We thank Katherine Clark for technical assistance. A.D.R.G. is funded in part by 5K01MH097957-03

Adulti (3-4 mesi) topi maschi su un misto C57BL / 6 di fondo sono stati utilizzati in questo protocollo. Gli animali sono stati tenuti al 12 hr luce / buio ciclo, e consentito l&#39;accesso gratuito al cibo e all&#39;acqua. Tutte le procedure eseguite in questo protocollo sono stati condotti secondo protocolli approvati dalla University Istituzionale cura e l&#39;uso degli animali Comitato Drexel. 1. Preparazione Area Chirurgica <ol><li> Disinfettare tavolo operatorio con il 70% di etanolo, quindi coprire l&#39;intera panchina chirurgica con assorbenti e organizzare strumenti chirurgici adiacente stereotassica. </li><li> Impostare attrezzature stereotassico senza braccio manipolatore. Disporre il rilievo di riscaldamento sul stereotassica e impostato a 37 ° C. Evitare il surriscaldamento l&#39;animale mettendo un piccolo pezzo di carta assorbente o tampone chirurgica tra l&#39;animale e il rilievo di riscaldamento. </li><li> Utilizzando le forbici in autoclave, tagliare piccoli pezzi di Gelfoam autoclavato in una piastra di Petri sterile contenente soluzione fisiologica sterile allo 0,9% fino a ready all&#39;uso. Nota: Mantenere ambiente di lavoro sterile, utilizzando strumenti in autoclave e rifornimenti chirurgici sterili. Re-sterilizzare gli strumenti chirurgici durante la procedura o in tra gli animali mediante immersione in uno sterilizzatore tallone per 10-15 secondi, a seconda delle necessità. Mantenere guanti puliti durante l&#39;intera procedura sfregando le mani con il 70% di etanolo, se necessario, da disinfettare. </li></ol> 2. Prepping mouse per Chirurgia <ol><li> Rimuovere mouse dalla gabbia di casa e pesare (g). </li><li> Posizionare il mouse nella camera di induzione isoflurano e ossigeno impostata su 2 L / min e vaporizzatore isoflurano a 5 per indurre un piano chirurgico di anestesia, circa 3-5 minuti. Monitor per la respirazione rallentata e l&#39;immobilizzazione. Verificare che il mouse sia completamente sedato con la reflex pizzico piedi. </li><li> Quando il mouse è completamente sedato, metterli in telaio stereotassico, fissare il naso nel cono naso, che è collegato con un tubo alla isoflurano. Inserire barre di orecchio in canale uditivo e stringere, garantendo la testa è stabile. </li><li> Radere la testa da un orecchio all&#39;altro, e da mezzo agli occhi di dietro le orecchie. </li><li> Sterilizzare la pelle con alternanza di salviette di alcol isopropilico e soluzione betadine iodio, 3 volte ciascuno. </li><li> Applicare lacrime artificiali per entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante la procedura chirurgica. </li></ol> 3. Procedura chirurgica <ol><li> Monitorare la profondità dell&#39;anestesia pizzicando la punta o la coda. Il topo è nel piano chirurgica appropriata quando non vi è alcuna risposta, e la respirazione è lenta e uniforme. </li><li> Effettuare una incisione cutanea parasagittale da appena dietro gli occhi per quasi tra le orecchie in un unico movimento ferma con una lama n ° 11 bisturi. Spostare la pelle da parte e la clip a destra con pinza emostatica. </li><li> Cancella cranio di membrana sovrastante con il lato opaco del bisturi n ° 11 e il cotone punta applicatori. Facoltativamente, pulire il cranio con cotone applicatore capovolto immerso in soluzione salina allo 0,9%. Lasciare asciugare completamente. </li><li> Noiing un piccolo righello, segnare il bordo anteriore del craniotomia a 1 millimetro caudale alla sutura coronale, e il bordo sinistro del craniotomia a 1 mm lateralmente alla sutura sagittale (figura 1), con un pennarello indelebile. Quindi contrassegnare il bordo destro e caudale della craniotomia a 4 mm dal suture sagittali e coronali, rispettivamente (Figura 1). </li><li> Utilizzando una punta 0,5 millimetri, cominciare a fare craniotomia perforando lentamente seguendo il marcatore contorno permanente. Fare attenzione a non sfondare il cranio completamente. Premere delicatamente sul pezzo isolato di osso parietale con n ° 5 pinze, aree di debolezza darà modo alla pressione. Quando l&#39;osso assottigliata è sufficientemente debole per tutto il perimetro, il pezzo di osso è pronto per la rimozione. NOTA: Se la difficoltà esperienze investigatore rimuovendo l&#39;osso in un unico pezzo, questo suggerisce che l&#39;osso non era sufficientemente diluito durante la perforazione. Si consideri la foratura ulteriormente il cranio nelle successive animali al facilitafacile rimozione te del pezzo dell&#39;osso. </li><li> Usando una siringa da 10 ml munito di ago G 23, applicare una piccola quantità di soluzione fisiologica 0,9% per assorbire l&#39;osso isolata e zona forata. </li><li> Fissare il braccio manipolatore all&#39;apparecchiatura stereotassica. Collegare un nuovo n ° 11 bisturi al titolare sonda con il lato tagliente della lama rivolta verso rostralmente. NOTA: Sebbene i tessuti rostrale e caudale sperimentano gli spigoli smussati e della lama, rispettivamente, il danno meccanico indotto dalla ferita penetrante è comparabile in tutta l&#39;estensione della lesione. Osserviamo differenze apprezzabili caratteristiche principali di gliosi reattiva tra cui upregulation di espressione GFAP o la proliferazione, tra le sezioni rostrali e caudale. </li><li> Tenendo il braccio manipolatore di mezzo, sollevare con cautela l&#39;osso isolato con 5/45 pinze ad angolo. Inserire la punta della pinza nella parte dell&#39;osso isolata e ascensore, utilizzando la leva per tirare fuori il pezzo di osso lasciato in uno fulil movimento l. NOTA: Fare attenzione a non colpire il cervello o turbare la dura sotto il cranio. </li><li> Prendete un piccolo pezzo di schiuma gel assorbibile imbevuto e posizionare sul cervello scoperto per evitare che si secchi e assorbire il sangue che potrebbero essere presenti. </li><li> Una volta che la schiuma di gel è a posto, oscillare il braccio manipolatore in posizione e regolare lama centro craniotomia sopra la schiuma gel. Rimuovere la schiuma gel e abbassare la lama fino a quando la punta tocca la dura, senza pungere la dura. Mark dorsale / ventrale coordinate utilizzando il nonio sul braccio verticale della stereotassico. </li><li> Utilizzando il braccio manipolatore, abbassare lentamente la lama precisamente da 3 mm nel cervello. Ciò si ottiene utilizzando le marcature nonio sul braccio manipolatore. Lasciare lama per rimanere sul posto per 5-10 secondi. Portare il braccio stereotassica con attacco lama rostrale a caudale tre volte permettendo la lama per raggiungere i confini rostrale e caudale della craniotomia prima di passare alla opposifine te. NOTA: La dura non viene rimosso prima di inserire la lama. In contrasto con la dura madre ratto, che è ~ 80 micron di spessore 7, la dura mouse è considerevolmente più sottile (spessore di pochi strati di cellule) e non produce una resistenza apprezzabile bisturi durante l&#39;inserimento. Utilizzare una nuova lama di bisturi per ogni mouse per garantire che ogni animale riceve una lesione coerente. </li><li> Lentamente sollevare il braccio stereotassico, rimuovere la lama dal cervello. Dopo la rimozione della lama, immediatamente posto un altro pezzo di Gelfoam sulla superficie del cervello per assorbire qualsiasi eccesso di sangue o fluido. </li><li> Nel frattempo, smontare il braccio stereotassica e smaltire la lama n ° 11 bisturi. Una volta emorragia si è fermata, rimuovere il Gelfoam. </li><li> Chiudere la ferita sutura la pelle con sutura non riassorbibile, come ad esempio Ethilon o prolene. Le suture devono essere rimossi 9-10 giorni dopo l&#39;intervento. </li><li> Ritorna il mouse per la sua gabbia di casa, e lasciare il mouse per recuperare lentamente su un heating pad e monitor per eventuali segni di sofferenza. Il risveglio dall&#39;anestesia isofluorane indotta si verifica in genere entro 2-5 minuti dopo la rimozione dal isofluorane. Non lasciare l&#39;animale incustodito fino a quando non ha riconquistato recumbancy sternale. </li><li> Somministrare 0,5-1 ml di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea per garantire idratazione. </li></ol> Cura 4. post-chirurgico <ol><li> Seguire da vicino gli animali dopo l&#39;intervento fino al recupero dall&#39;anestesia, prima di tornare alla colonia. <ol><li> Per ridurre il dolore e il disagio post-operatorio, amministrare 0,05-0,1 mg / kg buprenorfina per iniezione ip immediatamente dopo la procedura. </li><li> Osservare gli animali per 2-3 giorni dopo l&#39;intervento per gravi segni di sofferenza, come i movimenti limitati, la mancanza di cura, o la perdita di peso. Eutanasia animali che dimostrano uno qualsiasi di questi segni di sofferenza e rimuovere dallo studio. </li></ol></li><li> Per esaminare istopatologia dei tessuti lesi, eutanasia animali da stanDard perfusione intracardial. <ol><li> Brevemente, anestetizzare animali con un sovradosaggio di ketamina / xilazina, quindi intracardiaca perfuso con 15-20 ml di NaCl allo 0,9%, o fino a quando il fegato è liberata di sangue, seguiti da 60 ml di 4% paraformaldeide a conclusione dell&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Sezionare cervelli e post-correzione per 2-4 ore in paraformaldeide al 4% prima del trasferimento a una soluzione di saccarosio al 30%. Cervelli sezione su un criostato a 40-60 micron, e il processo di procedure istologiche o immunoistochimiche standard, oppure come descritto in Garcia 8,9. </li></ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Cells+Contribute+to+Myelin+Degeneration+and+Axonopathic+Changes+in+Mice+Overexpressing+Proteolipid+Protein+in+Oligodendrocytes.">Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).</li><li>Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+systemic+inflammation+to+chronic+neurodegeneration.">Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration.</a> Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).</li><li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar.">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).</li><li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+beyond+the+glial+scar.">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Buffo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+progeny+of+reactive+gliosis:+A+source+of+multipotent+cells+in+the+injured+brain.">Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).</li><li>Sirko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+in+the+injured+brain+acquire+stem+cell+properties+in+response+to+sonic+hedgehog.+[corrected].">Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected].</a> Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

E &#39;fondamentale che il cranio o dura sottostante non vengano danneggiati durante la perforazione. Utilizzare una leggera pressione durante la perforazione al fine di garantire il cranio non è forato. Inoltre, si deve prestare attenzione mentre si solleva il pezzo del cranio per garantire la dura non è decollato con l&#39;osso. L&#39;infortunio prosencefalo pugnalata qui descritto modelli una ferita penetrante al SNC. Anche se meno clinicamente traducibile di modelli TBI come la FPI e C...

A major challenge for developing successful therapies to treat the injured CNS is an incomplete understanding of the complex multicellular events that are triggered by the trauma. Reactive astrocytes are gaining increasing recognition as a promising target for novel therapies1. Though historically regarded as hostile to neural repair, reactive astrocytes are now recognized as critical components of a complex, multicellular neuroprotective response that includes attenuation of inflammatory processes and limiting secondary damage and neurodegeneration2-6. Although the neuropathological characteristics of reactive gliosis have long been well defined, the cellular and molecular mechanisms regulating reactive gliosis, and the diverse array of downstream consequences remain poorly understood. Understanding the mechanisms that drive reactive gliosis, as well as the subsequent cellular and molecular events, is an important step towards developing strategies aimed at promoting the neuroprotective properties of reactive gliosis, while attenuating the detrimental effects. 
Here we demonstrate a method to induce severe reactive astrogliosis in the forebrain of adult mice using a stab injury. In contrast to other traumatic brain injury (TBI) models, such as controlled cortical impact (CCI) or fluid percussion injury (FPI), which require specialized equipment to produce an injury, the forebrain stab requires only a stereotaxic device to stabilize the head and a No. 11 scalpel blade. Thus the forebrain stab lesion model is more broadly accessible to a wide range of laboratories that do not have access to the specialized devices necessary for creating an FPI or CCI injury. The method described here enables investigators to reliably and reproducibly trigger a robust gliosis response to investigate subsequent cellular and molecular events. Once recovered from surgery, animals that have received a forebrain stab injury can survive for prolonged periods without the need for specialized care and can be returned to the colony for acute, intermediate, or chronic studies. Though less clinically translatable than FPI or CCI models of TBI, a forebrain lesion produced by a stab injury serves as a simple yet useful experimental model to investigate basic biological mechanisms underlying reactive gliosis and other neuropathological events following trauma to the CNS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotax</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>726049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>724950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel scalpel blade, #11</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>JOR581S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam sponge 12cmx7mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and other reagents</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution (brightfield) 
			Dilution (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>&#160;Z033429-2</td>
			<td>1:20k 
			1:1k</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shp anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:2k 
			1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated rabbit anti-sheep</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-6000</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 488 goat anti-rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 donkey anti-sheep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21099</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

triggering reactive gliosis in vivo by a forebrain stab injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Dato che gli animali sottoposti a questa procedura non richiedono periodi sopravvivenza specializzati cura post-operatorio, brevi o time-lungo termine sono facilmente incorporati nello studio, a seconda delle necessità di indagare patologie acute o croniche a seguito di infortunio. Caratteristiche principali di gliosi reattiva, come l&#39;up-regolazione di GFAP e l&#39;ipertrofia del soma, si può osservare come già 2-3 giorni dopo un trauma. La fase di picco della proliferazione di astrociti reattivi è nei giorni 3-...

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Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Attivazione reattiva Gliosi<em&gt; In Vivo</em&gt; Da un Forebrain Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

10.4K Views.  Drexel University. This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods. 