Questo flusso di lavoro automatizzato fornisce una digestione enzimatica proteica coerente con eccellente riproducibilità e produttività. Ciò migliora l'accuratezza e l'affidabilità della scoperta, della convalida e dell'applicazione clinica dei biomarcatori mediante spettrometria di massa. Il vantaggio di questa tecnologia è che l'intero flusso di lavoro può essere completato per 96 campioni in circa cinque ore con CV intra-test e inter-test inferiore al 20% per la maggior parte delle proteine.
Questa accurata preparazione del campione ad alta produttività ci consente di studiare proteomi di malattie di tessuti o biofluidi su scala più ampia. Inoltre, il flusso di lavoro automatizzato di preparazione dei campioni proteomici fornisce una solida base per l'alto contenuto e un'analisi proteomica quantitativa. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Qin Fu, Direttore dell'High Throughput Center del Cedar Sinai e il Signor Casey Johnson, un ricercatore associato del mio laboratorio.
Prima di iniziare l'analisi, aggiungere cinque microlitri di plasma umano sano raggruppato in una piastra di propilene profonda 96 tondi. Una volta caricati tutti i campioni, aprire il software del dispositivo di gestione liquidi e nella scheda del metodo selezionare home tutti gli assi per orientare il gestore di liquidi automatizzato. Verificare che tutte le siringhe della workstation non contengano bolle d'aria visibili e aprire un nuovo metodo e fare clic su Esegui per avviare il metodo.
Immettere true nell'immettere un valore da utilizzare per il prompt dell'autocampionatore per preparare una piastra di campionamento automatico alla fine del metodo e fare clic su OK. Immetterne uno nel immettere un valore da utilizzare per il prompt della prima colonna e fare clic su OK. Immettere 12 nel immettere un valore da utilizzare per l'ultima richiesta di colonna e fare clic su OK. Se si utilizza una piastra campione con volumi campione di almeno 20 microlitri, immettere true nel immettere un valore da utilizzare per il prompt della piastra campione e fare clic su OK. Seguire le istruzioni nella finestra Installazione labware guidata e fare clic su Continua. Caricare i reagenti appropriati nei pozzi appropriati e fare clic su Avanti. Fare di nuovo clic su Avanti per disporre il deck di gestione del liquido automatizzato come illustrato, tra cui le piastre di reagente, reazione, campione e autocampionatore, scatole di punta da 90 microliter a sei pozzetti, una scatola di punta vuota da 90 microliter e una scatola di punta completa da 230 microliter.
Quindi fare clic su Fine per iniziare il metodo. Al prompt di proseguono dopo la centrifugazione, recuperare la piastra di reazione e posizionare la piastra nella centrifuga. Al termine della centrifugazione, riportare la piastra di reazione nella sua posizione all'interno del gestore di liquidi automatizzato e fare clic su Continua.
Per la cromatografia liquida e l'analisi della spettrometria di massa tandem, risolvere i peptidi in una colonna di 3,5 micrometri C18 2.1 per 100 millimetri per cromatografia liquida ad alta pressione ad alto flusso con una portata di 250 microlitri al minuto e analizzati in linea su un triplo spettrometro di massa quadrupolo. Cinque minuti dopo il caricamento, equilibrare la colonna con la soluzione tampone B al 5% ed elutare i peptidi con un gradiente lineare del 5-35% del buffer B per 30 minuti. Al termine dell'eluizione, lavare la colonna con il 98%buffer B per 10 minuti seguita da un lavaggio di cinque minuti con 5%buffer B prima di caricare il campione successivo.
Per la deviazione online, utilizzare una valvola di commutazione a due fasi per deviare l'eluente post-colonna in rifiuto prima che entri nella sorgente ioniche. Una volta che tutti i campioni sono stati eluitati, è possibile elaborare più dati di monitoraggio della reazione. In questa analisi rappresentativa, tre peptidi beta-gal e due peptidi di albumina sono stati monitorati da beta-gal spiked e proteine dell'albumina plasmatica elaborata.
La precisione del flusso di lavoro automatizzato di preparazione del campione è stata calcolata come percentuale del coefficiente di varianza del flusso di lavoro totale di monitoraggio della reazione proteomica selezionata meno il coefficiente percentuale di varianza della spettrometria di massa tandem della cromatografia liquida. Come previsto, sono state osservate buone intensità di segnale sia per l'albumina del siero umano che per le proteine beta-gal. Per monitorare la precisione dei passaggi di trasferimento del liquido, è possibile ottenere standard peptidici stabili etichettati isotopici per l'albumina endogena del siero umano e la proteina beta-gal esogena in passaggi di trasferimento reagenti indipendenti.
Per convalidare il flusso di lavoro automatizzato di preparazione del campione proteomico, il coefficiente intragiornale dei valori di varianza è stato calcolato da 21 pozzi preparati lo stesso giorno. Il coefficiente percentuale medio intraday di varianza per 40 proteine variava dal 4 al 20%Per valutare l'effetto bordo del flusso di lavoro automatizzato basato su lastre, il coefficiente percentuale di varianza può essere calcolato da pozzi specifici all'interno di colonne e righe designate. In questo esperimento rappresentativo, le intensità del segnale di monitoraggio della reazione multipla erano simili in tutte le configurazioni di colonna e riga con il coefficiente percentuale di varianza che variava dal 3 al 22%I passaggi più importanti sono l'aggiunta corretta di un campione in base alla mappa della piastra a 96 pozzetti desiderata e la corretta impostazione della piastra di reagente secondo le istruzioni del software.
Questo metodo automatizzato di preparazione dei campioni proteomici consente ai ricercatori di raccogliere dati proteomici affidabili e quantitativi su larga scala.
