Name: effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs
Uploaded: 2014-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
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Ringraziamo MR Helmus per la voce-over, CM Popelier, S. Ypenburg e C. Levesque per l&#39;assistenza tecnica. Questa ricerca è finanziata dalla Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO), la Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) e la Japan Student Services Organization (Jasso). Questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione Open Access di NWO a JMK.

1. Breeding Struttura <ol><li> Ottenere esemplari adulti di Lymnaea stagnalis (L.) da una coltura di laboratorio come quello di VU University. </li><li> Mantenere l&#39;acqua basso contenuto di rame a 20 ° C sia la funzione di allevamento (molluscarium) e vasche sperimentali, che hanno cambio continuo di acqua. </li><li> Impostare il ciclo luce / buio di 12 ore: 12 ore. </li><li> Per l&#39;allevamento, alimentare il lumache adulte senza pesticidi lattuga ad libitum, nutrire i giovani giovani con TetraPhyll (cibo per pesci) fiocchi. Mantenere lumache in serbatoi separati in base alla loro età, a partire da masse di uova che sono previste entro un lasso di tempo di 24 ore. </li><li> Una volta che le lumache vengono rimossi dalle vasche di allevamento non sono restituiti, al fine di evitare effetti di essere stati tenuti in condizioni leggermente diverse, nonché per evitare pseudoreplication. </li></ol> 2. Dissezione <ol><li> Isolare le lumache per 1 settimana, e di dar loro da mangiare ad libitum, per garantire that hanno il pieno sperma e negozi di liquido seminale. </li><li> Preparare un microscopio stereo, un piatto dissezione con perni, piccole forbici chirurgiche, pinze grossolane e fini, una siringa da 10 ml riempita con una soluzione di MgCl 2 a 50 mm, aghi da iniezione (0,3 mm x 13 mm) ed alcuni tovaglioli di carta. </li><li> Euthanize una lumaca iniettando MgCl 2 soluzione (generalmente 3 ml o più per le lumache adulti con una lunghezza guscio di 31,6 ± 2,1 mm e peso umido di 2,89 ± 0,55 g). Penetrare il piede con l&#39;ago di iniezione ad un angolo di 45 ° e iniettare applicando delicatamente pressione continuamente fino a quando la lumaca si rilassa e rimane estesa (in pochi secondi). Rimuovere l&#39;ago per l&#39;iniezione e verificare se la lumaca è eutanasia (per esempio, verificando se il riflesso di ritiro tentacolo è assente). </li><li> Rimuovere con attenzione il guscio dopo la sua curvatura mediante pinze grossolani. A metà strada, delicatamente staccare il muscolo columellare dalla shell raschiando con le pinze. Ruotare delicatamente tegli lumaca fuori dal suo guscio, seguendo la direzione di avvolgimento della conchiglia. </li><li> Posizionare la lumaca sul piatto dissezione e fissare l&#39;estremità posteriore del piede. Poi, posto un perno attraverso la testa e mettere qualche tensione sulla lumaca per facilitare la dissezione. </li><li> Localizzare il gonopore femminile, che sarà in seguito un punto di riferimento per la dissezione. </li><li> Utilizzando le forbici chirurgiche e pinza sottile, fare la prima incisione, appena sotto il bordo del mantello e tagliare verso il gonopore femmina. Quando una delle lame delle forbici viene spinto sotto la parete del corpo, sollevarlo leggermente per assicurare che solo la parete del corpo, e nessuno degli organi interni, viene tagliato. Continuare a tagliare sopra la gonopore verso la testa e tagliare in linea retta. </li><li> Localizzare la prostata (posteriore) e delle vescicole seminali (anteriori). Sezionare questi fuori con attenzione e tenerli su ghiaccio. Utilizzare questi per rendere le soluzioni di prova contenenti liquido seminale e / o sperma. Utilizzare fisiologico Lymnaea saline (5,83 mmol / L CaCl 2 · 2H 2 O, 3.76 mmol / L MgCl 2 · 6H 2 O, 42.69 mmol / L di NaCl, 37.53 mmol / L KCl) come mezzo di supporto. </li><li> Raccogliere il liquido seminale che è presente nel lume della prostata così come lo sperma dalle vescicole seminali. Successivamente, sospendere sia in soluzione salina in flaconcini separati esprimendo delicatamente il contenuto ed eliminare il tessuto organo con una pinza. Tenere su ghiaccio e utilizzare lo stesso giorno. Successivamente, mescolare queste sospensioni per creare diverse soluzioni di trattamento. </li></ol> 3. Intravaginale Injection <ol><li> Prima di avviare la procedura di iniezione intravaginale, preparare una silicio shell-stampo (per adattarsi alla punta del guscio) 1 mm siringhe, tubi 10-12 cm di silicio con un diametro di 1 mm, smussati aghi per iniezione (0,3 millimetri x 13 mm ), pinze grossolane e la stessa siringa da 10 ml riempita con una soluzione di 50 mM MgCl 2 con ago di iniezione tagliente. </li><li> Raccogliere lo sperma, necessaria per aggiungere al liquido seminale (o singole proteine ​​del liquido seminale) in alcuni trattamenti; una dose biologicamente rilevante pari a 1/3 di una ghiandola prostatica e vescicole seminali per iniezione. NOTA: Nella sezione risultati rappresentante (Figura 1) sono riportati i risultati di un esperimento con tre diversi trattamenti: Controllo (medio carrier, cioè, salina), Ovipostatin (una delle proteine ​​del liquido seminale identificate) solo e Ovipostatin accompagnato con lo sperma. Inoltre, per stimare la dose biologicamente rilevante in altre specie, determinare la differenza di peso della prostata di individui che hanno recentemente accoppiati e individui che sono rimasti sessualmente isolato 16. </li><li> Preparare 1 ml siringhe per ciascuna delle soluzioni di prova preparate. Riempire ogni siringa con una soluzione e garantire che non vi siano bolle d&#39;aria all&#39;interno. </li><li> Montare un ago per iniezione smussata su ogni siringa. </li><li> Per l&#39;iniezione utilizzare un 1mm tubo di silicone di diametro con una lunghezza minima di 10 cm. </li><li> Far scorrere delicatamente il tubo di silicone sopra l&#39;ago di iniezione, facendo attenzione a non forare il tubo, e rimuovere l&#39;aria dal tubo applicando delicatamente la pressione sulla siringa. </li><li> Anestetizzare una lumaca seguendo lo stesso protocollo di cui al punto 2.3. Questa volta, assicuratevi di non iniettare più di 2-3 ml di 50 mM MgCl 2. </li><li> Posare la lumaca nel guscio stampo per mantenerlo in una posizione stabile. </li><li> Individuare il gonopore femmina, che è chiaramente visibile come una macchia bianca sul lato destro dell&#39;animale, anteriore al tentacolo destra e gonopore maschio (descrizione vale anche per altre specie di lumache d&#39;acqua dolce). Assicurarsi di avere libero accesso. </li><li> Utilizzare una pinza per tenere l&#39;estremità del tubo di silicone e inserirla delicatamente circa 2-4 mm del tubo di silicone nella gonopore femmina. </li><li> Applicare con attenzione la pressione alla siringa e iniettare 0,03 ml della soluzione campione. Attendere mezzo minute per consentire la pressione nel tubo di diffondere nel tratto femmina prima di rimuovere il tubo. </li><li> Riportare la lumaca trattata per il suo contenitore isolamento, dove può essere monitorato, e permettono di recuperare dalla sedazione nel serbatoio sperimentale. </li></ol> 4. Bioassay <ol><li> Etichettare ogni lumaca per l&#39;identificazione e misurare la lunghezza della shell. Quest&#39;ultimo è un buon indicatore delle dimensioni, che è rilevante nella quantificazione capacità riproduttiva. </li><li> Mantenere ogni lumaca isolato in un contenitore 460 ml che è forata per consentire uno scambio di acqua all&#39;interno del serbatoio sperimentale. È importante posizionare tutti i contenitori e nella direzione corretta, con le perforazioni nella direzione del flusso d&#39;acqua, per consentire lo scambio di acqua efficiente. </li><li> Durante il saggio biologico, alimentare lumache regolarmente con una quantità standardizzata di lattuga. Utilizzare un round, perforatore in metallo per tagliare la lattuga. In questo protocollo vengono utilizzati dischi lattuga di 19,6 centimetri 2, che approssima l&#39;unamount che al massimo possono mangiare in un giorno. </li><li> Raccogliere una massa uovo con la parte piatta di una spatola e raschiare la massa uovo dalla parete del contenitore. Utilizzare il lato cucchiaio per raccogliere la massa di uova. NOTA: masse di uova opachi che sono appena stati stabiliti non possono essere utilizzati per la scansione (che diventano trasparenti entro poche ore dopo la posa). Per le specie modello in questo protocollo, stagnalis Lymnaea, verificare la presenza di masse di uova ogni giorno, dal momento che producono 2-3 masse di uova a settimana. Questo può differire in altre specie. </li><li> Eseguire la scansione delle masse di uova raccolte in digitale, utilizzando un (laptop) computer che contiene il driver dello scanner, uno scanner a letto piano, una scala millimetrica standard, una spatola, trasferire piatti e piastrelle in vetro. </li><li> Collocare ogni massa uovo sulle piastre di trasferimento e ripetere fino a quando le piastre sono pieni. Successivamente, tamponare le masse uovo secco su carta assorbente e trasferirli sulle piastrelle di vetro nello stesso ordine come sulle piastre di trasferimento. </li><li> Girare ogni piastrella a testa in giù (ilmasse di uova si attaccano alla piastrella di vetro) e posizionare con cura sullo scanner piano, proprio sotto la scala millimetrica. Applicare un po &#39;di pressione per appiattire le masse d&#39;uovo, che distribuirà le uova in modo uniforme in modo che siano tutte visibili all&#39;interno dello stesso piano di messa a fuoco. Montare le piastrelle con una quantità standardizzata di nastro intorno due bordi per assicurare che tutte le uova sono appiattite altrettanto. </li><li> Regolare le impostazioni dello scanner. E &#39;importante regolare la risoluzione al massimo, fare una scansione di anteprima, ritagliare l&#39;area di lavoro, e regolare la luminosità e il contrasto. Scansione le masse di uova. </li><li> Collocare ogni massa uovo nel suo marcato flaconcino di vetro da 20 ml per un ulteriore sviluppo e la schiusa. </li><li> Aggiornare l&#39;acqua in cova fiale ogni altro giorno per mantenere correttamente ossigenato. Fate questo in base al numero hatchling e dimensioni nell&#39;ordine seguente: decantazione / travaso (senza larve), traboccante (inizio della schiusa), ed estraendo l&#39;acqua con una pipetta (molti neonati). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Di misurazione e di conteggio uova <ol><li> Installare il software di analisi delle immagini ImageJ liberamente disponibili (NIH, USA) e il plugin contatore cella. </li><li> Aprire ImageJ nonché un programma di foglio per trasferire i dati. Poi aprire un&#39;immagine digitalizzata di masse di uova in ImageJ. </li><li> Impostare la scala utilizzando lo strumento zoom per passare alla scala millimetrica. Zoom in e regolare la finestra per 1 mm a riempire lo schermo. Tracciare una linea utilizzando lo strumento linea tra le due linee che indicano 1 mm. Passare per analizzare e impostare la scala. Nel menu a comparsa l&#39;opzione di lunghezza misurata diventa visibile, regolare la distanza Noto a 1 e unità di lunghezza fino a mm. Selezionare la casella globale, e chiudere la finestra. </li><li> Impostare le misure preferiti (lunghezza, larghezza, circonferenza) navigando per analizzare e impostare misure di Area e di Feret Diametro (lunghezza e larghezza) selezionando. Fare clic su OK per confermare e continuare con analizza l&#39;immagine. </li><li> Per misurare le uova, ZOom in su un uovo della prima massa uovo che deve essere misurato. Si raccomanda un ingrandimento del 800%. Quindi, utilizzando lo strumento ellittica disegnare un ovale esattamente intorno all&#39;uovo, premere Ctrl + D per disegnare la circonferenza sull&#39;immagine (per evitare che misura due volte lo stesso uovo). Quindi premere ctrl + M per registrare la misura delle proprietà del ovale (lunghezza, larghezza, circonferenza); una finestra pop-up si apre la visualizzazione delle misurazioni. NOTA: L&#39;utilizzo dello strumento ellittica per misurare le uova non si applica a tutte le specie. Per le specie con le uova a forma di non-uniforme, utilizzare invece le selezioni a mano libera. </li><li> Misurare quante più uova necessarie e quindi salvare le misure. Foglio xls. Facoltativamente, copiare i dati direttamente in un foglio di lavoro. </li><li> Successivamente contare le uova all&#39;interno di una massa d&#39;uovo, utilizzando la finestra del contatore e mettere i conti manualmente nel foglio di lavoro. </li><li> In alternativa, contare le singole uova per massa uovo con l&#39;aiuto della cella contatore plug-in. Per questo, passare a plug-in,poi, analizzare e selezionare Contatore di cellule. La finestra del contatore di cellule pop-up, controllare il &#39;keep originale&#39; box e premere &#39;inizializzazione&#39;. Viene visualizzata una nuova finestra del contatore, selezionare lo strumento mirino dalla barra degli strumenti e selezionare un tipo di contatore nel menu contatore cella. Contare le singole uova, cliccando sulle singole uova nella finestra del contatore cella. Osservare il conteggio totale accanto al tipo di contatore nel menu contatore cella. Copiare questo numero manualmente un foglio di calcolo o di ottenere i risultati premendo Risultati. </li><li> Contare multipli masse di uova entro un evento conteggio aggiungendo tipi di contatore, se necessario. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato mostra come raccogliere liquido seminale e come testare questa in modo biologicamente significativo. Anche se questa procedura viene qui indicata usando l&#39;estratto prostata, l&#39;effetto di una singola proteina liquido seminale purificato può anche essere testato secondo la stessa procedura. Ovviamente, in tali test è sempre fondamentale per comprendere adeguati controlli (trattamenti sham) per garantire che la procedura e / o supporto informatico non influenzano i parametri in questioni 14,16. Usando questo metodo, è già stato dimostrato che vi è una singola proteina liquido seminale, cioè Ovipostatin, che media una riduzione ovaiole 14,16. Questa proteina, prodotta nella prostata e trasferiti durante l&#39;accoppiamento con gli spermatozoi, rappresenta il primo componente liquido seminale caratterizzata completamente in un ermafrodita simultaneo e che, finora, non mostra alcuna somiglianza con proteine ​​note. La constatazione che Ovipostatin riduce la produzione di massa di uova nel ricevente corrobora lavoro precedente indica che le sostanze nel liquido seminale possono influenzare la deposizione delle uova 13-15. Trasferendo biologicamente importi rilevanti (vedi punto 3.2 16), si può dimostrare in modo convincente che si tratta di una proteina liquido seminale, e non la presenza di spermatozoi stessi, che media la riduzione osservata nella deposizione delle uova (Figura 1). Dato che ripetuta ricevimento del liquido seminale tramite accoppiamenti naturali aumenta l&#39;investimento per ogni uovo 15, diventa oggi molto rilevanti per quantificare altri parametri di deposizione delle uova. Il protocollo presentato ora fornisce i metodi necessari per farlo. Sebbene nessun effetto è stato trovato di Ovipostatin sulla schiusa successo delle uova deposte dal beneficiario 16, vi possono essere altre proteine ​​del liquido seminale che agiscono in concerto con questa proteina. Quindi, i parametri che devono essere quantificati in questo contesto - accanto alla posa numeri di frequenza e delle uova - includono la dimensione uovo, hatctempo Hing, sviluppo schiusa e le dimensioni schiusa. Inoltre, è possibile osservare effetti su altri processi di sesso femminile che la deposizione delle uova, come conservazione dello sperma e utilizzo, nonché l&#39;allocazione delle risorse verso la funzione riproduttiva femminile e maschile 14,17. Chiaramente, il metodo presentato è fondamentale per affrontare questi problemi followup, sia in Lymnaea stagnalis e in altre lumache d&#39;acqua dolce. In sintesi, esperimenti usando questo spettacolo protocollo trasferiti proteine ​​del liquido seminale influiscono sulle prestazioni riproduttivo femminile del destinatario in questi ermafroditi simultanei. Dato che pochi studi hanno affrontato questo, è probabile che sia molto più comune nella fertilizzazione internamente ermafroditi rispetto a quello attualmente in base alla letteratura scientifica. Soprattutto quando ci si rende conto che la scelta compagno pre-copula e competizione spermatica hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante in questi ermafroditi 14, che highlights il potenziale di tali proteine ​​ghiandole accessorie maschili da selezionare sessualmente in questo sistema. Infine, questa ricerca aiuta a sostenere l&#39;idea di sviluppo che le proteine ​​del liquido seminale sono di pari importanza per ermafroditi simultanei come lo sono per specie separate-sessuato.

Al momento del trasferimento, gli spermatozoi sono di solito accompagnata da liquido seminale prodotto dalle ghiandole accessorie maschili. Mentre alcuni componenti di eiaculato giocano ruoli in nutriente e attivando sperma 1, altri influenzano fisiologia femminile al fine di aumentare la fecondazione successo del donatore di sperma 2-4. Tali effetti sono particolarmente selezionati per, attraverso la selezione sessuale, quando una specie è altamente promiscua e ha efficiente conservazione dello sperma e sperma digestione. In tali condizioni, donatori di sperma competere pesantemente per la fecondazione delle uova 5. Mentre non vi sono abbondanti prove di correlazione per l&#39;importanza delle sostanze del liquido seminale per il successo fecondazione maschile, la prova diretta è più raro e pochi studi hanno approfondito i dettagli della modifica e / o sostanze coinvolte 6 fisiologico. In specie a sessi separati (cioè, maschi e femmine; gonochorists) ci sono alcuni modelli spe ben studiato,es quando si tratta di composizione liquido seminale e loro effetti. Gli esempi includono la mosca della frutta, Drosophila melanogaster 6, la zanzara della malaria, Anopheles gambiae 7, e la farina coleottero rosso, Tribolium castaneum 8. Tali studi liquido seminale sono molto più rari quando si tratta di specie che sono contemporaneamente ermafrodita (cioè, gli individui sono funzionalmente maschio e femmina allo stesso tempo), anche se questa modalità di riproduzione è comune in tutto il regno animale 9. L&#39;esempio ermafrodita più notevole del trasferimento di una sostanza ghiandola accessorio è probabilmente la fucilazione dei cosiddetti love-dardi in lumache di terra 2,10, in cui la sostanza viene trasferito dal donatore di sperma tramite iniezione ipodermica 11,12, vale a dire, non insieme con gli spermatozoi. Ma ci sono molti ermafroditi simultanei che trasferiscono i prodotti delle ghiandole accessorie maschili insieme a loro sperma,come le specie modello usato qui, il grande stagno lumaca Lymnaea stagnalis. Precedenti ricerche hanno già dimostrato che la ricevuta del liquido seminale influenza la capacità riproduttiva femminile di questa specie 13-15, e molte delle proteine ​​del liquido seminale coinvolte sono state identificate 16,17. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo, che è un&#39;estensione dei metodi riportati in Koene et al 16, è quello di testare gli effetti delle proteine ​​del liquido seminale su vari parametri di deposizione delle uova nei molluschi gasteropodi. Ciò si ottiene mediante dissezione della ghiandola prostatica (cioè, la ghiandola accessorio maschile che produce il liquido seminale) di lumache donatori sessualmente isolato da una coltura di laboratorio standardizzato. In secondo luogo, lo sperma del donatore viene raccolto da vescicole seminali e le diverse soluzioni di trattamento sono fatti. Successivamente, lumache prova sono anestetizzati e intravaginale iniettati con una soluzione di prova (per esempio,prostata estratto di ghiandola sola, estratto di ghiandola prostatica con lo sperma, solo sperma, supporto informatico da solo). Queste lumache prova vengono poi monitorati per i seguenti giorni o settimane, in condizioni standard, per registrare la deposizione delle uova. Masse di uova sono raccolti, scansionato digitalmente per contare e misurare diversi parametri, e poi mettere in singoli flaconcini da cova. Dopo circa due settimane, i piccoli sono contati e la scansione digitale. Tutte le scansioni, di entrambe le masse di uova e larve, vengono poi analizzati utilizzando un pacchetto software di analisi dell&#39;immagine liberamente disponibile. Per questo protocollo viene utilizzato il ceppo di laboratorio del grande lumaca stagno, stagnalis Lymnaea, che viene allevato presso VU University di Amsterdam. Questa specie serve come sistema modello per studiare le domande relative a selezione sessuale e la riproduzione in ermafroditi. Dimensioni relativamente grandi dell&#39;animale rende sperimentalmente molto accessibile. Inoltre, perché viene utilizzato come specie modello in molti bdiscipline iological abbiamo già conoscono molto circa la biologia di base di questi animali. Questo metodo permetterà di studiare le domande relative a processi di selezione sessuale che sono mediati attraverso le proteine ​​del liquido seminale in generale. Inoltre, perché questi sono ermafroditi simultanei, è possibile indirizzare se tali proteine ​​agiscono in modi simili e / o diversi come fanno in specie in cui i sessi sono separati 16,17.

<table><tbody><tr><td>Fish food flakes</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small surgical scissors</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse and fine forceps</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83 mmol/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two component Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing (diameter 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforated containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal leaf puncher (19.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula/spoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeter scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferring plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

In concimazione internamente animali, liquido seminale è normalmente aggiunto agli spermatozoi, insieme formando lo sperma o liquido seminale. Oltre sperma nutriente ed attivando, i componenti del liquido seminale possono anche influenzare fisiologia femminile per aumentare fecondazione successo del donatore di sperma. Mentre molti studi hanno riportato tali effetti in specie con sessi separati, pochi studi hanno affrontato questo in animali contemporaneamente ermafroditi. Questo protocollo video presenta un metodo per studiare gli effetti di liquido seminale in gasteropodi, utilizzando una lumaca d&#39;acqua dolce contemporaneamente ermafrodita, la grande lumaca stagno Lymnaea stagnalis, come organismo modello. Mentre la procedura è indicata con estratti completi prostata, singoli componenti (cioè, proteine, peptidi, ed altri composti) del liquido seminale possono essere testati nello stesso modo. Effetti della ricezione dei componenti eiaculare in deposizione delle uova possono essere quantificati in termini di frequenza di deposizione delle uova estime più sottili di prestazioni riproduttivo femminile come i numeri delle uova all&#39;interno di ogni masse di uova. I risultati mostrano che le proteine ​​del liquido seminale influenzano la capacità riproduttiva femminile in questo ermafrodita simultaneo, sottolineando la loro importanza per la selezione sessuale.

La figura 1 mostra la percentuale di animali che pongono uova dopo l&#39;iniezione intravaginale di una sostanza di controllo (soluzione salina), Ovipostatin, o Ovipostatin accompagnati con sperma. N = 15 per ogni trattamento; vedi Koene et al 16 per i dettagli e le statistiche (Fonte: Figura 3 da Koene et al 2010, PLoS ONE.).. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Effetto della Ovipostatin sulla produzione di massa di uova di Lymnaea stagnalis. Il grafico mostra la percentuale di animali che pongono uova dopo l&#39;iniezione intravaginale di una sostanza di controllo (soluzione salina), Ovipostatin, o Ovipostatin accompagnati con sperma. N = 15 per ogni trattamento; vedi Koene et al. 2010 dettagli e statistiche. Ristampa con il permesso di Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effetto di Male Accessory Gland prodotti in deposizione delle uova in gasteropodi

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Un metodo non invasivo per<em&gt; In situ</em&gt; Determinazione del successo di accoppiamento in americano femminile Aragoste (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Ricerca

Ambiente

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Biologia

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Separazione meccanica e solubilizzazione proteica dei sottostrati perivitellini esterni ed interni dalle uova di gallina

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Biochimica

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

Analisi dei prodotti di scissione della famiglia Transforming Growth Factor ß secreti nel blastocoelo di embrioni di Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Biologia dello sviluppo

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neuroscienze

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Due tipi di saggi per chemiotassi Frog rilevamento sperma

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A monte intero<em&gt; In Situ</em&gt; Metodo ibridazione per la molluschi gasteropodi<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

Standardizzazione di un metodo non letale per caratterizzare lo stato riproduttivo e lo sviluppo larvale delle cozze d'acqua dolce (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the induction of ovarian maturation is important to meet the consumer demand for mature mud crabs and hasten seed production. Eyestalk ablation is an effective tool to enhance ovarian maturation in mud crabs. However, there is no standard protocol for the eyestalk ablation of mud crabs. In this study, two eyestalk ablation techniques are described: cauterization (the use of hot metal to ablate the eyestalk of an anesthetized crab) and surgery (the removal of the eyestalk using surgical scissors). Before eyestalk ablation, sexually mature females (CW &#62; 86 mm) were anesthetized using an ice bag (&#8722;20 &#176;C) with seawater. When the water temperature reached 4 &#176;C, the ice bag was removed from the water. Flowing seawater (ambient temperature: 28 &#176;C) was used for recovery from the anesthesia immediately after eyestalk ablation. Mortality did not occur during or after the process of eyestalk ablation. The eyestalk ablation protocol presented here accelerated the ovarian maturation of the mud crabs.

Two eyestalk ablation protocols (i.e., cauterization and surgery&#160;approaches) were performed on anesthetized female crabs. The eyestalk ablation of mud crabs hastened the ripening of ovaries without decreasing the survival rate.

Ablazione del gambo oculare per aumentare la maturazione ovarica nei granchi del fango

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

Drosophila Male Accessory Gland Dissection: A Method to Isolate Secondary Cells

Source: Immarigeon, C., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60218/" target="_blank">A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the dissection of the accessory glands from male flies and shows an example in which the isolated gland will be dissociated into a single cell suspension.

drosofila Dissezione della ghiandola accessoria maschile: un metodo per isolare le cellule secondarie

Source: Immarigeon, C., et al. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (2019).
...

Effetto di Male Accessory Gland prodotti in deposizione delle uova in gasteropodi

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Un metodo non invasivo per