Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Genetica, Sviluppo e Biologia Cellulare e Iowa State University e dal NIH concedere EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner fornito commenti sul manoscritto.

Tutte le procedure di animali erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali alla Iowa State University e l&#39;Università del Maryland. 1. TALEN design <ol><li> Ingresso desiderato sequenza bersaglio di un sito web di progettazione TALEN. (Per esempio: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Ingresso scelto lunghezze degli array distanziale / ripetizione. <ol><li> Copiare la sequenza genomica nella casella &quot;Sequenza&quot;. </li><li> All&#39;interno della scheda &quot;Fornire personalizzato Spacer / RVD Lunghezze&quot; selezionare la lunghezza dello spaziatore e la lunghezza dell&#39;array. Nota: lunghezze Spacer di 15 paia di basi e ripetere le lunghezze degli array di 15-17 lavoro bene e fare il montaggio meno complessa. </li></ol></li><li> Selezionare una coppia TALEN. coppie Talen progettati intorno a un sito di enzima di restrizione unico permettono di genotipizzazione da enzima di restrizione digerireun prodotto di PCR. </li><li> Primer design per amplificare la regione genomica che circonda il sito di destinazione TALEN utilizzando un sito come Primer3 30-32. Quando la genotipizzazione con un enzima di restrizione, primer design per amplificare una regione che contiene il sito enzima di restrizione sola volta. Si raccomanda che questa regione è amplificato e sequenziato prima TALEN costruzione per identificare eventuali polimorfismi presenti in A. mexicanus popolazione laboratorio da utilizzare per microiniezione. </li></ol> 2. Montaggio TALEN (Modificata dal protocollo TALEN Kit) 33,34 Per ulteriori dettagli e la risoluzione dei problemi, consultare il protocollo 34. <ol><li> Preparare e la sequenza plasmidi necessari dal kit TALEN secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Impostare il # 1 Reazioni per reazioni A e B. Includere ripetere variabile diresidues (RVDS) 1-10 e la destinazione di pFUS_A vettore in reazione A. Includere RVDS 11- (N-1) e THe destinazione vettoriale pFUS_B (N-1) Reaction B dove N è il numero totale di RVDS in TALEN. <ol><li> Aggiungere a ciascuna reazione: 1 pl di ciascun plasmide contenente ciascuna RVD (100 ng / ml), il vettore di destinazione (100 ng / ml), 1 ml Bsa I restriction enzyme, 1 ml Bovine Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ml ligasi, 2 microlitri di tampone 10x ligasi e x microlitri di acqua, per un volume totale di 20 microlitri. Ad esempio, vedi Tabella 1. Nota: reazioni metà può anche essere usato. </li><li> Posizionare reazioni in un termociclatore ed eseguire il ciclo: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Incubare le reazioni con nucleasi. Per ogni reazione aggiungere 1 ml di 25 mM ATP e 1 ml nucleasi. Incubare le reazioni a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Trasforma reazioni. <ol><li> Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti. Nota: Homemade c competenteells possono essere utilizzati. Tuttavia, le cellule con bassa competenza può risultare in mancanza di colonie. <ol><li> Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per cinque minuti. Incubare le cellule per 30 secondi a 42 ° C. </li><li> Posizionare i tubi in ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 125 ml di brodo di Super ottimale con la repressione Cataboliti (SOC). Agitare le provette a 37 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con spectinomicina (50 ug / ml), X-gal e isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Grow O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Scegliere 2-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer pCR8_F1 e pCR8_R1 (Tabella 2). <ol><li> Fare un master mix dei reagenti. Ad esempio, vedere la tabella 3. </li><li> Scegli una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con spectinomicina(50 mg / ml). Posizionare 15 microlitri della master mix nella provetta con la colonia. </li><li> Eseguire il seguente programma PCR (Tabella 4) </li><li> Controllare la PCR (eseguire l&#39;intero volume) su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una banda alla dimensione prevista, nonché uno striscio e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33. </li><li> Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione. </li></ol></li><li> Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sequenza per verificare la sequenza TALEN con pCR8_F1 e pCR8_R1. Seguire i metodi descritti in precedenza 35. </li><li> Usando i cloni giusti verificati mediante sequenziamento, impostare la reazione # 2 (kit TALEN), che porrà le RVDS dei vettori A e B e la RVD finale nel vettore di destinazione. <ol><li> Preparare miscela per la reazione 2 (Tabella 5). Nota: Hareazioni lf possono essere utilizzati. </li><li> Mettere le reazioni in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Trasforma reazioni. <ol><li> Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti. <ol><li> Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per 5 min. Heat Shock le cellule per 30 secondi a 42 ° C. </li><li> Mettere i tubi in ghiaccio. Aggiungere 125 ml di SOC. Porre i tubi in un incubatore agitazione a 37 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con ampicillina (100 ug / ml), X-gal e IPTG. Grow O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Scegliere 1-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer TAL_F1 e TAL_R2 (Tabella 2). <ol><li> Fare una soluzione della polimerasi Mastermix, acqua e primer comedescritti nella Tabella 3. Scegliere una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con ampicillina (100 ug / ml). Posizionare 15 microlitri della soluzione nella provetta con la colonia. </li><li> Eseguire il programma di PCR (Tabella 6). </li><li> Controllare la PCR su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una sbavature e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33. </li><li> Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione. </li></ol></li><li> Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sequenza per verificare la sequenza TALEN con TAL_F1 e TAL_R2 seguendo i metodi descritti in precedenza 35. </li></ol> 3. mRNA Trascrizione di Talens <ol><li> Digest 4 mg di modello di sequenza-verificata con 2 ml Sac I per 2 ore a 37 ° C. </li&gt; <li> Eseguire 2 microlitri del plasmide Sac I digerito su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I plasmidi che sono correttamente digeriti mostreranno una singola banda. </li><li> Purificare il residuo plasmide Sac I digeriti seguendo il protocollo del kit di purificazione PCR. Lavare due volte con la soluzione di lavaggio prima di eluizione. Eluire in 30 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Seguire il protocollo standard per la produzione di T3 mRNA. <ol><li> Impostare reazioni metà con 0,5 mg di modello linearizzato (preparato in precedenza). Incubare a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di DNasi (incluso nel kit) e incubare a 37 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Purificare l&#39;mRNA, seguendo le istruzioni del produttore. Eluire in 30 acqua priva di nucleasi microlitri. </li><li> Eseguire un gel 1,5% mediante elettroforesi per controllare l&#39;mRNA. <ol><li> Pulire l&#39;apparato gel con un prodotto per eliminare la contaminazione RNasi e preparare un gel 1,2%. </li><li> Mix 1 ml di mRNA + 4 &amp;# 181; l priva di nucleasi acqua + 5 ml colorante glyoxyl carico. Incubare i campioni a 50 ° C per 30 min. Centrifugare le provette brevemente e posto sul ghiaccio prima di eseguire il gel. </li></ol></li><li> Controllare la concentrazione utilizzando un metodo di quantificazione concentrazioni di acidi nucleici e conservare l&#39;RNA in aliquote a -80 ° C. Scegli una dimensione un&#39;aliquota tale che l&#39;RNA non sia congelato / scongelato più di una volta. Nota: Le concentrazioni di 500-1000 ng / nl sono in genere ottenuti. RNA con una concentrazione inferiore può essere utilizzato fintanto che l&#39;integrità dell&#39;RNA è mantenuto (come valutato da una banda piuttosto che una macchia sul gel). </li></ol> 4. Iniettare Astianatte mexicanus embrioni con TALEN mRNA <ol><li> Preparare strumenti per l&#39;iniezione. <ol><li> Versare in piastre di iniezione versando 1,2% agarosio in acqua i pesci (acqua condizionata con bicarbonato di sodio e sale marino a pH 7,4 e conducibilità 700 mS) in una capsula di Petri. Mettere uno stampo (pezzo di plastica con le proiezioni per fare pozzi per i pesciuova) all&#39;interno del piatto. Rimuovere lo stampo quando l&#39;agarosio si è indurito e conservare a 4 ° C. Per ulteriori informazioni sullo stampo vedere 36. </li><li> Tirare aghi per l&#39;iniezione con un estrattore ago secondo le istruzioni del produttore. Nota: adeguata lunghezza dell&#39;ago è importante per preparazioni iniettabili. Aghi che sono troppo lunghi saranno troppo flessibile per iniezioni. Il protocollo per gli aghi che tirano varierà con le attrezzature utilizzate per tirare gli aghi. Un esempio di un ago appropriato è mostrato in Figura 1. Per la nostra attrezzatura, abbiamo tirare aghi che sono 5-6 cm di lunghezza, ed hanno un diametro esterno sulla punta di circa 0,011 millimetri quando rotto. Tuttavia, gli aghi devono essere calibrati (fase 4.3.4) per determinare la larghezza di apertura. Un esempio di programma per tirare gli aghi possono essere trovate nella Tabella 7. </li><li> Preparare pipette di vetro per il trasferimento di embrioni rompendo la pipetta in modo che l&#39;apertura è grande abbastanza per un uovo di passare attraverso. Fiamma fine rotto finonon è più tagliente. Nota: E &#39;importante utilizzare pipette di vetro e ciotole di vetro quando si lavora con A. uova mexicanus ed embrioni in quanto sono appiccicosi e aderirà alla plastica. </li></ol></li><li> Raccogliere 1-cell fase Uova. <ol><li> Razza A. mexicanus seguendo protocolli standard 37. Nota: Per esempio, se i pesci sono mantenuti su un 14 luce: buio ciclo 10 ed usando tempo Zeitgerber (ZT) con ZT0 come luci accese e ZT14 come luci spente, il nostro uova di pesce di superficie tra ZT15 e ZT19. momento della riproduzione esatta deve essere determinata per ogni singolo laboratorio. </li><li> Indurre la deposizione delle uova da sovralimentazione pesce per 3-4 giorni prima dell&#39;accoppiamento e l&#39;immissione di pesci in acqua dolce. Sollevare il ° C di temperatura 2. Nota: La nostra temperatura dell&#39;acqua iniziale è di circa 74 ° C. </li><li> Raccogliere uova di pesce di superficie al buio, controllando ogni 15 minuti per ottenere le uova nella fase 1 delle cellule. Centinaia di uova possono essere ottenuti da una singola coppia di pesci di superficie. </li><li> Collezionareuova in ciotole di vetro per evitare che si attacchi alle superfici di plastica e sorta per isolare gli embrioni allo stadio di 1 cella di prima dell&#39;iniezione osservando le uova sotto il microscopio e raccogliere le uova che sono una singola cella. Conservare le uova in acqua dolce sistema (serbatoio di acqua in cui sono alloggiati i pesci adulti, che è stato trattato per pH e conducibilità). </li></ol></li><li> Iniettare TALEN mRNA. <ol><li> Iniettare diverse quantità di mRNA totale (quantità uguali di ciascun TALEN in coppia) per determinare la concentrazione ottimale per l&#39;iniezione la tossicità e l&#39;efficacia variano dagli accoppiamenti TALEN. Inizia iniettando concentrazioni di mRNA totale che sono 400-800 pg. Diluire e combinare mRNA a concentrazioni desiderate per l&#39;iniezione di 1,5 nl. </li><li> Carico diluito mRNA nella parte posteriore dell&#39;ago e collegare l&#39;ago a un micro-iniettore. </li><li> Rompere l&#39;ago con pinze. </li><li> Calibrare l&#39;ago. Ad esempio, espellere 10 volte e raccogliere il calo conseguente micro capillare. Per 10 x 100 usa e getta 1.081; l, 32 millimetri micro capillare, il calo dovrebbe riempire il micro capillare a 0,5 mm per 1,5 NL / 1 iniezione. Regolare il tempo di iniezione e la pressione necessaria. </li><li> Inserire l&#39;ago nella singola cella e iniettare l&#39;mRNA. Iniettare il mRNA direttamente nella cella, non nel tuorlo. </li><li> Raccogliere embrioni iniettati in ciotole di vetro. Mantenere gli embrioni a 23-25 ​​° C. Rimuovere gli embrioni morti (gli embrioni che diventano nuvoloso e di forma irregolare) regolarmente per i primi giorni dopo l&#39;iniezione. Un numero record di embrioni morti e deformi da controllo (uninjected) e le piastre iniettato. Nota: La maggiore concentrazione di mRNA può portare ad un aumento della tossicità e la deformità / la morte degli embrioni. Così, tossicità rispetto efficienza deve essere bilanciato per determinare la migliore concentrazione di mRNA per iniettare. </li></ol></li></ol> 5. fenotipo Fondatore Pesce e valutare l&#39;efficienza TALEN <ol><li> Sacrificare embrioni in base al protocollo animali istituzionale. Nota: eutanasiaembrioni rapidamente raffreddato su ghiaccio. </li><li> Raccogliere gli embrioni in 0,8 microlitri tubi striscia PCR utilizzando una pipetta di trasferimento. Nota: La genotipizzazione può essere eseguita su singoli embrioni o gli aggregati di embrioni. </li><li> Estrarre il DNA. <ol><li> Inserire embrioni in 100 ml di idrossido di 50 mM di sodio (NaOH) e incubare a 95 ° C per 30 minuti, poi raffreddare a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1/10 del volume (10 ml) di 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Eseguire una PCR sulla regione utilizzando i primer disegnati in fase 1.3 (vedi tabelle 8 e 9 per i protocolli di esempio). Per i singoli embrioni 1 ml di DNA è sufficiente per la reazione PCR. </li><li> Digerire il prodotto di PCR risultante con l&#39;enzima di restrizione appropriato ed eseguire un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. <ol><li> Ad esempio, per la genotipizzazione del locus oculocutaneous albinism 2 (OCA2) in embrioni iniettati digerire il prodotto di PCR utilizzando l&#39;enzima di restrizione Bsr I aggiungendo 0.5 Ml di Bsr io direttamente a 12,5 ml di reazione PCR completato, incubazione a 65 ° C per 2 ore. Eseguire il digerito e il prodotto digerito su un gel. Bande resistenti enzima di restrizione (cioè, gruppi che non digeriscono) indicano che le mutazioni TALEN-indotte sono presenti (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opzionale) Calcolare tasso di mutazione percentuale determinando la percentuale del prodotto non tagliato analizzando le immagini di gel in Fiji 38 utilizzando lo strumento di analisi di gel per calcolare il valore di intensità di ogni banda come descritto in precedenza 29. </li><li> Determinare la sequenza di alleli mutanti da TA clonazione della banda mutante resistente gel purificato l&#39;enzima di restrizione e sequenziamento cloni. <ol><li> Gel purificare l&#39;enzima di restrizione banda mutante resistente seguendo le istruzioni del produttore. TA clonare la band seguendo le istruzioni del produttore. Scegli colonie e crescere in 1,5 ml LB O / N a 37 ° C in agitazioneincubatrice. </li><li> culture Miniprep seguito le istruzioni del produttore. Invia il DNA per il sequenziamento. </li><li> Utilizzando un programma come scimmia, allineare le sequenze mutanti alla sequenza di tipo selvatico. <ol><li> Copia e incolla entrambe le sequenze in file APE. Scegliere lo strumento &quot;allineare due sequenze&quot; dal menu &quot;Strumenti&quot;. </li><li> Specificare le due sequenze di DNA utilizzando i menu a discesa. Nota: Il complemento inverso della sequenza clonata può essere necessario utilizzare a seconda della direzione della PCR è andato nel vettore di clonazione. Se le sequenze non si allineano, ripetere i passaggi selezionando la casella &quot;Rev-Com&quot; nella casella &quot;Allinea DNA&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Valutare pesce fondatore di fenotipi in fase appropriata e con metodi adeguati per il fenotipo atteso 29 (Ad esempio, la Figura 3). Metodi di fenotipizzazione saranno basate sul fenotipo atteso per il gene bersaglio dal ricercatore utilizzando il ProtoColo. </li></ol> 6. schermo per la trasmissione germinale Nota: A. mexicanus raggiungere la maturità sessuale a 4-8 mesi. <ol><li> Attraversate pesce fondatore sessualmente maturi per i pesci wild type. </li><li> Embrioni schermo o pesci adulti con metodi a passi 5.1-5.7 (figura 4). Per i pesci adulti, un pezzo della coda può essere agganciato dopo anestesia. <ol><li> Anestetizzare pesce sommergendo pesci in una soluzione di tricaine (acido 3-aminobenzoico etil estere) per ridurre lo stress durante amputazione delle pinne. In seguito fin ritaglio, permettono di recuperare il pesce in acqua dolce. Pesce recuperare rapidamente; osservare fino a che non hanno recuperato (sono il nuoto normalmente). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Grandi passi avanti sono stati compiuti negli ultimi anni verso la comprensione delle basi genetiche dell&#39;evoluzione dei tratti. Mentre sono stati identificati geni candidati sottostanti l&#39;evoluzione di un certo numero di tratti, è rimasta impegnativo per testare questi geni in vivo a causa della mancanza di trattabilità genetica di specie più interessanti evolutivamente. Qui riportiamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus, una specie utilizzate per studiare l&#39;evoluzione ...

La comprensione delle basi genetiche dell&#39;evoluzione tratto è un obiettivo di ricerca critica di biologi evoluzionisti. Notevoli progressi sono stati fatti per identificare loci sottostanti l&#39;evoluzione dei tratti e individuare geni candidati all&#39;interno di questi loci (ad esempio 1-3). Tuttavia, funzionalmente testare il ruolo di questi geni è rimasta sfidando come molti organismi utilizzati per studiare l&#39;evoluzione dei tratti non sono attualmente geneticamente trattabili. L&#39;avvento delle tecnologie di editing genoma è notevolmente aumentato manipolabilità genetica di una vasta gamma di organismi. Trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens) e cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPRs) sono stati utilizzati per generare mutazioni nei geni mirati in una serie di organismi (ad esempio 4-11). Questi strumenti, applicati ad un sistema evolutivamente rilevanti, hanno il potenziale per rivoluzionare il modo in cui i biologi evoluzionisti studiare le basi genetiche dell&#39;evoluzione. Astianatte mexicanus è una specie di pesci che esiste in due forme:. Un fiume-dimora forma di superficie (pesce di superficie) e molteplici forme cavernicoli (cavefish) A. mexicanus cavefish si è evoluta da antenati dei pesci di superficie (recensito in 12). Le popolazioni di cavefish hanno sviluppato un certo numero di caratteristiche tra cui la perdita degli occhi, diminuzione o perdita della pigmentazione, aumento del numero di papille gustative e neuromasti cranici, e cambiamenti nel comportamento come la perdita di comportamento scolastico, maggiore aggressività, cambiamenti di alimentazione postura e iperfagia 13 -19. Cavefish e pesce di superficie sono interfertili, e gli esperimenti di mappatura genetica sono stati effettuati per identificare loci e geni candidati per i tratti rupestri 1,20-26. Alcuni geni candidati sono stati testati per un ruolo funzionale nel contribuire a tratti rupestri in coltura cellulare 1,19, in organismi modello di altre specie di 21 o da 27 o sovraespressione atterramento transitoria ucantare morpholinos 28 in A. mexicanus. Tuttavia, ciascuno di questi metodi ha limitazioni. La capacità di generare alleli mutanti di questi geni in A. mexicanus è fondamentale per comprendere la loro funzione nell&#39;evoluzione del cavefish. Così, A. mexicanus è un organismo candidato ideale per l&#39;applicazione di tecnologie di modifica del genoma. Qui descriviamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus utilizzando Talens. Questo metodo può essere utilizzato per valutare mosaico iniettato pesce fondatore per fenotipi e per isolare le linee di pesce con mutazioni nei geni stabili di interesse 29.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (ordered through Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1,000x solution)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bsa&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>provided with restriction enzymes</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Quick ligation kit</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Esp&lt;/em&gt; 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (Ordered through Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sac&lt;/em&gt; I</td><td>Promega (Ordered through Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&amp;nbsp;</td><td>Ambion (ordered through Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (ordered through Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (ordered through Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Talen coppia iniezioni provocano vincolante delle RVDS a specifici nucleotidi del DNA e quindi dimerizzazione di domini FokI, con conseguente rotture a doppia elica 39, che possono essere riparati attraverso non omologhe fine di entrare (NHEJ). NHEJ spesso introduce errori che si traducono in inserzioni o delezioni (indels). Indels possono essere identificati amplificando la regione circostante il sito di destinazione TALEN e digerire l&#39;amplicone risultante con un...

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesi è ora possibile in una vasta gamma di organismi che utilizzano tecniche di editing genoma. Qui, dimostriamo un protocollo per la mutagenesi genica mirata utilizzando trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) in Astianatte mexicanus, una specie di pesci che comprende pesce di superficie e cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Mexicanus Astianatte</em&gt; Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

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Video: Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Ricerca

Genetica

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Biologia dello sviluppo

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Genome Editing in

Riepilogo

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