One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

주의 : (메탄올에 대한, 즉 MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 장비의 공학적 통제의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 사용을 보장합니다. 참고 :이 프로토콜은 UV-마주 검출기와 결합 된 HPLC 시스템에 CF 열을 사용하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 프로토콜은 독자를 가정하는 크로마토 그래피의 기본 지식과 경험을 가지고 작성되었습니다. HPLC 기기의 1. 설치 참고 : 용매의 선택, 검출기 파장이 섹션 즉 애널리스트의 요구를 맞게 변경 될 수 유량이관심있는 샘플에 적합하다. <ol><li> 이동상으로 라인 B의 라인 A에 대한 100 % 초순수와 HPLC 기기 (예를 들면, 밀리 Q 물) 100 % 메탄올을 준비하고 제조업체의 요구 사항에 따라 펌프를 제거. </li><li> 254 nm의 자외선 마주 검출기를 설정합니다. </li><li> 설정의 사전 주입 유량 분할 모드, 또는 듀얼 펌프 유량 설정 중 하나를 선택합니다. 분할 흐름 모드의 3 단계로 진행 듀얼 펌프 모드, 2 단계로 진행합니다. </li></ol> 2. 분할 흐름 시스템 설치 <ol><li> 자동 샘플러의 분사 밸브에서 펌프 라인을 분리합니다. </li><li> 펌프 라인에 T-조각을 연결합니다. </li><li> T 개의 조각의 각 포트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 조각을 연결합니다. </li><li> 자동 샘플러의 밸브를 분사기하기 위해 T-조각에서 하나의 튜브를 연결합니다. </li><li> 1.0 ml의 분에 펌프를 설정 -1. </li><li> 40 % CF 상기 컬럼의 유입구 조정 흐름의 분할 비율 펌프 라인을 연결하기 전에 6<html> 0 % (중심선 : 주변 라인)와 같은 단계 2.7에 따른다. </li><li> 스플릿 - 유동 시스템에 CF 도입 비율 조정 <ol><li> 분석 저울을 사용하여 두 개의 빈 수집 용기의 질량을 측정 한 컬렉션 중앙 용기 (주변 포트에 T-부분에서 라인 포트 하나를 중앙에 자동 샘플러에서 라인 하나) 주변 다른 하나의 레이블 . </li><li> 1.0 분, 그 질량 2.7.1 측정 하였다 수집 용기로 (컬럼에 연결되는 지점에서) 인젝터에서 나오는 줄에서 종료 이동상를 수집합니다. </li><li> 분석 규모의 회수 조를 다시 무게 수집 이동상의 질량을 결정한다. </li><li> 반복 주변 포트에 연결되는 T-부분에서 라인을 종료 용리액을 위해 2.7.3에 2.7.2 단계를 반복합니다. </li><li> 흐름의 비율을 결정 (ML 분 -1) 이하의 식에 따라 흐름의 각 행에서 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> 40 % 유량비 조정 : 60 % (± 2 %) (중앙 포트 분사 장치에서 행 : 주변 포트 T 피스의 선). 중앙 포트 유동 비율로 인젝터로부터 라인이 40 % 이상이면, 튜브의 내경이 감소 또는 그 길이를 증가시킴으로써 압력 강하를 증가시킨다. 중앙 포트 유동 비율로 인젝터로부터 라인이 40 % 미만이면, 튜브의 내부 직경을 증가 시키거나 튜브의 길이를 감소시킨다. </li><li> 유동 비율이 조정되면 펌프가 꺼져 흐름십시오. </li><li> 컬럼 입구의 중앙 포트와 컬럼 입구의 주변 포트에 T-조각의 라인에 인젝터에서 선을 연결합니다. </li><li> 1.0 mL를 천천히 분당 유량 -1 100 % 광고 B.에서 진입로 </li><li> 시킴으로써 컬럼 (4.6 mm ID × 100 mm 길이) 평형화100 % 메탄올 (선 B)의 이동상은 1.0 ml를 분으로 컬럼을 통과하는 -1을 10 분 동안. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 조정됩니다. </li><li> CF 콘센트의 튜닝을 위해 4 &#39;CF 출구 흐름의 조정을&#39;단계로 이동합니다. </li></ol></li></ol> 3. 듀얼 펌프 시스템 설치 <ol><li> 인젝터에 HPLC 시스템 펌프를 연결 한 후 컬럼의 중앙 입구 포트에 분사에서 선을 연결합니다. </li><li> 컬럼의 입구 주변 포트에 직접 추가 펌프를 연결합니다. 이 제 2 펌프 인젝터를하여이-전달합니다. </li><li> 0.4 ml의 분 -1을 100 % 메탄올 (라인 B)에서 (1.0 ml를 분 -1의 총 유량의 40 %를 나타낸다)로 중앙 포트에 연결된 시스템의 펌프의 유량을 램프. </li><li> 단계 3.3과 동시에, 총 유량의 60 % 용액의 0.6 분 -1 (담당자 주연 펌프의 유량을 램프1.0 ml의 분 -1) 100 % 메탄올 (라인 B)에서. </li><li> 1.0 ml를 분으로 컬럼을 통과 -1을 10 분 동안 100 % 메탄올 (라인 B) 이동상시킴으로써 컬럼 (4.6 mm ID × 100 mm 길이) 평형화. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 조정됩니다. </li><li> CF 콘센트의 튜닝을 위해 4 &#39;CF 출구 흐름의 조정을&#39;단계로 이동합니다. </li></ol> CF 아울렛 흐름 4. 조정 <ol><li> 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 조각을 사용하여 UV-마주 검출기에 중앙 출구 포트를 연결합니다. </li><li> CF 컬럼의 주변 출구 포트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 조각을 연결합니다. </li><li> 분석 균형에 두 개의 빈 수집 용기의 질량을 달아 하나의 용기 중앙과 다른 주변 레이블을 붙입니다. </li><li> 1.0 분, 질량 4.2 측정 하였다 중앙 수집 용기 라벨에 UV-마주 검출기 (중앙 흐름)에서 ​​종료 이동상를 수집합니다. </li><li> 분석 규모 수집 된 용출액을 함유하는 수집 용기를 다시 무게 수집 이동상의 질량을 결정한다. </li><li> 반복 4.4 주변 출구에서 줄을 종료 용리액 4.5 단계를. </li><li> 다음 식에있어서의 흐름의 각 라인에서의 흐름 비율을 결정 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53471/53471eq2.jpg" /></li><li> 자외선 비스에서 중앙 유량 비율이 21 % 이상이면, 압력 손실을 증가시킨다. : 79 % (± 2 %) (라인에서 주연 출구 유동 UV-비스로부터 중앙 배출구 흐름 ​​:) 21 %로 유량비를 조정 자외선 비스 검출기의 출구에 부착 된 튜브의 내부 직경을 감소시킴으로써, 또는 그 길이를 증가시킨다. 자외선 비스에서 중앙 유량 비율이 21 % 미만인 경우, UV-비스 검출기의 출구에 부착 된 튜브의 내부 직경을 증가 시키거나 튜브의 길이를 감소시킨다. 튜브의 길이가 변경 될 때마다, 반복4.7-4.3 단계를 반복합니다. 참고 : &#39;가상&#39;2.1 mm 아이디 모드에서의 CF 열 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific.

본 연구는 효율 및 감도의 측면에서 분석 성능을 테스트하기 위해 CF 크로마토 그래피 컬럼 간 실험실 분석을 포함했다. 3 &#39;섹션에 설명 된대로 CF 열은 이중 펌핑 시스템으로 설정했다. (: 주변 센터)가 CF 컬럼의 입구에 이중 펌프 시스템은 40:60의 흐름 비율을 달성하기 위해 &#39;설정합니다. 40:60 (중앙 말초) 유량의 비율은 각각 40 % 및 총 유량의 60 %를 나타내는 값으로, 각 펌프의 유량을 설정하?...

최근에는 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 컬럼을위한 기술이 크게 발전하고있다; 최대 용량은 주로 작은 입자 크기를 사용하고,보다 효율적으로 코어 쉘 입자 상당히 확실히 증가하고있다. 분리는 일반적으로 더 효율적이기 때문에 피크가 지금 선명하고 1-8 따라서 키가 있기 때문에, 플로우에 대한 효과는 감도가 증가하고있다. 그럼에도 불구하고, 방사 층 얼룩이 모든 컬럼의 성능에 제한 요소가 여전히 있지만, 이것은 크로마토 그래피 수년이 알려진 이후 새로운 스토리 아니다. 열 침대 반경 방향 9-12 모두에서 이질적이며, 10,12-15 축 열을 따라. 벽 효과, 특히 분리 성능 7,16-18 손실에 중요한 공헌자이다. Shalliker와 리치 7 최근에 열 침대 이질성의 측면을 검토하고, 따라서이 discusse 할 필요는 없다D 여기에 추가. 충분할 말하고 있지만, 열 베드 패킹 밀도의 변동과 벽 효과 밴드 부분적 스프 충전과 유사한 플러그의 컬럼을 통해 용출되도록 용질 플러그의 왜곡을 초래할 오히려있는 얇은 평평한 고체 디스크 7보다 그릇 일반적으로 기본 교육 텍스트에 묘사. 실험 베드를 통하여 용질 이동이 가시화 될 수 있도록 수행 될 때 열 내부 플러그 프로필 부분적 중공이었고 밴드의 테일링 부는 주로 샘플 플러그의 벽 컴포넌트이다. 최종 결과는 디스크가 고체 12,14,17 평면 인 경우 요구되는 것보다 이들 &#39;부분적으로 중공&#39;플러그를 분리하는 많은 판을 소요한다는 것이다. 벽 효과 반경 패킹 밀도의 변화와 관련된 문제를 확대 대역을 극복하기 위해, 액티브 플로우 기술 (AFT)라는 열 기술의 새로운 형태가 7,19 설계 하였다. 이러한 설계의 목적이었다컬럼 (19)의 방사상 중심 영역에 용출 이동상과는 벽 영역을 따라 용출 용매의 물리적 분리 벽을 통해 효과를 제거한다. AFT 열 두 가지 유형이있다; 병렬 분단 흐름 (PSF) 열 및 커튼 흐름 (CF) 열 일곱. 이 프로토콜은 CF 컬럼의 최적화를 대상으로하기 때문에, PSF 열은 더 이상 설명되지 않을 것이다. 커튼 흐름 (CF) 커튼 흐름 (CF)가 열 형식 입구 및 컬럼의 출구 모두에서 AFT 엔드 피팅 이용한다. AFT 최종 피팅은 멀티 피팅 내부에있는 환상 프릿으로 구성되어 있습니다. 프릿은 세 부분으로 구성된다 : 부속 단부의 중앙 포트 피팅 단부의 주연 포트 (들)과 정렬되는 다공성 외측 부분, 및 배리어 링과 정렬 다공성 방사상 중앙부 그 어떤 단면을 막는 다공질 두 부분을 분리. 상기 유리 재 (19)의 반경 방향의 중앙과 외측부 사이 -flow 하나는 AFT 프릿의 설계를 도시한다도 2는 CF 칼럼 포맷을 나타낸다. 추가 이동상의 방사상 중심 영역을 통해 용질의 이동 &#39;커튼&#39;의 입구의 주변 포트를 통해 유입되는 동안 동작 모드 (CF)의 샘플은 피팅의 입구의 직경 중심 포트에 주입 기둥. 그러므로 시료는 그것을 통과 이동상을 갖는 컬럼의 외측 영역과 열 방사상 중심 영역에 침대 들어간다. (말초 포트 중앙)을 4.6 mm 내부 직경 (ID) 칼럼의 최종 피팅 입구 최적 6,7,16 인 연구는 약 40:60의 용적 유량비는 것을 보여 주었다. CF 열의 AFT 출구 상대 부 중앙과 주변 유동의 조정이 가능하고 거의 모든 소정 rati로 변화 될 수있다압력 관리를 통해 오. CF 컬럼의 최적화 등이 크게 분리 효율이나 검출 감도 열 기술의 다양한 기능적 측면을 개선 할 수있다. 이러한 방식으로는 &#39;벽없는&#39;, &#39;무한 직경&#39;또는 &#39;가상&#39;열은 6,10,18,20를 설립한다. CF 열 목적 적극적 벽 영역에 도달하는 샘플을 방지하기 위해 칼럼을 통해 샘플의 이동을 관리하는 것이다. 따라서, 검출기 종료시의 용질 농도는 자외선 (UV) 검출부 (16)를 사용하는 경우에도 질량 스펙트럼 검출 6을 이용하여 더 큰 경우, 종래의 열 형식보다 약 2.5 배 이상의 감도 증가를 극대화한다. 검출 감도가 향상되므로 CF 컬럼은 이상적으로 낮은 농도의 시료에 적합하다. 이러한 질량 분석기 (MS) (6)과 같은 속도 제한 검출기를 흐르게하도록 결합 될 때, 또한 그들은 이상적이다. 하는 A예를 들어, 4.6 mm 자료 형식 FT 칼럼은 21 %의 중심 흐름을 종료 조정함으로써, 동일한 선 속도로 작동 할 경우 표준 2.1 mm ID 포맷 열로 검출기에 용매를 동일한 볼륨을 제공하도록 조정될 수있다. 마찬가지로 AFT 칼럼은 43 %의 중심 흐름을 종료 조정함으로써 3.0 mm ID 항목으로서 검출기 동일한 용적 부하를 제공하도록 튜닝 될 수있다. 실제로 임의의 &quot;가상 &#39;열 형식 분석 6,18,22 요구에 맞게 제조 될 수있다. 입구에서이 특별히 디자인 된 최종 피팅을 사용하고, 출구는 진정한 벽없는 열이 설립되는 것을 보장한다. 입구의 중추 및 말초 포트 용매 전달 시스템 설정하는 방법은 두 가지가 있습니다. 분할 흐름 시스템 (6)와 두 개의 펌프 시스템의 6,7 3이 CF 시스템 세트 업의 각을 보여줍니다. 분할 유동 시스템 나는NA 분할 유동 시스템 (도 3a) 인젝터로 이어지는 펌프 유량은 이동상 이상의 유동 스트림은 다음에 접속하는 인젝터에 연결된 제로 데드 볼륨 T 피스를 이용하여 분할 전 인젝터이고 컬럼의 입구 단부 피팅 중앙 포트. 이동상의 제 2 유동 스트림 인젝터 작성자는-통과하여 컬럼 입구의 주변 포트에 연결된다. 중앙과 주변에 펌프 분사기로부터 라인 컬럼에 접속되기 전에, 즉 : 흐름의 분할 중에 유동 흐름 비율은 40:60 (주연 센터)로 조정된다. 두 펌프 시스템 CF 컬럼은 컬럼의 입구 단부 피팅 두 유동 스트림을 필요로한다. 설정된 HPLC 기기, 분할 흐름 오토 샘플러 / 인젝터의 종류에 따라 불가능할 수있다, 따라서 CF는 2 펌프 (도 21 (b))를 통해 달성 될 수있다. 각 펌프는 할당 중앙 또는 주변 장치 포트 및 유량 중앙 포트의 유량의 40 % 및 주변 포트에 대해 60 %를 나타 내기 위해 설정된 어느 하나에 접속된다. 총 유량은 1.0 ml의 분 -1 인 경우, 예를 들어, 중앙 펌프 유속을 0.4 mL의 분 -1로 설정하고, 주변 펌프는 0.6 ml의 분 -1로 설정된다. 동작 모드의 선택은 HPLC 계측 및 동작 모드 크로마토 그래피에 크게 의존한다. 샘플 부하 위치와 샘플 사이의 압력의 변화 위치가 분할 유량비를 방해가 발생할 수 있으므로,이 경우에 설정 이중 펌프 최적 CF 성능을 위해 권장된다 주입 일부 자동 시료 주입기, 예를 들어. 상관없이 CF 컬럼의 입구에 대해 선택된 설정 용매 전달 시스템은 CF 출구 최적화는 동일하게 남아있다. CF 컬럼의 출구 중앙 포트는에 작은을 가진 자외선 - 가시 (UV-비스) 검출기에 부착튜브의 가능한 볼륨 않도록 후 열 죽은 볼륨의 영향을 최소화합니다. , CF 열이 좁은 구멍 열을 에뮬레이트하기 때문에, 열 배출구와 상기 검출기 사이의 데드 볼륨은 CF 증류탑의 분리 성능에 불리하다. 중앙 포트 및 효율 및 감도 대역 넓혀 손실 데드 볼륨의 영향을 최소화 할 수있는 UV-비스 검출기 사이의 배관 용적의 작은 양을 보장하기 위해 중요하다. 따라서, 좁은 보어 튜빙 (0.1 mm의 ID)의 사용을 용이 부적절한 데드 볼륨을 첨가하지 않고, 압력 조정을 허용하도록 의뢰한다. 튜브는 주변 포트에 연결된 폐기물에 관한 것이다. CF 컬럼의 출구에, 분할 비율은 분석의 목적에 적합한 임의의 비율로 조절할 수있다. 4.6 mm 아이디 CF가 사용되는 경우, 예를 들면, 어느 43:57 또는 21:79 (중앙 말초)와 같은 비율로 설정하는 것이 편리한 &#39;가상&#39;3.0 mm ID 열 또는 2.1 mm ID 열 에뮬레이션을공손히. 그 방법은 분리 성능은 쉽게 벤치 마크입니다. 분할 비율은 상기 중앙 포트에 접속되고,주기 시간 동안 상기 주변 포트를 빠져 나가는 유동되는 검출기로부터 나오는 유량을 계량에 의해 측정된다. 각 포트를 통해 유동 비율은 측정 할 수 있고, 비율이 튜브 장착의 길이를 변경하거나, 다른 내부 직경 (ID)을 갖는 튜브를 사용하여 조정될 수있다. 이 비디오 프로토콜은 향상된 크로마토 그래피 성능을 위해 CF 칼럼의 운영 및 최적화 과정을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump</td><td></td><td></td><td>Required if 2 pump CF system set up is to be used.</td></tr><tr><td>Curtain Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr><tr><td>T-piece</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

curtain flow column: optimization of efficiency and sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

AFT 열은 열 상 이성을 극복하고 분리 성능을 향상시키기 위해 멀티 컬럼 엔드 피팅 전문 프릿 디자인 (도 1)를 사용하여 개발되었다. CF 크로마토 그래피 컬럼 (그림 2)의 분리 성능에 간 실험실 연구는이 프로토콜 (23)의 3 절에 설명 된대로 (그림 3B)를 설정 이중 펌프 시스템을 실시 하였다. 세 컴포넌트 테스트 혼합물은 CF 열의 ...

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Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

흐름 열 커튼 : 효율성과 감도의 최적화

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

6.5K 조회수.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance. 

비디오: Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

병렬 세그먼트 흐름 열 조정과 멀티 플렉스 감지 활성화

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

화학

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

콜 로이드 반도체 나노의 체계적인 연구를 위한 모듈형 미세 기술

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

공학

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

플래시팩 접근법을 통해 간단한 사내 초고성능 모세관 컬럼 제조

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

생화학

Design and Optimization Strategies of a High-Performance Vented Box

This study aims to solve the problems of air flow chaos and poor performance in a vented box caused by the heterogeneous distribution of airflow through the design of the internal structure of the vented box with constant energy consumption. The final goal is to evenly distribute the airflow inside the vented box. Sensitivity analysis was performed for three structural parameters: the number of pipes, the number of holes in the middle pipe, and the number of each increment from the inside to the outside pipe. A total of 16 random array sets of three structural parameters with four levels were determined using the orthogonal experimental design. Commercial software was used for the construction of a 3D model for the selected experimental points, and this data was used to obtain the airflow velocities, which were then used to obtain the standard deviation of each experimental point. According to the range analysis, the combination of the three structural parameters was optimized. In other words, an efficient and economical optimization method considering the performance of the vented box was established, and it could be widely used to extend the storage time of fresh food.

Here, we present the range analysis method to optimize the sample points generated by an orthogonal experimental design to ensure that fresh food can be stored in a vented box for a long time by regulating the airflow pattern.

This study aims to solve the problems of air flow chaos and poor performance in a vented box caused by the heterogeneous distribution of airflow through ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

생물학

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are essential for predicting responses to climate change. This work describes two high-throughput protocols for measuring insect thermal limits: one for assessing critical thermal minima (CTmin), and the other for assessing heat knock down time (KDT) in response to a static heat stressor. In the CTmin assay, individuals are placed in an acrylic-jacketed column, subjected to a decreasing temperature ramp, and counted as they fall from their perches using an infrared sensor. In the heat KDT assay, individuals are contained in a 96 well plate, placed in an incubator set to a stressful, hot temperature, and video recorded to determine the time at which they can no longer remain upright and move. These protocols offer advantages over commonly used techniques. Both assays are low cost and can be completed relatively quickly (~2 h). The CTmin assay reduces experimenter error and can measure a large number of individuals at once. The heat KDT protocol generates a video record of each assay and thus removes experimenter bias and the need to continuously monitor individuals in real time.

Thermal limits can predict the environments organisms tolerate, which is valuable information in the face of rapid climate change. Described here are high-throughput protocols to assess critical thermal minima and heat knockdown time in insects. Both protocols maximize the throughput and minimize the cost of the assays.

곤충의 중요한 열 한계에 대한 높은 처리량 해석

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

Cross Cylindrical Flow: Measuring Pressure Distribution and Estimating Drag Coefficients

Source: David Guo, College of Engineering, Technology, and Aeronautics (CETA), Southern New Hampshire University (SNHU), Manchester, New Hampshire
The pressure distributions and drag estimations for cross cylindrical flow have been investigated for centuries. By ideal inviscid potential flow theory, the pressure distribution around a cylinder is vertically symmetric. The pressure distribution upstream and downstream of the cylinder is also symmetric, which results in a zero-net drag force. However, experimental results yield very different flow patterns, pressure distributions and drag coefficients. This is because the ideal inviscid potential theory assumes irrotational flow, meaning viscosity is not considered or taken into account when determining the flow pattern. This differs significantly from reality.
In this demonstration, a wind tunnel is utilized to generate a specified airspeed, and a cylinder with 24 ports of pressure is used to collect pressure distribution data. This demonstration illustrates how the pressure of a real fluid flowing around a circular cylinder differs from predicted results based on the potential flow of an idealized fluid. The drag coefficient will also be estimated and compared to the predicted value.

Cross Cylindrical Flow: Pressure Distribution &amp; Drag Coefficients

교차 원통형 흐름: 압력 분포 측정 및 항력 계수 추정

Source: David Guo, College of Engineering, Technology, and Aeronautics (CETA), Southern New Hampshire University (SNHU), Manchester, New Hampshire
The ...

교육

JoVE Science Education

항공공학

Efficiency of Liquid-liquid Extraction

Source: <a href="https://www.jove.com/author/Kerry+M._Dooley">Kerry M. Dooley</a> and Michael G. Benton, Department of Chemical Engineering, Louisiana State University, Baton Rouge, LA
Liquid-liquid extraction (LLE) is a separation technique used instead of distillation when either: (a) the relative volatilities of the compounds to be separated are very similar; (b) one or more of the mixture components are temperature sensitive even near ambient conditions; (c) the distillation would require a very low pressure or a very high distillate/feed ratio.1The driving force for mass transfer is the difference in solubility of one material (the solute) in two other immiscible or partially miscible streams (the feed and the solvent). The feed and solvent streams are mixed and then separated, allowing the solute to transfer from the feed to the solvent. Normally, this process is repeated in successive stages using counter-current flow. The solute-rich solvent is called the extract as it leaves, and the solute-depleted feed is the raffinate. When there is a reasonable density difference between the feed and solvent streams, extraction can be accomplished using a vertical column, although in other cases a series of mixing and settling tanks may be used.
In this experiment, the operational goal is to extract isopropanol (IPA, ~10 - 15 wt. %, the solute) from a mixture of C8-to-C10 hydrocarbons using pure water as solvent. A York-Scheibel type (vertical mixers and coalescers, one each per physical stage) extraction column is available. Like most extractors, the overall efficiency (number theoretical stages/physical stages) of this column is quite low, especially in comparison to many distillation columns. The low efficiencies arise from both slow mass transfer (two liquid resistances instead of one as in distillation) and often also from maldistribution of the phases. The effect of agitator speed on both the solute recovery in the extract and the overall column efficiency will be evaluated.

Liquid-liquid Extraction and York-Scheibel Column Operation

액체-액체 추출의 효율성

Source: Kerry M. Dooley and Michael G. Benton, Department of Chemical Engineering, Louisiana State University, Baton Rouge, LA
Liquid-liquid extraction ...