Questo protocollo fornisce un facile accesso al mondo sempre più popolare ma complesso della tomografia crioelettronica. È possibile visualizzare sei campioni cellulari. Istituto in uno stato vicino allo stato nativo.
Le micromolecole possono quindi essere risolte ad alta risoluzione nel loro ambiente cellulare nativo utilizzando la media CROW, ET e sub atom. Inizia avviando il software Tomo five dal pc server TEM. Avviare la configurazione della sessione regolando i parametri di acquisizione delle immagini nella scheda preparazione, sotto i predefiniti.
Copiare i parametri di acquisizione dell'immagine in tutti gli altri preset ad alto ingrandimento. Premere Set per impostare l'esposizione al microscopio e Get" per ottenere le impostazioni di esposizione a tutti gli altri ingrandimenti elevati dopo averli selezionati singolarmente. Per raccogliere un atlante, fare clic sulla scheda Nuova sessione nella scheda Atlante.
Impostare le preferenze di sessione. Immettere il percorso di archiviazione e il formato di output e premere Applica. Seleziona Screening" e spunta tutti gli atlanti da acquisire.
Selezionare Chiudi valvole di chiamata"Se il microscopio non è supervisionato, questo chiuderà le valvole a colonna. Quindi, per avviare lo screening, premere il pulsante di avvio. Ispeziona gli atlanti singoli o multipli per le destinazioni facendo clic sulla griglia nel pannello di sinistra sotto Configurazione sessione"Quindi fai clic con il pulsante sinistro del mouse e trascina il mouse per spostarti e scorri verso il centro per ingrandire e rimpicciolire.
Scegliere la griglia per l'impostazione di destinazione. Selezionalo e fai clic su "Carica campione" dall'interno del software. Per eseguire la calibrazione dello spostamento dell'immagine, nella scheda "Funzioni automatiche" impostare il predefinito su Altezza eucentrica"Passare ad Auto-Eucentrico" inclinazione dello stage e premere start.
Se la funzione è rimasta centrata durante il targeting, saltare le calibrazioni dello spostamento dell'immagine. Altrimenti, vai alla scheda Preparazione per calibrare lo spostamento dell'immagine, seleziona "Calibra spostamento immagine" e premi start. Ciò allineerà gli ingrandimenti inferiori alla caratteristica centrata sull'ingrandimento dell'esposizione.
Per la configurazione della tomografia, avviare una nuova sessione in Impostazione sessione" per campioni biologici. Scegli Slab like "come tipo di campione e seleziona Batch" e Low Dose"Quindi seleziona la cartella Formato di output e archiviazione. Facoltativamente, aggiungi un destinatario e-mail e premi "Per impostare gli obiettivi, vai alla freccia dell'atlante, trova una regione di interesse e spostati selezionando le opzioni che appaiono con un clic destro del mouse.
Scatta un'immagine panoramica per confermare una buona posizione per la regolazione Eucentric dell'altezza. Quindi premere autoeucentric" per eseguire la routine eucentrica per inclinazione dello stadio, riacquisire una nuova immagine panoramica per aggiornare l'altezza eucentrica. Ispeziona la panoramica della piazza o la mappa di ricerca acquisita.
Spostarsi in un'area di interesse e premere acquisisci ricerca. Quindi ispezionare l'immagine di ricerca se la regione di interesse non è centrata, fare clic con il pulsante destro del mouse nella posizione desiderata e ripetere la fase di spostamento qui" e acquisire l'immagine. Regola le aree di messa a fuoco e di tracciamento.
Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per trascinare le aree di tracciamento e messa a fuoco. Una volta impostati tutti i parametri, premere Aggiungi posizione "Per eseguire le funzioni automatiche, controllare le impostazioni per eseguire gli allineamenti tramite la scheda Funzioni automatiche" navigando nell'atlante verso un'area di carbonio. Porta quell'area all'altezza eucentrica e segui l'ordine degli allineamenti come descritto nel manoscritto testuale.
Quindi, avviare l'acquisizione automatica della scheda tomografia. Selezionare la lastra di acquisizione dati e impostare i parametri desiderati. Imposta i parametri di acquisizione dati: passo di inclinazione, angolo positivo massimo, angolo negativo massimo, schema di tracciamento.
Quindi selezionare "Chiudi valvole colonna" per lo schema di altezza eucentrico. Iniziare con la preparazione dei file di input e delle directory. Stabilire una cartella di progetto nella cartella Project".
Crea un'altra nuova cartella fissa stack e prepara i file di input. Tilt serie one fixed tilt series 1. XF e tilt serie 1.tlt.
Per calcolare la sfocatura, aggiornare il file dei parametri con i parametri del microscopio e dell'imaging. Copiare un file di parametri nella cartella del progetto. Cambia il suo nome in param_CTF.
M ed eseguire il comando indicato. Quindi, controlla i risultati della stima CTF. Per ogni pila, controlla le pile allineate usando la mod 3D e assicurati che le perline fiduciali vengano cancellate correttamente.
Assicurarsi che la maneggevolezza sia corretta eseguendo il comando indicato. Quindi controlla il valore di sfocatura e assicurati che corrisponda alla stima teorica CTF. Per definire le sottoregioni, generate un tomogramma di piegatura.
Nella cartella del progetto, eseguire il comando indicato. Determinare i limiti scegliendo sei punti Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin e Zmax, per creare una sottoregione nella cartella bin10, eseguire il comando indicato. Quindi, esegui il prelievo delle particelle per ogni sottoregione.
Per il set di dati dell'apoferritina effettuare una ricerca nel modello al cestino sei. Modificare l'angolo di sottolineatura del modello. Parametri di ricerca per determinare l'angolo, l'intervallo e gli intervalli per la ricerca in piano o fuori piano in gradi.
Nella cartella del progetto eseguire il comando indicato. Rimuovi le particelle errate usando la mod 3D sotto la cartella. Convmap_wedge_Type2_bin6. Eseguire il comando indicato.
Quindi, inizializzare il progetto. Nella cartella del progetto eseguire il comando indicato per creare un database per la chiarezza EM, AppoF.mat. Eseguire la ricostruzione del tomogramma prima della media e dell'allineamento del sub tomo per generare tomogrammi della sottoregione corretti CTF in bin4, eseguire il comando indicato.
Successivamente, per eseguire la media e l'allineamento del sub tomo, effettuare la media utilizzando i sottotelegrammi corretti CTF a partire da bin4. Nella cartella del progetto, eseguire il comando indicato. Continuare a eseguire gli allineamenti ed eseguire il comando.
Pulire le particelle sovrapposte eseguendo il comando indicato. Eseguire la ricostruzione finale combinando i due set di dati a metà. Nella cartella del progetto eseguire i comandi indicati.
Panoramica del flusso di lavoro della tomografia per la tomografia cellulare e molecolare sono mostrati qui per campioni cellulari e lamelle, la strategia di raccolta dei dati dipende in gran parte dal campione e dall'obiettivo dello studio di imaging. I parametri di raccolta per diversi studi di crio ET sono mostrati qui. Qui sono mostrati tomogrammi rappresentativi di campioni molecolari come apoferritina, processi cellulari sottili e lamelle fresate a fascio ionico focalizzato del campione cellulare spesso.
L'analisi strutturale ad alta risoluzione può aiutare a rivelare i siti di legame per i bersagli farmacologici e la tomografia e la media sub-tomograle hanno anche aiutato lo sviluppo del vaccino contro SARS-CoV-2.
