Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Genética, Desenvolvimento e Biologia Celular e Iowa State University e pelo NIH concessão EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner fornecida comentários sobre o manuscrito.

Todos os procedimentos com animais estavam de acordo com as orientações dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use em Iowa State University e da Universidade de Maryland. 1. TALEN projeto <ol><li> Entrada desejada sequência alvo para um site de design TALEN. (Por exemplo: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Entrada escolhida comprimentos de matriz espaçador / repetição. <ol><li> Copie a sequência genómica na caixa chamada &quot;seqüência&quot;. </li><li> Dentro da aba &quot;fornecer personalizado Spacer / RVD Comprimentos&quot;, selecione o comprimento do espaçador e comprimento da matriz. Nota: comprimentos de espaçador de 15 pares de bases e repetir comprimentos de matriz de 15-17 de trabalho bem e fazer a montagem menos complexo. </li></ol></li><li> Escolha um par TALEN. pares TALEN concebidos em torno de um local de enzima de restrição único para permitir a genotipagem por digestão com enzimas de restriçãoum produto de PCR. </li><li> Projeto primers para amplificar a região genômica em torno do local alvo TALEN usando um site como Primer3 30-32. Quando a genotipagem com uma enzima de restrição, de concepção iniciadores para amplificar uma região que contém o local de enzima de restrição de uma única vez. Recomenda-se que esta região é amplificado e sequenciado antes da construção TALEN para identificar quaisquer polimorfismos presentes na A. mexicanus população laboratório para ser usado para microinjecção. </li></ol> 2. Montagem TALEN (modificado a partir do Protocolo TALEN Kit) 33,34 Para obter detalhes adicionais e solução de problemas, consulte o protocolo 34. <ol><li> Preparar e sequenciar os plasmídeos necessários a partir do kit de TALEN de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Configure o # 1 Reacções para as reacções A e B. Incluir repetir-variáveis ​​diresidues (RVDS) 1-10 eo pFUS_A destino vector na Reacção A. Incluir RVDS 11- (N-1) e the destino vector pFUS_B (N-1) na Reacção B, em que N é o número total de RVDS na TALEN. <ol><li> Adicionar a cada reacção: 1 uL de cada um dos plasmídeos contendo cada RVD (100 ng / ul), o vector de destino (100 ng / uL), 1 ul Bsa I da enzima de restrição, 1 ul de Albumina de Soro Bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul de ligase, 2 ul de tampão ligase 10x e X ul de água para um volume total de 20 ul. Por exemplo, ver Tabela 1. Nota: Meio reacções também podem ser usados. </li><li> Coloque reacções num termociclador e executar o ciclo: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Incubam-se as reacções com a nuclease. Para cada reacção de adicionar 1 ul de ATP 25 mM e 1 uL de nuclease. Incubar as reacções a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Transformar reações. <ol><li> Transformação com 2,5 ul de cada reacção em 25 ul de células competentes quimicamente. Nota: caseiro c competenteells pode ser usado. No entanto, as células com competência baixa pode resultar em falta de colónias. <ol><li> Misture 2,5 ul da reacção com 25 ul de células competentes quimicamente. Incubar em gelo durante cinco min. Incubam-se as células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar os tubos em gelo durante 2 min. Adicionar 125 mL de Super Optimal caldo com repressão catabólica (SOC). Agitar os tubos a 37 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Placa de 100 ul das células transformadas em placas de LB com espectinomicina (50 ug / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Cresça O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escolha 2-3 colónias brancas para cada reacção e verificar pela colônia PCR usando primers pCR8_F1 e pCR8_R1 (Tabela 2). <ol><li> Faça uma mistura mestre dos reagentes. Por exemplo, ver Tabela 3. </li><li> Escolha uma colônia e manchá-lo no fundo de um tubo PCR, e depois colocar os restos da colônia em 2 ml LB com espectinomicina(50 ug / ml). Colocar 15 ul da mistura principal para dentro do tubo com a colónia. </li><li> Executar o seguinte programa de PCR (Tabela 4) </li><li> Verifique a PCR (executado de todo o volume) num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os clones correctos terão uma banda com o tamanho esperado, bem como uma mancha e uma escada de bandas. Para um exemplo de o esfregaço adequado, consulte 34,33. </li><li> Cresça 2 ml de culturas dos clones correctos em meio LB O / N a 37 ° C numa incubadora com agitação. </li></ol></li><li> Miniprep os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Sequência de verificar sequência TALEN com pCR8_F1 e pCR8_R1. Siga métodos previamente descritos 35. </li><li> Utilizando os clones correctos verificados por sequenciação, definir-se a reacção # 2 (TALEN kit), que irá colocar os RVDS a partir dos vectores A e B e a RVD final para o vector de destino. <ol><li> Prepare a mistura de reacção 2 (Tabela 5). Nota: Hareacções LF pode ser usado. </li><li> Coloque as reacções num termociclador e executar o seguinte programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Transformar reações. <ol><li> Transformação com 2,5 ul de cada reacção em 25 ul de células competentes quimicamente. <ol><li> Misture 2,5 ul da reacção com 25 ul de células competentes quimicamente. Incubar em gelo durante 5 min. Choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar os tubos em gelo. Adicionar 125 ul de SOC. Colocar os tubos em um incubador com agitação a 37 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Placa de 100 ul das células transformadas em placas de LB com ampicilina (100 ug / ml), X-gal e IPTG. Crescer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escolha 1-3 colónias brancas para cada reacção e verificar pela colônia PCR usando primers TAL_F1 e TAL_R2 (Tabela 2). <ol><li> Adicione uma solução do mastermix polimerase, e iniciadores como águadescrita na Tabela 3. Escolher uma colónia e esfregaço-o no fundo de um tubo de PCR, e em seguida colocar os restos da colónia em 2 ml de LB com ampicilina (100 ug / ml). Colocar 15 ul da solução no tubo com a colónia. </li><li> Executar o programa de PCR (Tabela 6). </li><li> Verifique a PCR num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os clones correctos terão um manchas e uma escada de bandas. Para um exemplo de o esfregaço adequado, consulte 34,33. </li><li> Cresça 2 ml de culturas dos clones correctos em meio LB O / N a 37 ° C numa incubadora com agitação. </li></ol></li><li> Miniprep os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Sequência de verificar sequência TALEN com TAL_F1 e TAL_R2 seguindo os métodos descritos anteriormente 35. </li></ol> 3. A transcrição de ARNm TALENS <ol><li> Digerir 4 ug do modelo verificou-sequência com 2 ul Sac I durante 2 horas a 37 ° C. </li&gt; <li> Executar 2 ul do plasmídeo Sac I digerido num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os plasmídeos que são correctamente digeridos irá exibir uma única banda. </li><li> Purifica-se o plasmídeo restante Sac I digerido seguindo o protocolo do kit de purificação de PCR. Lavar duas vezes com a solução de lavagem antes da eluição. Eluir em 30 mL de água livre de nuclease. </li><li> Siga o protocolo padrão para a produção de mRNA T3. <ol><li> Configurar meias reações usando 0,5 mg de modelo linearizado (preparado acima). Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Adicionar 0,5 ul de ADNase (incluído no estojo) e incubar a 37 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> Purifica-se o ARNm, seguindo as instruções do fabricante. Eluir em 30 de água livre de nuclease ul. </li><li> Executar um gel de agarose a 1,5% por electroforese para verificar o ARNm. <ol><li> Limpar o aparelho de gel com um produto para eliminar a contaminação com RNase e preparar um gel de 1,2%. </li><li> Mix 1 mRNA ul + 4 &amp;# 181; l livre de nuclease de água + 5 jul glioxil carga de corante. Incubar as amostras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar os tubos de forma breve e colocar no gelo antes de executar o gel. </li></ol></li><li> Verifique a concentração, utilizando um método de quantificação de concentrações de ácidos nucleicos e armazenar o ARN em alíquotas a -80 ° C. Escolha um tamanho de alíquota de tal forma que o RNA não está congelado / descongelado mais de uma vez. Nota: As concentrações de 500-1000 ng / nl são tipicamente obtidas. ARN com uma concentração mais baixa pode ser usado, desde que a integridade de ARN é mantida (como avaliado por uma banda em vez de um esfregaço no gel). </li></ol> 4. Inject Astyanax mexicanus embriões com mRNA TALEN <ol><li> Prepare Ferramentas para injecção. <ol><li> Verter em placas de injecção por vazamento de 1,2% de agarose em peixes de água (água condicionada com bicarbonato de sódio e sal do mar para um pH de 7,4 e condutividade de 700 mS) numa placa de Petri. Coloque um molde (pedaço de plástico com as projeções para fazer poços para peixesovos) no interior do prato. Retirar o molde quando a agarose endureceu e armazenar a 4 ° C. Para mais detalhes sobre o molde ver 36. </li><li> Puxar agulhas para injecção, utilizando um extractor de agulha de acordo com as instruções do fabricante. Nota: comprimento da agulha adequada é importante para injectáveis. Agulhas que estão muito tempo vai ser muito flexível para injectáveis. O protocolo para as agulhas que puxam irá variar com o equipamento usado para puxar agulhas. Um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 1. Para o nosso equipamento, que puxar agulhas que são 5-6 cm de comprimento, e tem um diâmetro externo na ponta de cerca de 0,011 milímetros quando quebrado. No entanto, as agulhas devem ser calibrados (passo 4.3.4) para determinar a largura de abertura. Um programa de exemplo para puxar as agulhas podem ser encontrados na Tabela 7. </li><li> Prepare pipetas de vidro para transferência de embriões por quebrar a pipeta de modo que a abertura é grande o suficiente para um ovo para passar. Inflamar o final quebrado atéele não é mais acentuado. Nota: É importante o uso de pipetas de vidro e taças de vidro quando se trabalha com A. mexicanus ovos embriões e como eles são pegajoso e irá aderir ao plástico. </li></ol></li><li> Recolha 1 de células Stage ovos. <ol><li> Raça A. mexicanus seguindo protocolos convencionais 37. Nota: Por exemplo, se os peixes são mantidos em um 14 luz: ciclo escuro 10 e usando o tempo Zeitgerber (ZT) com ZT0 como luzes acesas e ZT14 como luzes apagadas, a desova de peixes de superfície entre ZT15 e ZT19. época de reprodução exata deve ser determinada para cada laboratório individual. </li><li> Induzir a desova por superalimentação de peixe por 3-4 dias antes do acasalamento e colocando peixe em água doce. Elevar a temperatura ° F 2. Nota: Nossa temperatura inicial da água é de aproximadamente 74 ° F. </li><li> Recolher os ovos de peixes de superfície no escuro, verificando a cada 15 min para obter ovos na fase 1 célula. Centenas de ovos pode ser obtido a partir de um único par de peixes de superfície. </li><li> coletarovos em tigelas de vidro para impedir que adere a superfícies de plástico e tipo, para isolar os embriões na fase de uma célula antes da injecção por meio da observação de ovos sob o microscópio e recolhendo ovos que são de uma única célula. Mantenha os ovos em água doce sistema (água do tanque em que os peixes adultos estão alojados, que foi tratada para pH e condutividade). </li></ol></li><li> Injetar mRNA TALEN. <ol><li> Injectar diferentes quantidades de ARNm total (quantidades iguais de cada TALEN no par) para determinar a concentração óptima para a injecção como toxicidade e eficiência variar por TALEN par. Comece por injecção de concentrações de ARNm total que são 400-800 pg. Dilui-se e combinar ARNm para as concentrações desejadas para a injecção de 1,5 nl. </li><li> Carga diluída ARNm na parte de trás da agulha e colocar a agulha uma micro-injector. </li><li> Quebrar a agulha com a pinça. </li><li> Calibrar a agulha. Por exemplo, ejectar 10 vezes e recolher a queda, resultando em um micro capilar. Para 10 100 x 1,0 descartável81; l, 32 milímetros micro capilar, a gota deve preencher o micro capilar até 0,5 mm para 1,5 nl / 1 injecção. Ajuste o tempo de injeção e pressão conforme necessário. </li><li> Insira a agulha na única célula e injetar o mRNA. Injectar o ARNm directamente para dentro da célula, não na gema. </li><li> Coletar embriões injetados em taças de vidro. Manter os embriões em 23-25 ​​° C. Remover embriões mortos (embriões que se tornam nublado e de forma irregular) regularmente para os primeiros dias após a injecção. Um número recorde de embriões mortos e deformados de controle (não injectada) e as placas injetado. Nota: O aumento da concentração de mRNA pode levar ao aumento da toxicidade e deformidade / morte de embriões. Assim, a toxicidade contra eficiência devem ser equilibradas para determinar a melhor concentração de ARNm para injectar. </li></ol></li></ol> 5. Fenótipo Peixe Fundador e avaliar a eficiência TALEN <ol><li> Sacrificar embriões acordo com o protocolo animais institucional. Nota: Nós eutanásiaembriões de arrefecimento rápido em gelo. </li><li> Coletar embriões em 0,8 ul de PCR tubos tira utilizando uma pipeta de transferência. Nota: A genotipagem pode ser realizada em embriões ou conjuntos de embriões individuais. </li><li> Extrair DNA. <ol><li> Coloque embriões em 100 ul de hidróxido de sódio 50 mM (NaOH) e incubar a 95 ° C durante 30 min, depois arrefece-se a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1/10 volume de (10 ul) de Tris-HCl 1 M pH 8. </li></ol></li><li> Realizar uma PCR para a região utilizando os primers desenhados no passo 1.3 (ver Tabelas 8 e 9 para os protocolos de amostra). Para os embriões individuais 1 uL de ADN é suficiente para a reacção de PCR. </li><li> Digerir o produto de PCR resultante, com a enzima de restrição apropriada e correr um gel de agarose a 1,5% por electroforese. <ol><li> Por exemplo, para a genotipagem do locus albinismo oculocutâneo 2 (OCA2) em embriões injectados digerir o produto de RCP, utilizando o enzima de restrição Bsr I por adição de 0.5 Ul de Bsr I directamente a 12,5 uL da reacção de PCR concluída, incubando a 65 ° C durante 2 h. Executar o não digerido e o produto digerido num gel. Bandas resistente a enzimas de restrição (ou seja, as bandas que não digerem) indicam que as mutações induzidas TALEN estão presentes (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opcional) Calcular a taxa de mutação percentagem por determinação da percentagem de produto não cortado através da análise de imagens de geles em Fiji 38 usando a ferramenta de análise em gel para calcular o valor de intensidade de cada banda 29, como descrito anteriormente. </li><li> Determinar a sequência de alelos mutantes de clonagem TA por a banda mutante resistente purificado em gel de enzima de restrição e sequenciação de clones. <ol><li> Gel purificar a enzima de restrição banda mutante resistente seguindo as instruções do fabricante. TA clonar a banda seguindo as instruções do fabricante. Escolha colónias e crescer em 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C em uma agitaçãoincubadora. </li><li> culturas Miniprep seguindo as instruções do fabricante. Envia o DNA para sequenciamento. </li><li> Usando um programa como o macaco, alinhar as sequências mutantes para a sequência do tipo selvagem. <ol><li> Copiar e colar as duas seqüências em arquivos de macaco. Escolha a opção &quot;Alinhar duas sequências de&quot; ferramenta a partir do menu &quot;Ferramentas&quot;. </li><li> Especificar as duas sequências de ADN usando os menus suspensos. Nota: o complemento reverso da sequência clonada pode precisar de ser utilizado, dependendo do sentido da PCR foi para o vector de clonagem. Se as sequências não se alinham, repita os passos de marcar a caixa &quot;Rev-Com&quot; na caixa &quot;DNA Align&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Avaliar peixes fundador de fenótipos na fase adequada e utilizando métodos adequados para o fenótipo esperado 29 (Por exemplo, a Figura 3). Os métodos de fenotipagem será com base no fenótipo esperado para o gene alvo pelo investigador utilizando a PROTOCol. </li></ol> 6. Tela de transmissão germinal Nota: A. mexicanus atingem a maturidade sexual aos 4-8 meses. <ol><li> Cruzar um peixe fundador sexualmente maduros para o tipo de peixe selvagem. </li><li> Embriões de tela ou peixes adultos usando métodos em passos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peixes adultos, um pedaço da cauda pode ser cortada seguinte anesthetization. <ol><li> Anestesiar peixe peixes por submersão numa solução de tricaina (éster etílico do ácido 3-aminobenzóico) para reduzir o stress durante recorte aleta. Seguindo recorte fin, permitir que os peixes para se recuperar em água doce. Peixe recuperar rapidamente; observar até que tenham recuperado (estão nadando normalmente). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Grandes avanços foram feitos nos últimos anos para a compreensão da base genética da evolução dos traços. Embora os genes candidatos subjacentes a evolução de um número de características tem sido identificado, manteve-se um desafio para testar estes genes in vivo, devido à falta de rastreabilidade genética de espécies evolutivamente mais interessantes. Aqui nós relatamos um método para edição genoma em A. mexicanus, espécie usada para estudar a evolução de animais das cavernas. Ma...

A compreensão da base genética da evolução característica é uma meta pesquisa crítica dos biólogos evolutivos. Um progresso considerável foi feito na identificação de loci subjacentes à evolução dos traços e identificar genes candidatos dentro destes loci (por exemplo 1-3). No entanto, funcionalmente testar o papel destes genes manteve-se como um desafio muitos organismos utilizados para o estudo da evolução de traços não são actualmente tratável geneticamente. O advento das tecnologias de edição genoma aumentou significativamente a manipulabilidade genética de uma larga gama de organismos. Transcrição nucleases-activadores como efectoras (TALENS) e agrupados regularmente interespaçadas palindrï¿½icas repetições curtas (CRISPR) foram usadas para gerar mutações pontuais em genes em vários organismos (por exemplo, 4-11). Essas ferramentas, aplicados a um sistema evolutivamente relevantes, têm o potencial de revolucionar a forma como os biólogos evolucionistas estudar a base genética da evolução. Astyanax mexicanus é uma espécie de peixe que existe em duas formas: a. (Peixe de superfície) forma de superfície-moradia rio e múltiplas formas cavernícolas (cavefish) A. mexicanus cavefish evoluíram a partir de ancestrais peixes de superfície (revisto em 12). Populações de cavefish desenvolveram uma série de características, incluindo a perda dos olhos, diminuição ou perda da pigmentação, aumento do número de papilas gustativas e neuromasts cranianos e alterações no comportamento, como a perda do comportamento de escolaridade, aumento da agressividade, mudanças na alimentação postura e hiperfagia 13 -19. Cavefish e peixes de superfície são interférteis e experimentos de mapeamento genético foram realizados para identificar genes loci e candidatos para características caverna 1,20-26. Alguns genes candidatos foram testados para um papel funcional em contribuir para traços caverna em cultura de células 1,19, em organismos modelo de outras espécies de 21 ou pela superexpressão 27 ou knockdown transitória ucantar morpholinos 28 em A. mexicanus. No entanto, cada um destes métodos tem limitações. A capacidade para gerar alelos mutantes desses genes em A. mexicanus é fundamental para a compreensão de sua função na evolução da cavefish. Assim, A. mexicanus é um organismo candidato ideal para a aplicação de tecnologias de edição genoma. Aqui destacamos um método para edição genoma em A. mexicanus usando TALENS. Este método pode ser utilizado para avaliar mosaico injectado peixe fundador para fenótipos e para o isolamento de linhas de peixes com mutações estáveis ​​em 29 genes de interesse.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (ordered through Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1,000x solution)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bsa&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>provided with restriction enzymes</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Quick ligation kit</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Esp&lt;/em&gt; 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (Ordered through Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sac&lt;/em&gt; I</td><td>Promega (Ordered through Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&amp;nbsp;</td><td>Ambion (ordered through Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (ordered through Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (ordered through Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN injecções par resultar na ligação dos RVDS aos nucleótidos de ADN específicas e, assim, a dimerização dos domínios FokI, resultando em quebras de cadeia dupla 39, que podem ser reparados através da extremidade não-homóloga de união (NHEJ). NHEJ frequentemente introduz erros que resultam em inserções ou deleções (indels). Indels podem ser identificados através da amplificação da região em torno do local alvo TALEN e digestão do fragmento amp...

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish.

Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

8.2K visualizações.  Iowa State University.  mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish. 

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Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Genética

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Biologia do Desenvolvimento

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Biologia

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

Coleção gamete e fertilização in vitro de Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Genome Editing

A well-established technique for modifying specific sequences in the genome is gene targeting by homologous recombination, but this method can be laborious and only works in certain organisms. Recent advances have led to the development of &#8220;genome editing&#8221;, which works by inducing double-strand breaks in DNA using engineered nuclease enzymes guided to target genomic sites by either proteins or RNAs that recognize specific sequences. When a cell attempts to repair this damage, mutations can be introduced into the targeted DNA region. In this video, JoVE explains the principles behind genome editing, emphasizing how this technique relates to DNA repair mechanisms. Then, three major genome editing methods&#8212;zinc finger nucleases, TALENs, and the CRISPR-Cas9 system&#8212;are reviewed, followed by a protocol for using CRISPR to create targeted genetic changes in mammalian cells. Finally, we discuss some current research that applies genome editing to alter the genetic material in model organisms or cultured cells.

Genoma Edição na

Resumo

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