Gli animali delle caverne forniscono un sistema convincente per indagare diversi tratti morfologici, dello sviluppo e comportamentali. Ma uno dei fattori limitanti nella creazione di questo sistema modello è la mancanza di strumenti genetici che ci permetterebbero di manipolare la funzione genica. Qui dimostriamo tre diversi approcci per manipolare la funzione genica nel pesce delle caverne messicano, Astyanax mexicanus.
Questi strumenti consentiranno lo studio dei geni alla base delle variazioni naturali tra pesci di superficie e pesci delle caverne e del modo in cui si relazionano con i fenotipi. Bethany Stahl, un postdoc di talento nel mio laboratorio dimostrerà questa procedura. Prima di iniziare la procedura, riempire una piastra di Petri da 100 millilitri con un caldo 3%agarosio sciolto nell'acqua del sistema di pesce e posizionare con cura uno stampo a iniezione di uova nell'agarosio con un angolo di 45 gradi, prima di abbassare lentamente lo stampo nell'agarosio per evitare di intrappolare l'aria sotto lo stampo.
Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere con cura lo stampo, quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Quindi estrarre gli aghi dai capillari di vetro borosilicato e un estrattore di aghi per elettrodi secondo le linee guida del produttore. Il giorno dell'iniezione, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire le uova a singola cella nella piastra di iniezione, riempiendo fino a cinque file della piastra di iniezione con da 30 a 40 uova per fila.
Mantenere le uova idratate con una piccola quantità di acqua del sistema ittico. Scongelare Morpholino sul ghiaccio e preparare la soluzione di iniezione in modo che 400 picogrammi di Morpholino vengono iniettati per uovo utilizzando una lunga punta di pipetta Microloader o aggiungendo un bolo da due a quattro microliter alla fine. Una volta caricati tutti gli aghi, utilizzare le pinie per tagliare la lunghezza in eccesso dalle punte dell'ago di iniezione e montare il primo ago in un micromanipolatore collegato a un microiniettore picoliter.
Quindi, posizionare la piastra di iniezione al microscopio di sezionamento e utilizzare il micromanipolatore per penetrare ogni uovo con l'ago prima di iniettare un nanolitro di soluzione di iniezione di Morpholino direttamente nel tuorlo. Per l'iniezione CRISPR, mescolare 25 picogrammi di RNA guida con 300 picogrammi di RNA messaggero proteina 9 associata alla CRISPR e iniettare due nanolitri della soluzione di RNA risultante in ogni embrione come dimostrato. Per l'iniezione di plasmide affiancata Tol2 transposasi e Tol2, combinare 25 nanogrammi per microlitro di RNA messaggero Tol2 con 25 nanogrammi per microlitro di costrutto plasmide Tol2 e rosso fenolo in acqua priva di RNasi.
Quindi iniettare un nanolitro di soluzione in ogni embrione come appena dimostrato. Per osservare gli animali iniettati da Morpholino a quattro giorni dopo l'iniezione, a seconda del gene di interesse, visualizzare le larve di pesce al microscopio stereo per osservare il fenotipo degli animali iniettati o la registrazione video per misurare il comportamento. Per migliorare le indelie CRISPR, trasferire embrioni iniettati da CRISPR in tubi PCR ed estrarre il DNA secondo protocolli standard di estrazione del DNA per la reazione a catena della polimerasi o l'analisi PCR.
Per valutare la mutagenesi, eseguire cinque microlitri del prodotto PCR su un gel di agarosio del 3% a 70 volt per tre ore. Il DNA di tipo selvaggio e non mutagenizzato si tradurrà in una banda distinta, mentre il DNA mutante si tradurrà in una banda striata. Grotta Un messicano iniettato con un controllo Morpholino mostra un'attività locomotoria significativamente maggiore e un sonno ridotto per un periodo di 24 ore, rispetto ai pesci di superficie iniettati con un Morpholino strapazzato.
L'iniezione dell'ipocretina orexina Morpholino ha poco effetto sul sonno nei pesci di superficie rispetto ai pesci iniettati dal controllo. Al contrario, il knockdown di ipocretina orexina tramite iniezione di Morpholino ha un effetto significativo sul sonno nei pesci che abitano le caverne, fornendo un legame diretto tra l'espressione dell'ipocretina e la perdita del sonno. La mutagenesi mediata dal CRPSR del gene dell'albinismo OCA2 nei pesci di superficie si traduce in alcuni individui omozigoti per l'allele positivo OCA2 di tipo selvatico, ed è associata alla pigmentazione del porto, mentre gli individui che hanno due copie dell'allele negativo OCA2 mutato crispr sono albini, fornendo un legame diretto tra il gene mutante OCA2 e l'albinismo nei pesci delle caverne.
Selezionare F0 positivo per il transgene trasmesso Tol2 per eseguire il back cross al tipo jolly per generare linee F1 stabili. Ciò consente l'imaging di calcio vivo per scoprire le differenze nell'attività neuronale, mediare i cambiamenti comportamentali nell'ambiente delle caverne, gettare le basi per l'espressione di molti transgeni aggiuntivi per caratterizzare e manipolare la funzione genica in A mexicanus. Le cose più importanti da ricordare sono caricare saldamente le uova sul piatto, tagliare correttamente l'ago e ottimizzare la microiniezione.
Dopo un knockdown genetico di successo, l'integrazione transgena o l'editing genico mediato da CRISPR, questi pesci possono essere utilizzati per analisi di attività dello sviluppo, comportamentali e cerebrali.
