Name: zebrafish as a model to assess the teratogenic potential of nitrite
Uploaded: 2016-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite at JoVE.com

VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.

Le procedure descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l&#39;Indiana University of Pennsylvania. 1. Harvest embrioni <ol><li> Mantenere zebrafish a 28,5 ° C, pH 7, conducibilità tra 500-1.500 mS, e un ciclo luce / buio di 14 ore di luce e 10 ore scuro 24. Utilizzare ceppi wild-type, come Tu, AB o TU / AB ibrido. Diversi ceppi possono rispondere in modo diverso al trattamento chimico 25. </li><li> Impostare il pesce per l&#39;accoppiamento la sera prima le uova di raccolta con l&#39;aggiunta di acqua sistema di pesce in un serbatoio di accoppiamento. Aggiungere un maschio e femmina di pesce nel serbatoio e separare le due pesci con un divisore. Ogni coppia di pesce produrrà una gamma di 50-300 uova. Per garantire che saranno prodotti abbastanza uova, istituito 30 paia di pesce. In genere, circa il 50% delle coppie di pesce all&#39;età di accoppiamento primo (6-9 mesi) produrrà uova, con conseguente fino a 200 uova per ogni coppia e un massimo di fino a 3, 000 uova per questo esperimento. </li><li> La mattina seguente dopo che la luce si accende, rimuovere il divisore di avviare l&#39;accoppiamento. Controllare i serbatoi di accoppiamento per le uova ogni 15 min. </li><li> Una volta che i pesci depongono le uova, raccogliere tutti gli embrioni utilizzando un colino da tè e combinarle in un unico grande contenitore con E3 tampone (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4). A 1,5 HPF, rimuovere ed eliminare le uova non fecondate con una pipetta di plastica sotto un microscopio da dissezione. Uova non fecondate sono opache mentre le uova fecondate sono trasparenti 34. </li><li> Trasferire 50 embrioni in una piastra di Petri di 100 x 15 mm di vetro contenente 50 ml E3 buffer per ciascuna condizione di trattamento. Un totale di 33 piatti sono necessari per 11 condizioni di trattamento e 3 repliche. </li></ol> 2. Gli embrioni Trattamento <ol><li> Effettuare trattamenti a 2 ore dopo la fecondazione (HPF) 35. Incubare gli embrioni / larve a 28,5 ° C ed esaminare le larve a 120 HPF. Eseguire a least tre repliche di ogni condizione di trattamento per l&#39;analisi statistica. </li><li> Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di 300 mm etanolo diluito in tampone di E3. Coprire le piastre di Petri con parafilm per minimizzare l&#39;evaporazione dell&#39;etanolo. <ol><li> Continuare ad esporre gli embrioni di etanolo per 22 ore. Poi rimuovere l&#39;etanolo con una pipetta di trasferimento. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare l&#39;etanolo. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte. </li></ol></li><li> Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nuovo buffer E3. </li><li> Per 9 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrito di sodio 1,000 mg / l disciolti in tampone E3. Confermare la concentrazione della soluzione di riserva di nitriti in anticipo utilizzando unmodifica della diazotazione (US EPA Method 354.1) metodo spettrofotometrico 28. <ol><li> Continuare ad esporre 3 piatti per 46 ore, 3 piatti per 70 ore e 3 piatti per 94 ore. Sostituire la soluzione di nitrito con una soluzione di nitrito di fresco tutti i giorni. </li><li> Dopo ogni tempo di esposizione, rimuovere la nitriti con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare la nitriti. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte. </li></ol></li><li> Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrito di sodio 200 mg / L. Ripetere questa operazione con 400, 600, 800, e 1000 mg / l di nitrito di sodio. <ol><li> Continuare ad esporre gli embrioni in nitrito per 70 ore. Sostituire la soluzione di nitrito con una soluzione di nitrito di fresco tutti i giorni. </li><li> Dopo il tempo di esposizione, rimuovere la nitriti con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto diversivolte per lavare i nitriti. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte. </li></ol></li><li> Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrato di sodio 1,000 mg / l disciolti in tampone E3. Conferma la concentrazione della soluzione di nitrato anticipo usando una modifica della riduzione cadmio (metodo USEPA 353.3) metodo spettrofotometrico 28. <ol><li> Continuare ad esporre gli embrioni per il nitrato di 70 ore. Sostituire la soluzione di nitrato con soluzione di nitrato appena fatto quotidiano. </li><li> Dopo il tempo di esposizione, rimuovere il nitrato con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare il nitrato. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte. </li></ol></li><li> Durante ogni giorno di esposizione, contare il numero di morti dell&#39;embrione / larve utilizzando uno stereomicroscopio. Segni di morteincludono la mancanza di battito cardiaco e la circolazione del sangue, o la mancanza di motilità dopo 1 minuto di osservazione. Rimuovere morti embrioni / larve con una pipetta di trasferimento per ridurre la contaminazione del buffer E3. </li><li> Quando gli esperimenti finiscono a 120 HPF, eutanasia le larve. <ol><li> Rimuovere il buffer E3 con una pipetta. Quindi aggiungere 50 ml di 0,2% MS-222 (tamponata a pH 7) e attendere 10 min. </li><li> Rimuovere il MS-222 con una pipetta di trasferimento. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare per lavare la MS-222. </li><li> Rimuovere il buffer E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 20 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per fissare le larve. Agitare più volte piatto. Utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire le larve in una fiala di vetro lungo con abbastanza PFA per riempire il flacone. Conservare le fiale in frigorifero per una notte (O / N). </li></ol></li><li> Scatta foto di larve fisso con uno stereoscopio con una fotocamera digitale. Utilizzare 30X di ingrandimento, ISO 200, e 200 msec tempo di esposizione. Orientare le larve modo che anteriore alla left e dorsale è all&#39;inizio del campo. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il metodo descritto qui dimostra l&#39;utilità di zebrafish nel valutare il potenziale teratogeno di nitriti e nitrati. Rispetto ad altri vertebrati, zebrafish hanno vantaggi che includono alta fecondità, fecondazione esterna, trasparenza ottica e rapido sviluppo. Mutanti disponibili che mancano di pigmentazione (come ad esempio il pesce zebra Casper 36) aiutano anche a migliorare la visibilità degli organi interni. E &#39;anche facile generare zebrafish transgenico con geni reporter per facilitare l&#39;a...

Teratogenesi è un processo che sconvolge il normale sviluppo di un embrione o il feto, provocando anomalie strutturali e funzionali permanenti, ritardo della crescita, o aborto spontaneo nei casi più gravi 1. Esso può essere causato da alcuni agenti naturali (teratogeni), che interferiscono con lo sviluppo embrionale in diversi modi 2. Durante lo sviluppo fetale umano, teratogeni comuni come le radiazioni, agenti infettivi, metalli tossici e sostanze chimiche organiche sono stati segnalati per causare difetti di epicanto (la pelle piega nella palpebra superiore) e clinodattilia (dito curvo o tep) attraverso errori morfogenetici 1. La comprensione del meccanismo molecolare di teratogenesi è il primo passo verso lo sviluppo di trattamento e la prevenzione. Diversi modelli vertebrati quali la rana africana artigliata (Xenopus laevis) e zebrafish (Danio rerio) sono stati utilizzati per determinare i percorsi molecolari colpite dalla TeratOgens. Studi precedenti hanno utilizzato zebrafish come modello per l&#39;epidemiologia, tossicologia e teratogenesi 3-7. Scholz et al. zebrafish considerato come un &quot;gold standard&quot; per la valutazione della tossicità ambientale. Ciò è dovuto, in parte, alla trasparenza dell&#39;embrione zebrafish, che permette ai ricercatori di visualizzare il difetto di sviluppo come avviene 8. Circa il 70% dei geni umani hanno ortologhi in zebrafish, facendo zebrafish un modello vertebrato desiderabile per lo studio di difetti umani 9. Alcuni studi epidemiologici hanno suggerito che nitrati e nitriti, comunemente presenti negli alimenti agricoli e acqua, sono associate a difetti di nascita o aborti spontanei 10,11, mentre altri studi non supportano questa associazione 12. Nitrati (NO 3 -) e nitriti (NO 2 -) sono naturalmente presenti nel suolo e nell&#39;acqua. Essi sono una fonte di azoto per le piante e sono una parte della nciclo itrogen 13. Alimenti come fagiolini, carote, zucca, spinaci, bietole e provenienti da allevamenti che utilizzano fertilizzanti ad alto contenuto di nitrati hanno livelli di nitrati e nitriti 7 aumentata in modo significativo. Il latte da mucche alimentate con alimenti di nitrati alti e pesci in acqua alta nitrato (principalmente dal deflusso terreno 30) può portare agli esseri umani che consumano grandi quantità di nitrati e nitriti 14. Nitrati e nitriti sono comunemente utilizzati nella conservazione degli alimenti, che aumenta notevolmente la quantità ingerita dagli esseri umani 12. Livelli ottimali di nitrati e nitriti svolgono un ruolo fondamentale nei processi fisiologici come omeostasi vascolare e la funzione, la neurotrasmissione e meccanismi di difesa ospite immunologici 13-15. Tuttavia, l&#39;esposizione ad alti livelli di nitrati e nitriti può portare ad effetti negativi, soprattutto nei neonati e nei bambini 16. nitrato ingerito viene ulteriormente convertito in nitriti nella cavità orale microflora e in the tratto gastrointestinale dalla microflora intestinale 17. Nitrato mette i neonati ad alto rischio per la sindrome del bambino blu per ossidazione di emoglobina a metaemoglobina, compromettendo l&#39;emoglobina che trasporta l&#39;ossigeno dalla sua capacità di 18. Ciò comporta il colore blu di pelle che si estende ai tessuti periferici nei casi più gravi. L&#39;ossigenazione inibito di tessuti risultati in altri sintomi, più gravemente che porta al coma e alla morte 19,20. Sintomi simili sono stati osservati nei bambini e negli adulti a concentrazioni più elevate di nitrati 21. Elevati livelli di metaemoglobina negli adulti a causa di risultati di avvelenamento nitrito di cianosi, mal di testa, disturbi respiratori, 31 e morte se non trattata a causa di complicazioni legate alla ipossia tissutale vitale 32,33. Il nitrato ingerito a livelli più alti può anche tradursi in varie complicazioni di salute. diabete infantile, diarrea ricorrente, e infezioni delle vie respiratorie ricorrentinei bambini sono stati collegati con elevata assunzione di nitrato 11,17,22. L&#39;esposizione cronica a un alto livello di nitrato è associato con la minzione e della milza emorragie. L&#39;esposizione acuta ad alte dosi di nitrati può portare ad un ampio spettro di condizioni mediche come dolori addominali, debolezza muscolare, sangue nelle feci e nelle urine, svenimenti e morte 11. L&#39;esposizione prenatale al nitrato ad alti livelli è stato associato con il tubo neurale e difetti muscolo-scheletrico 11. Un recente rapporto ha mostrato che il trattamento di embrioni di zebrafish con il nitrito ha portato alla tuorlo edema sac, malformazioni cranio-facciali e assiali, e vescica natatoria noninflation 5. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per il trattamento di embrioni di zebrafish con nitrati e nitriti per determinare il loro potenziale teratogeno. Gli embrioni sono stati esposti a nitrito a differenti concentrazioni e periodi di tempo diversi. L&#39;etanolo è stato utilizzato come controllo positivo, poiché è un teratogeno stabilita 23. Our metodo ha dimostrato che entrambe le concentrazioni elevate e tempi di esposizione lunghi in nitriti erano dannosi per la sopravvivenza e ha portato in vari fenotipi, che vanno da lievi (edema) a gravi difetti di sviluppo (lordi). Pertanto, il pesce zebra è un modello utile per esplorare direttamente i potenziali effetti teratogeni di nitrati e nitriti sugli embrioni per completare gli studi epidemiologici.

<table><tbody><tr><td>DREL/2010 instrument</td><td>Hach</td><td>26700-03</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>KIMAX glass Petri Dish</td><td>VWR</td><td>89001-244</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>NitraVer 5 Nitrate Reagent</td><td>Hach</td><td>14034-46</td><td></td></tr><tr><td>NitriVer 3 Nitrite Reagent</td><td>Hach</td><td>14065-99</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>3-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>S6E stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>10446294</td><td></td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S343</td><td></td></tr><tr><td>Sodium nitrite</td><td>Fisher Scientific</td><td>S347</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>L320072</td><td></td></tr><tr><td>Glass vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish as a model to assess the teratogenic potential of nitrite

Alti livelli di nitrati nell&#39;ambiente può causare difetti congeniti o aborti negli esseri umani. Presumibilmente, questo è dovuto alla conversione dei nitrati in nitriti da intestinali e salivari batteri. Tuttavia, in altri studi di mammiferi, alti livelli di nitriti non causano difetti alla nascita, anche se possono portare a scarsi esiti riproduttivi. Pertanto, il potenziale teratogeno di nitriti non è chiaro. Sarebbe utile avere un sistema modello vertebrato valutare facilmente effetti teratogeni di nitrito o qualsiasi altro prodotto chimico di interesse. Qui, dimostriamo l&#39;utilità di zebrafish (Danio rerio) per lo screening di composti per la tossicità e difetti embrionali. zebrafish embrioni sono fecondati esternamente ed avere un rapido sviluppo, che li rende un buon modello per gli studi teratogeni. Abbiamo dimostrato che aumentando il tempo di esposizione al nitrito influenza negativamente la sopravvivenza. Aumentando la concentrazione di nitrito anche effetti negativi di sopravvivenza, considerando che il nitrato non. Per gli embrioni that sopravvivere l&#39;esposizione nitrito, vari difetti si possono verificare, tra cui pericardico e tuorlo d&#39;edema sac, nuotare noninflation vescica e malformazioni cranio-facciale. I nostri risultati indicano che il zebrafish è un sistema conveniente per studiare il potenziale teratogeno di nitriti. Questo approccio può essere facilmente adattato per testare altre sostanze chimiche per i loro effetti sul primo sviluppo dei vertebrati.

L&#39;esposizione a 300 mm di etanolo per 22 ore ha avuto alcun effetto sulla sopravvivenza (dati non mostrati), in linea con le precedenti relazioni 5,23,26. Questo è previsto, come l&#39;etanolo è un teratogeno conosciuto e servito come controllo positivo. Fenotipi osservati inclusi edema pericardico, noninflation vescica natatoria (figura 1), difetti cranio-facciali e ritardo dello sviluppo (dati non riportati). <p class="jove_content" fo:keep-togethe...

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Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

L&#39;esposizione a teratogeni può causare difetti alla nascita. Zebrafish sono utili per determinare il potenziale teratogeno di sostanze chimiche. Dimostriamo l&#39;utilità di zebrafish esponendo embrioni a vari livelli di nitriti e anche in diversi tempi di esposizione. Abbiamo dimostrato che il nitrito può essere tossico e causare gravi difetti di sviluppo.

Zebrafish come modello per valutare il potenziale teratogeno di nitriti

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

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9.4K Views.  Indiana University of Pennsylvania.  L'esposizione a teratogeni può causare difetti alla nascita. Zebrafish sono utili per determinare il potenziale teratogeno di sostanze chimiche. Dimostriamo l'utilità di zebrafish esponendo embrioni a vari livelli di nitriti e anche in diversi tempi di esposizione. Abbiamo dimostrato che il nitrito può essere tossico e causare gravi difetti di sviluppo. 

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Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Valutare i cambiamenti teratogeni in un modello di Zebrafish di esposizione alcolica fetale

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ricerca

Medicina

Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae are a preeminent model for the neurobehavioral study of environmental pollutants. Here, a detailed experimental protocol is provided for the evaluation of the neurotoxicity of environmental pollutants using zebrafish larvae, including the collection of the embryos, the exposure process, neurobehavioral indicators, the test process, and data analysis. Also, the culture environment, exposure process, and experimental conditions are discussed to ensure the success of the assay. The protocol has been used in the development of psychopathic drugs, research on environmental neurotoxic pollutants, and can be optimized to make corresponding studies or be helpful for mechanistic studies. The protocol demonstrates a clear operation process for studying neurobehavioral effects on zebrafish larvae and can reveal the effects of various neurotoxic substances or pollutants.

A detailed experimental protocol is presented in this paper for the evaluation of neurobehavioral toxicity of environmental pollutants using a zebrafish larvae model, including the exposure process and tests for neurobehavioral indicators.

Studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali sulle larve dei pesci zebra

Recent years more and more environmental pollutants have been proved neurotoxic, especially at the early development stages of organisms. Zebrafish larvae ...

Ambiente

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features of a unique and convenient model system. As highly proliferative cells are more susceptible to radiation-induced DNA damage, zebrafish embryos are a front-line in vivo model in radiation research. In addition, this model projects the effect of radiation and different drugs within a short time, along with major biological events and associated responses. Several cancer studies have used zebrafish, and this protocol is based on the use of radiation modifiers in the context of radiotherapy and cancer. This method can be readily used to validate the effects of different drugs on irradiated and control (non-irradiated) embryos, thus identifying drugs as radio sensitizing or protective drugs. Although this methodology is used in most drug screening experiments, the details of the experiment and the toxicity assessment with the background of X-ray radiation exposure are limited or only briefly addressed, making it difficult to perform. This protocol addresses this issue and discusses the procedure and toxicity evaluation with a detailed illustration. The procedure describes a simple approach for using zebrafish embryos for radiation studies and radiation-based drug screening with much reliability and reproducibility.

The zebrafish has recently been exploited as a model to validate potential radiation modifiers. The present protocol describes the detailed steps to use zebrafish embryos for radiation-based screening experiments and some observational approaches to evaluate the effect of different treatments and radiation.

Larve di pesce zebra come modello per valutare potenziali radiosensibilizzanti o protettori

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Ricerca sul cancro

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Biologia

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Batteria di test comportamentali per valutare gli effetti neurotossici nel pesce zebra adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autore in primo piano: Valutazione dei cambiamenti comportamentali ambientali e indotti da farmaci nel pesce zebra adulto 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

Zebrafish come modello per valutare il potenziale teratogeno di nitriti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Valutare i cambiamenti teratogeni in un modello di Zebrafish di esposizione alcolica fetale

Studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali sulle larve dei pesci zebra

Larve di pesce zebra come modello per valutare potenziali radiosensibilizzanti o protettori

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio