Gli approcci precedenti si basavano su metodi altamente invasivi per ottenere cellule staminali mesenchimali in vitro, ma quelle cellule staminali mesenchimali avevano una limitazione di produrre pool eterogenei del 30% con un'efficienza che andava dal 30 al 60% Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un numero elevato di cellule staminali mesenchimali in rapida proliferazione in grado di produrre una popolazione pura di adipociti maturi mediante selezione utilizzando il rosso del Nilo. Quando le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le cellule con DPBS e aggiungere il mezzo di dissociazione contenente EDTA. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un minuto.
Dopo un minuto, aspirare il reagente di dissociazione e posizionare le cellule a 37 gradi Celsius per un ulteriore minuto. Quindi, rimuovere la piastra dall'incubatore. Aggiungere un millilitro di supporto StemFlex per pozzetto e raccogliere con cura le celle in un tubo conico da 15 millilitri.
Centrifugare le cellule. Rimuovere il surnatante e risospenderli delicatamente in tre millilitri di mezzi di differenziazione MSC contenenti 10 micromoli di un inibitore della roccia. Mescolare la sospensione cellulare e distribuire 500 microlitri per pozzetto in una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti.
Quindi posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, per indurre i corpi embrionali raggiunti, raccoglierli in un tubo da 15 millilitri e lasciarli sedimentare. Dopo 15 minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere il mezzo di differenziazione MSC integrato con acido retinoico micromolare.
Risospendere delicatamente i corpi embrionali e distribuire 500 microlitri per pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore. Dopo 48 ore, raccogliere i corpi embrionali in un tubo da 15 millilitri e lasciarli riposare per 15 minuti.
Quindi rimuovere il surnatante e aggiungere il mezzo di differenziazione MSC integrato con acido retinoico micromolare 0,1. Dopo aver risospeso i corpi embrionali, distribuire 500 microlitri per pozzetto nella stessa piastra a 24 pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore. Quarantotto ore dopo l'ultimo trattamento con acido retinoico, raccogliere i corpi embrionali, rimuovere il surnatante e aggiungere DMEM a basso contenuto di glucosio senza citochine.
Risospendere delicatamente e distribuire 500 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, per placcare i corpi embrionali derivati da iPSC, raccogliere i corpi embrionali in un tubo da 15 millilitri, lasciarli sedimentare, quindi rimuovere il surnatante e risospendere in due millilitri di terreno di differenziazione MSC fresco. Quindi, trasferire la sospensione in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti rivestita di matrice di membrana basale e incubare le cellule a 37 gradi Celsius.
Dopo cinque giorni, sostituire il terreno esaurito con un nuovo mezzo di differenziazione MSC contenente 2,5 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti di base e continuare la differenziazione MCS per un massimo di 11 e 15 giorni. Quando i corpi embrionali placcati hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, passarli lavandoli con DPBS, aggiungendo tripsina-EDTA e incubando a 37 gradi Celsius per un minuto. Rimuovere la tripsina-EDTA dalla piastra e incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per un minuto.
Quindi, aggiungere un millilitro di supporto per pozzetto. Dopo tre minuti, raccogliere le cellule utilizzando il mezzo di differenziazione MSC in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare le cellule. Quindi risospendere le cellule in un mezzo di differenziazione MSC contenente il fattore di crescita dei fibroblasti di base e placcare le cellule su piastre rivestite di matrice di membrana basale in un rapporto da uno a tre.
Dopo che le MSC hanno raggiunto il 90% di confluenza, continuare a coltivarle per altre 48 ore per consentire loro di subire un periodo di arresto della crescita. Quindi rimuovere il mezzo e lavare le celle con DBPS. Dopo il lavaggio, aggiungere un mezzo completo di differenziazione degli adipociti alla piastra e incubare le cellule a 37 gradi Celsius.
Cambia il mezzo a giorni alterni per 14 giorni. Differenziare le MSC derivate da iPSC in adipociti. Per ordinare gli adipociti usando il rosso del Nilo, preparare la soluzione di lavoro rosso del Nilo in DMSO come descritto nel manoscritto di testo.
Prima dell'uso, scongelare la soluzione madre e ricostituirla in DPBS per ottenere una concentrazione di soluzione di lavoro di 300 nanomolari. Al giorno 14 o dopo la differenziazione degli adipociti, eliminare il terreno dalle cellule e lavare utilizzando DPBS. Quindi aggiungere la soluzione di lavoro rosso Nilo.
Coprire la piastra e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo 15 minuti, sostituire la soluzione di rosso del Nilo con tripsina-EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi raccogliere le cellule utilizzando DMEM contenente il 5% di FBS in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare le cellule.
Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in DPBS ad una densità di 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, utilizzando il selezionatore FACS, isolare le cellule rosse positive del Nilo utilizzando il canale FL-1. Raccogliere le cellule selezionate e ricoltivarle in mezzi di differenziazione degli adipociti o procedere all'estrazione dell'RNA seguita dall'analisi quantitativa dei marcatori di differenziazione degli adipociti.
All'inizio della differenziazione, le cellule placcate in sospensione sono rotonde con bordi cellulari definiti e hanno un diametro medio-piccolo. La vitalità dei corpi embrionali è osservata dal comportamento di rapida proliferazione che dà origine a più MSC. Questo rapido comportamento di proliferazione, insieme alla loro morfologia peculiare e allungata, viene mantenuto anche dopo aver passato le MSC su piastre rivestite di matrice fresca.
Una buona differenziazione produce MSC affidabili con un'efficienza di espressione superiore al 90% dei marcatori di superficie mesenchimali CD73, CD44 e CD90. Inoltre, la valutazione delle cellule per l'assenza di marcatori di superficie raffiguranti il fenotipo ematopoietico CD14, CD34 e CD19 ha mostrato un'efficienza di espressione inferiore all'1%, L'alta espressione nella distribuzione citoplasmatica di FABP4, un marker per adipociti terminalmente differenziati, indica la loro maturità evolutiva. Inoltre, l'alta espressione di adiponectina, un altro marker della maturità degli adipociti, indica che gli adipociti sono abbastanza funzionali da subire accumulo lipidico e adipogenesi in risposta alla segnalazione del glucosio.
Al momento della colorazione, il rosso del Nilo si lega esclusivamente agli adipociti maturi portatori di lipidi, rendendolo uno strumento efficace per la selezione degli adipociti maturi utilizzando la citometria a flusso attivata dalla fluorescenza. I globuli rossi positivi del Nilo mostrano una significativa sovraregolazione dei marcatori di maturazione di almeno due volte rispetto alle cellule non ordinate. Devi essere molto delicato durante la raccolta delle cellule durante la formazione del corpo embrionale e la dissociazione delle cellule mesenchimali in quanto ciò avrebbe un forte impatto sull'efficienza di sopravvivenza post-dissociazione delle cellule staminali mesenchimali.
La popolazione pura di adipociti ottenuta da pazienti portatori di mutazione può essere sottoposta al sequenziamento funzionale e all'intero trascrittoma per determinare le vie regolatorie e di segnalazione influenzate da una particolare mutazione senza che i dati siano influenzati dall'eterogeneità del campione. Questa tecnica consentirà la generazione scalabile di cellule staminali mesenchimali in vitro, eliminando la necessità di raccoglierle da donatori umani per differenziarle prontamente in adipociti, condrociti e osteociti per comprendere la patogenesi delle malattie correlate ai tessuti.
