3. due pompe impostato &#39;per ottenere un rapporto di flusso di 40:60 (centro: periferica) in ingresso della colonna CF. Il 40:60 (centro: periferica) Rapporto flusso è stato ottenuto impostando la portata di ogni pompa al valore che rappresenta il 4...

Negli ultimi anni la tecnologia colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è progredita notevolmente; capacità di picco sono aumentate considerevolmente soprattutto grazie all&#39;impiego di dimensioni delle particelle più piccole e le particelle core shell più efficienti. Poiché separazioni sono generalmente più efficienti, un flusso-on effetto è stato un aumento della sensibilità poiché picchi sono ora nitide e quindi più alto 1-8. Tuttavia, bed radiale eterogeneità è ancora un fattore limitante nella esecuzione di tutte le colonne, ma questa non è una nuova storia dal cromatografi sanno da molti anni. Letti colonna sono eterogenei sia nella direzione radiale 9-12, e lungo la colonna sull&#39;asse 10,12-15. Il muro-effetto in particolare è un importante contributo alla perdita di prestazioni 7,16-18 separazione. Shalliker e Ritchie 7 Recensioni recenti su aspetti di base della colonna eterogeneità e quindi questo non devono essere discussed qui ulteriormente. Anche se Basti dire, che la variazione nella colonna densità di imballaggio letto e gli effetti di parete portano ad una distorsione della spina soluto, in modo tale che le bande eluiscano attraverso la colonna di spine che somigliano parzialmente riempito zuppa di bocce invece di sottili dischi pieni piatto 7 che sono di solito raffigurato nei testi di insegnamento di base. Quando gli esperimenti sono stati effettuati in modo tale che la migrazione soluto attraverso il letto potrebbe essere visualizzato i profili dei plug all&#39;interno della colonna erano in parte cava e la sezione tailing della band è in gran parte la componente parete della spina campione. Il risultato finale è che ci vogliono molti più piatti di separare questi tappi &#39;parzialmente vuoti&#39; di quanto sarebbe richiesto se i dischi erano solide e piatte 12,14,17. Per superare la band ampliando le questioni connesse con effetti a muro e la variazione di densità di imballaggio radiale, una nuova forma di tecnologia colonna nota come tecnologia di flusso attivo (AFT) è stato progettato 7,19. Lo scopo di questo progetto eraper eliminare effetti di parete attraverso la separazione fisica di eluizione del solvente lungo la regione di parete, da quella della fase mobile eluendo nella regione centrale radiale della colonna 19. Ci sono due tipi principali di colonne AFT; Parallel segmentato flusso (FPF) colonne e cortina di flusso (CF) colonne 7. Dal momento che questo protocollo è volto a l&#39;uso e l&#39;ottimizzazione delle colonne CF, colonne PSF non saranno ulteriormente discussi. Tenda di flusso (CF) Tenda flusso (CF) formati di colonna utilizzano finali raccordi AFT sia a ingresso e l&#39;uscita della colonna. AFT finali raccordi sono costituiti da un fritta anulare situato all&#39;interno di un raccordo multiporta. La fritta è composto da tre parti: una porzione centrale radiale porosa che è allineato con la porta centrale della fine raccordo, una porzione esterna porosa che è allineata con la porta periferica (s) del raccordo terminale, e un anello impermeabile che separa le due porzioni porose impedendo qualsiasi croceFUORI-USCITA tra le regioni centrali radiali ed esterne della fritta 19. La Figura 1 illustra il disegno della fritta AFT e la figura 2 illustra il formato di colonna CF. In questa modalità di funzionamento (CF) il campione viene iniettato nel porto centrale radiale del raccordo di ingresso, mentre la fase mobile aggiuntiva viene introdotto attraverso la porta periferica di entrata al &#39;tenda&#39; la migrazione dei soluti attraverso la regione centrale radiale colonna. Quindi il campione entra nel letto nella regione centrale radiale della colonna con la regione esterna della colonna con fase mobile fecero che attraversarla. Studi hanno dimostrato che un rapporto volumetrico portata di circa 40:60 (centrale: porta periferica) di entrata fine-montaggio di una colonna 4,6 millimetri di diametro interno (ID) è 6,7,16 ottimale. L&#39;uscita AFT della colonna CF permette la regolazione del flusso centrale e periferica al loro porzione relativa e può essere variata a quasi qualsiasi rati desideratoo attraverso la gestione della pressione. L&#39;ottimizzazione di una colonna CF può migliorare significativamente diversi aspetti funzionali della tecnologia delle colonne, come l&#39;efficienza di separazione o la sensibilità di rilevazione. In questo modo si stabilisce un &#39;muro-less&#39;, &#39;infinita di diametro&#39; o colonna &#39;virtuale&#39; 6,10,18,20. Lo scopo di colonne CF è quello di gestire attivamente la migrazione del campione attraverso la colonna per evitare che il campione di raggiungere la regione di parete. Pertanto, la concentrazione del soluto all&#39;uscita al rivelatore è ingrandita, aumentando la sensibilità di circa 2,5 volte maggiore rispetto al formato colonna convenzionale utilizzando ultravioletta (UV) di rilevamento 16, e ancora maggiore quando si utilizza la massa di rilevamento 6 spettrale. colonne CF sono ideali per i campioni a bassa concentrazione, dal momento che la sensibilità di rilevazione è aumentata. Inoltre, sono ideali quando accoppiato alla portata rivelatori limitate, come lo spettrometro di massa (MS) 6. un AColonna FT in un formato id 4,6 millimetri, per esempio può essere sintonizzata per fornire lo stesso volume di solvente ad un rivelatore come colonna formato id norma 2.1 mm se azionati alla stessa velocità lineare, regolando uscendo flusso centrale al 21%. Allo stesso modo la colonna AFT potrebbe anche essere sintonizzato per fornire lo stesso carico di volume ad un rivelatore come colonna id 3,0 mm, con regolando uscendo flusso centrale 43%. In realtà qualsiasi formato colonna &#39;virtuale&#39; potrebbe essere prodotta per soddisfare l&#39;esigenza analitica 6,18,22. Utilizzando questi terminali raccordi appositamente progettati in entrata e l&#39;uscita assicura che un vero colonna parete inferiore è stabilito. Ci sono due modi per configurare il sistema di erogazione del solvente alle porte centrali e periferiche di ingresso:. Sistema split-flusso 6 e due 6,7 sistema a pompa di figura 3 illustra ognuno di questi sistemi CF set up. Sistema split-flow iona split system-flow (Figura 3A) la portata della pompa che porta all&#39;iniettore è diviso pre-iniezione utilizzando un morto nullo T-piece volumi, dove un flusso flusso della fase mobile è collegata all&#39;iniettore, che viene poi collegata al porto centrale della bocca di fine-montaggio della colonna. La seconda corrente di flusso della fase mobile by-passa l&#39;iniettore ed è collegato alla porta periferica sul all&#39;ingresso della colonna. Durante il frazionamento del flusso, la percentuale corrente di flusso viene regolato a 40:60 (centro: periferica) prima che le linee sono collegate alla colonna, cioè, da iniettore a centrare e pompa di periferiche. Sistema a due pompe La colonna CF richiede due correnti di flusso alla entrata fine montaggio della colonna. A seconda del tipo di autocampionatore / dell&#39;iniettore dello strumento HPLC, a flusso separato istituire potrebbe non essere possibile, e così CF può quindi essere raggiunto attraverso 2 pompe (Figura 3B 21). Ogni pompa è allocata e collegata sia alla porta centrale o periferico e la portata viene impostato a rappresentare il 40% del flusso per la porta centrale e il 60% per la porta periferica. Ad esempio, se la portata totale è 1,0 ml min -1, la portata della pompa centrale è impostata a 0,4 ml min -1 e la pompa periferico è impostato a 0,6 ml min -1. La scelta di quale modalità di funzionamento dipende in larga misura la strumentazione HPLC e modalità cromatografica di funzionamento. Ad esempio, in alcuni autocampionatore una variazione della pressione tra la posizione di carico del campione e il campione iniettare posizione può verificarsi interrompendo il rapporto di divisione del flusso e quindi in questo caso una doppia pompa istituito sarebbe consigliato per prestazioni ottimali CF. Indipendentemente dal sistema di erogazione del solvente configurazione scelta per l&#39;ingresso della colonna CF, l&#39;ottimizzazione presa CF rimane la stessa. Il porto centrale all&#39;uscita della colonna CF è collegata al rivelatore ultravioletto-visibile (UV-Vis) con il smaltimore di volume possibile di tubo per minimizzare gli effetti di post-colonna volume morto. Poiché, colonne CF emulano colonne diametro ridotto, volume morto tra l&#39;uscita della colonna ed il rivelatore è dannosa per le prestazioni di separazione della colonna CF. È fondamentale per garantire la più piccola quantità di volume del tubo tra il porto centrale e il rivelatore UV-Vis per minimizzare gli effetti di volume morto come banda allargamento, perdita di efficienza e sensibilità. Quindi, è consigliato l&#39;uso di stretta tubo di diametro (0,1 mm di diametro) per consentire facilmente le regolazioni di pressione senza aggiungere volume morto inadeguato. Il tubo è anche collegato alla porta periferiche e diretto da perdere. Dopo l&#39;uscita della colonna CF, il rapporto di segmentazione può essere regolato a qualsiasi rapporto che si adatta allo scopo dell&#39;analista. Quando si utilizza un CF id 4,6 millimetri, per esempio, è spesso conveniente per impostare il rapporto sia come 43:57 o 21:79 (al centro: periferica) per emulare una colonna id &#39;virtuale&#39; 3,0 millimetri o colonna id 2,1 millimetri,rispettosamente. In questo modo le prestazioni di separazione è facilmente panca-marcato. Il rapporto di segmentazione viene misurata pesando la quantità di portata in uscita dal rivelatore collegato alla porta centrale e portata in uscita la porta periferica per un periodo di tempo. Il flusso percentuale attraverso ciascuna porta può quindi essere determinata e il rapporto può essere regolata modificando la lunghezza del tubo collegato o usando tubo che ha un diametro interno diverso (id). i dettagli Questo protocollo video le procedure di funzionamento e l&#39;ottimizzazione di una colonna CF per prestazioni cromatografiche.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump</td><td></td><td></td><td>Required if 2 pump CF system set up is to be used.</td></tr><tr><td>Curtain Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr><tr><td>T-piece</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

curtain flow column: optimization of efficiency and sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Colonne AFT sono stati sviluppati usando un disegno fritta specializzata (Figura 1) nella colonna multiporta finali raccordi per superare il letto eterogeneità colonna e migliorare le prestazioni di separazione. Uno studio interlaboratorio sul rendimento di separazione di colonne cromatografiche CF (Figura 2) è stata effettuata con un sistema a doppia pompa costituito (figura 3B), come descritto nella sezione 3 di questo protocollo <su...

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Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Tenda Colonna flusso: ottimizzazione dell&#39;efficienza e della sensibilità

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

curtain-flow-column-optimization-of-efficiency-and-sensitivity

Research

JoVE Journal

Chemistry

6.5K Views.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance. 

Video: Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Ricerca

Bioingegneria

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Chimica

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

Un modulare tecnologia microfluidica per studi sistematici di nanocristalli semiconduttori colloidali

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

Ingegneria

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

Semplice produzione interna di colonne capillari ad altissime prestazioni con l'approccio FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Biochimica

Design and Optimization Strategies of a High-Performance Vented Box

This study aims to solve the problems of air flow chaos and poor performance in a vented box caused by the heterogeneous distribution of airflow through the design of the internal structure of the vented box with constant energy consumption. The final goal is to evenly distribute the airflow inside the vented box. Sensitivity analysis was performed for three structural parameters: the number of pipes, the number of holes in the middle pipe, and the number of each increment from the inside to the outside pipe. A total of 16 random array sets of three structural parameters with four levels were determined using the orthogonal experimental design. Commercial software was used for the construction of a 3D model for the selected experimental points, and this data was used to obtain the airflow velocities, which were then used to obtain the standard deviation of each experimental point. According to the range analysis, the combination of the three structural parameters was optimized. In other words, an efficient and economical optimization method considering the performance of the vented box was established, and it could be widely used to extend the storage time of fresh food.

Here, we present the range analysis method to optimize the sample points generated by an orthogonal experimental design to ensure that fresh food can be stored in a vented box for a long time by regulating the airflow pattern.

Progettazione e strategie di ottimizzazione di una scatola ventilata ad alte prestazioni

This study aims to solve the problems of air flow chaos and poor performance in a vented box caused by the heterogeneous distribution of airflow through ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

Automated interazione idrofobica colonna di selezione cromatografia per l&#39;utilizzo in purificazione di proteine

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Biologia

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are essential for predicting responses to climate change. This work describes two high-throughput protocols for measuring insect thermal limits: one for assessing critical thermal minima (CTmin), and the other for assessing heat knock down time (KDT) in response to a static heat stressor. In the CTmin assay, individuals are placed in an acrylic-jacketed column, subjected to a decreasing temperature ramp, and counted as they fall from their perches using an infrared sensor. In the heat KDT assay, individuals are contained in a 96 well plate, placed in an incubator set to a stressful, hot temperature, and video recorded to determine the time at which they can no longer remain upright and move. These protocols offer advantages over commonly used techniques. Both assays are low cost and can be completed relatively quickly (~2 h). The CTmin assay reduces experimenter error and can measure a large number of individuals at once. The heat KDT protocol generates a video record of each assay and thus removes experimenter bias and the need to continuously monitor individuals in real time.

Thermal limits can predict the environments organisms tolerate, which is valuable information in the face of rapid climate change. Described here are high-throughput protocols to assess critical thermal minima and heat knockdown time in insects. Both protocols maximize the throughput and minimize the cost of the assays.

Analisi ad alta velocità di produzione dei limiti termici critici negli insetti

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

Cross Cylindrical Flow: Measuring Pressure Distribution and Estimating Drag Coefficients

Source: David Guo, College of Engineering, Technology, and Aeronautics (CETA), Southern New Hampshire University (SNHU), Manchester, New Hampshire
The pressure distributions and drag estimations for cross cylindrical flow have been investigated for centuries. By ideal inviscid potential flow theory, the pressure distribution around a cylinder is vertically symmetric. The pressure distribution upstream and downstream of the cylinder is also symmetric, which results in a zero-net drag force. However, experimental results yield very different flow patterns, pressure distributions and drag coefficients. This is because the ideal inviscid potential theory assumes irrotational flow, meaning viscosity is not considered or taken into account when determining the flow pattern. This differs significantly from reality.
In this demonstration, a wind tunnel is utilized to generate a specified airspeed, and a cylinder with 24 ports of pressure is used to collect pressure distribution data. This demonstration illustrates how the pressure of a real fluid flowing around a circular cylinder differs from predicted results based on the potential flow of an idealized fluid. The drag coefficient will also be estimated and compared to the predicted value.

Cross Cylindrical Flow: Pressure Distribution &amp; Drag Coefficients

Flusso cilindrico incrociato: misurazione della distribuzione della pressione e stima dei coefficienti di resistenza

Source: David Guo, College of Engineering, Technology, and Aeronautics (CETA), Southern New Hampshire University (SNHU), Manchester, New Hampshire
The ...

Didattica

JoVE Science Education

Ingegneria aeronautica

Efficiency of Liquid-liquid Extraction

Source: <a href="https://www.jove.com/author/Kerry+M._Dooley">Kerry M. Dooley</a> and Michael G. Benton, Department of Chemical Engineering, Louisiana State University, Baton Rouge, LA
Liquid-liquid extraction (LLE) is a separation technique used instead of distillation when either: (a) the relative volatilities of the compounds to be separated are very similar; (b) one or more of the mixture components are temperature sensitive even near ambient conditions; (c) the distillation would require a very low pressure or a very high distillate/feed ratio.1The driving force for mass transfer is the difference in solubility of one material (the solute) in two other immiscible or partially miscible streams (the feed and the solvent). The feed and solvent streams are mixed and then separated, allowing the solute to transfer from the feed to the solvent. Normally, this process is repeated in successive stages using counter-current flow. The solute-rich solvent is called the extract as it leaves, and the solute-depleted feed is the raffinate. When there is a reasonable density difference between the feed and solvent streams, extraction can be accomplished using a vertical column, although in other cases a series of mixing and settling tanks may be used.
In this experiment, the operational goal is to extract isopropanol (IPA, ~10 - 15 wt. %, the solute) from a mixture of C8-to-C10 hydrocarbons using pure water as solvent. A York-Scheibel type (vertical mixers and coalescers, one each per physical stage) extraction column is available. Like most extractors, the overall efficiency (number theoretical stages/physical stages) of this column is quite low, especially in comparison to many distillation columns. The low efficiencies arise from both slow mass transfer (two liquid resistances instead of one as in distillation) and often also from maldistribution of the phases. The effect of agitator speed on both the solute recovery in the extract and the overall column efficiency will be evaluated.

Liquid-liquid Extraction and York-Scheibel Column Operation

Efficienza di estrazione liquido-liquido

Source: Kerry M. Dooley and Michael G. Benton, Department of Chemical Engineering, Louisiana State University, Baton Rouge, LA
Liquid-liquid extraction ...

Tenda Colonna flusso: ottimizzazione dell'efficienza e della sensibilità

Riepilogo

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