이 작품은 유전학, 개발 및 세포 생물학 및 아이오와 주립 대학의학과 및 NIH 보조금 EY024941 (WJ) 싱거에 의해 투자되었다. 제프리 Essner는 원고에 대한 의견을 제공했다.

모든 동물의 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지침에 따라이었고, 아이오와 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 메릴랜드 대학에 의해 승인되었다. 1. TALEN 디자인 <ol><li> TALEN 디자인 웹 사이트에 입력 원하는 대상 시퀀스. (예 : <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). 입력 스페이서 / 반복 배열 길이를 선택. <ol><li> &quot;순서&quot;라고 표시된 상자에 게놈 시퀀스를 복사합니다. </li><li> &quot;사용자 지정 스페이서 / RVD 길이를 제공한다&quot;탭에서 스페이서 길이와 배열의 길이를 선택합니다. 참고 : 15 염기쌍의 스페이서 길이 잘 15-17 일의 배열의 길이를 반복하고 조립이 덜 복잡합니다. </li></ol></li><li> TALEN 쌍을 선택합니다. 독특한 제한 효소 부위를 중심으로 설계 TALEN 쌍은 제한 효소에 의해 소화 유전자형이 허용PCR 산물. </li><li> 디자인 된 프라이머에는 Primer3 (30-32)과 같은 웹 사이트를 이용하여 TALEN 대상 부위 주변의 게놈 영역을 증폭한다. 제한 효소 유전자형하면 설계 프라이머 번만 제한 효소 부위를 포함하는 영역을 증폭한다. 이 지역이 증폭되고 A에 존재하는 다형성을 확인하기 TALEN 건설에 앞서 염기 서열을하는 것이 좋습니다 mexicanus 실험실 인구는 미세 주입에 사용되는. </li></ol> 합니다 (TALEN 키트 프로토콜에서 수정) 2. TALEN 조립 33, 34 자세한 내용 및 문제 해결을 위해 프로토콜 34을 참조하십시오. <ol><li> 준비하고 제조업체의 지침에 따라 TALEN 키트에서 필요한 플라스미드 시퀀스. </li><li> 반응 A와 B에 대한 1 반응이 반복 변수 diresidues (RVDS) 1-10과 반응 A의 대상 벡터 pFUS_A는 RVDS를 포함를 11- 포함 # (N-1)과 일을 설정합니다N은 TALEN에 RVDS의 총 개수이다 전자 대상 벡터 pFUS_B 반응 B의 (N-1). <ol><li> 각 반응에 추가 각 RVD (100 NG / μL), 대상 벡터 (100 NG / μL), 1 ㎕의 BSA I 제한 효소 1 ㎕의 소 혈청 알부민 (BSA) (2 ㎎ / ㎖를 함유하는 각각의 플라스미드 1 μL ) 1 μL 리가 20 μl의 총 부피에 대한 물의 μL 배 리가 버퍼 (X)의 2 μL. 예를 들어, 표 1을 참조하십시오. 주 : 하프 반응이 또한 사용될 수있다. </li><li> 열 순환기의 반응을 놓고 사이클 실행 : 10 배 (37 ° C / 5 분 + 16 ° C / 10 분) + 50 ° C / 5 분 + 80 ° C / 5 분. </li></ol></li><li> 클레아 제와 반응을 품어. 각 반응에 1 ㎕의 25 mM의 ATP 1 ㎕를 클레아를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 반응을 인큐베이션. </li><li> 반응을 변환. <ol><li> 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환. 참고 : 제 유능한 CELL을 사용할 수있다. 그러나, 낮은 능력을 가진 세포는 식민지의 부족이 발생할 수 있습니다. <ol><li> 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 다섯 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. Catabolite 억압 (SOC) 슈퍼 최적 배지 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 튜브를 흔들어. </li></ol></li><li> 접시 스펙 티노 마이신 (50 μg의 / mL)로 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 100 μL, X-gal을 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG). 37 ° C에서 O / N를 성장. </li></ol></li><li> 각각의 반응 2-3 흰색 식민지를 선택하고 프라이머 pCR8_F1 및 pCR8_R1 (표 2)를 사용하여 식민지 PCR에 의해 확인합니다. <ol><li> 시약의 마스터 믹스를 확인합니다. 예를 들어, 표 3 참조. </li><li> 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 스펙 티노 마이신과 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어(50 μg의 / ㎖). 식민지와 튜브에 마스터 믹스 15 μl를 놓습니다. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 실행 (표 4) </li><li> 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 (전체 볼륨을 실행) 확인합니다. 올바른 클론 예상 크기에 밴드뿐만 아니라 비방과 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오. </li><li> 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙. </li><li> 순서 pCR8_F1 및 pCR8_R1과 TALEN 순서를 확인합니다. 앞에서 설명한 방법 (35)을 따릅니다. </li><li> 시퀀싱에 의해 확인 정확한 클론을 사용하여, 대상 벡터에 A 및 B 벡터를 최종 RVD에서 RVDS를 두어 반응 # 2 (TALEN 키트)를 설치했다. <ol><li> 반응 2 (표 5)에 대한 믹스를 준비합니다. 참고 : 하LF 반응이 사용될 수있다. </li><li> 열 순환기의 반응을 놓고 다음 프로그램 실행 : 37 ° C / 10 분 + 16 ° C / 15 분 + 37 ° C / 15 분 + 80 ° C / 5 분. </li></ol></li><li> 반응을 변환. <ol><li> 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환. <ol><li> 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 열은 42 ℃에서 30 초 동안 세포를 충격. </li><li> 얼음에 튜브를 놓습니다. SOC의 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양기에서 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 플레이트 암피실린 (100 μg의 / ㎖), X-여자와 IPTG와 LB 플레이트 상에 형질 전환 세포 100 ㎕. 37 ℃에서 O / N 성장 </li></ol></li><li> 각각의 반응 1-3 흰색 식민지를 선택하고 식민지 PCR 프라이머의 TAL_F1를 사용 TAL_R2 (표 2)에 의해 확인. <ol><li> 중합 효소 mastermix 물 및 프라이머의 용액을표 3에 설명했다. 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 암피실린 (100 ㎕ / ml)이 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어. 식민지와 튜브에 용액 15 μl를 놓습니다. </li><li> PCR을 프로그램 (표 6)를 실행합니다. </li><li> 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 확인합니다. 올바른 클론은 번짐 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오. </li><li> 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙. </li><li> 순서 TAL_F1 및 TAL_R2 앞에서 설명한 방법 (35)을 다음과 같이 TALEN 순서를 확인합니다. </li></ol> TALENs의 3 mRNA의 전사 <ol><li> 37 ° C에서 2 시간 동안 2 μL 골목 I와 순서 검증 된 템플릿의 4 μg의 다이제스트. </리&gt; <li> 전기 영동에 의해 1.5 % 아가 로스 겔에서 골목 I 소화 플라스미드 2 μL를 실행. 제대로 소화 플라스미드는 하나의 밴드가 표시됩니다. </li><li> PCR을 정제 키트 프로토콜 다음 나머지 골목 I-소화 플라스미드를 정제. 용출 전에 세척 용액으로 두 번 세척 하였다. 뉴 클레아 제 무 물 30 μL로 용출. </li><li> T3 mRNA의 생산을위한 표준 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 선형화 된 템플릿의 0.5 μg의를 사용하여 반 반응을 설정합니다 (위의 준비). 2 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> DNase의 (키트에 포함)의 0.5 μl를 추가하고 15 분 동안 37 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 mRNA의 정화. 30 μL 클레아없는 물에 용출. </li><li> mRNA의를 확인하기 위해 전기 영동으로 1.5 % 아가 로스 젤을 실행합니다. <ol><li> 된 RNase 오염을 제거하고 1.2 % 겔을 제조 제품 겔 청소 장치. </li><li> 믹스 1 μL mRNA의 + 4# 181; 리터 클레아없는 물 + 5 ㎕를 glyoxyl 로딩 염료. 30 분 동안 50 ℃에서 샘플을 인큐베이션. 젤을 실행하기 전에 얼음에 원심 분리기 튜브 짧게과 장소. </li></ol></li><li> 핵산 농도의 정량 방법을 사용하여 농도를 검사하고 -80 ℃에서 분취 량으로 RNA를 저장한다. RNA는 / 냉동 번 이상 해동되지 않도록 나누어지는 크기를 선택합니다. 참고 : 500 ~ 1,000 NG의 농도 / NL은 일반적으로 얻을 수있다. RNA의 무결성이 유지되는 (밴드보다는 겔상의 스미어이 정한) 저급 RNA 농도를 오랫동안 사용할 수있다. </li></ol> TALEN의 mRNA 4.를 주입 아 스티 아낙 스 mexicanus 배아 <ol><li> 주입을위한 도구를 준비합니다. <ol><li> 페트리 접시에 생선 물 (중탄산 나트륨과 바다 소금의 pH 7.4와 전도성 700 μS와 에어컨 물)을 1.2 % 아가로 오스를 부어 주사 판을 따르십시오. 물고기 우물을 만들기 위해 돌기 금형 (플라스틱 조각을 배치접시 안에 계란). 4 ° C에서 아가로 오스가 강화했다 금형 및 저장소를 제거합니다. 금형에 대한 자세한 내용은 36를 참조하십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러를 사용하여 주사 바늘을 빼냅니다. 참고 : 적절한 바늘 길이가 주사 중요하다. 너무 긴 바늘은 주사를 너무 유연 할 것입니다. 당기 바늘을위한 프로토콜은 바늘을 당겨하는 데 사용되는 장비에 따라 달라집니다. 적절한 바늘의 일례의 장비를 위해, 우리는 길이 5~6cm이다 바늘을 당긴다.도 1에 도시 한 고장시 약 0.011 mm의 선단부 외경을 가지고있다. 그러나 바늘은 개구 폭을 결정한다 (단계 4.3.4)를 교정해야한다. 바늘을 인상하기위한 예시적인 프로그램 표 7에서 확인할 수있다. </li><li> 달걀이 통과하는 개구부가 충분히 큰 있도록 피펫을 위반하여 배아 전송에 유리 피펫을 준비합니다. 깨진 끝날 때까지 불꽃더 이상 날카로운 없다. 참고 : A. 작업 할 때 유리 피펫과 유리 그릇을 사용하는 것이 중요합니다 mexicanus 계란과 배아는 끈적하고 플라스틱을 준수하므로. </li></ol></li><li> 1 셀 단계 계란을 수집합니다. <ol><li> 품종 A. mexicanus 표준 프로토콜 (37)을 다음과 같습니다. 참고 : 예를 들어, 물고기가 14 불을 유지하는 경우 : 10 어두운주기 및 소등로하고 ZT14 등으로 ZT0와 Zeitgerber 시간 (ZT)를 사용하여, ZT15과 ZT19 사이에 우리의 표면 물고기의 산란. 정확한 산란 시간은 각 실험실에 대해 결정해야합니다. </li><li> 이전 짝짓기 3-4 일 동안 물고기를 과식과 신선한 물에 물고기를 배치하여 산란을 유도한다. 온도 2 °의 F를 올립니다. 참고 : 우리의 초기 수온이 약 74 ° F입니다. </li><li> 1 세포 단계에서 달걀을 얻기 위해 15 분마다 확인, 어둠 속에서 표면 물고기 알을 수집합니다. 계란의 수백 표면 물고기의 한 쌍에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 수집유리 그릇에 계란 플라스틱 표면에 부착 방지하고 정렬 현미경으로 알을 관찰하고 단일 셀입니다 계란을 수집하여 사전 주입에 1 세포 단계에서 배아를 분리 할 수​​ 있습니다. (pH와 전도도 처리 된 성인 물고기가 보관되어있는 탱크의 물) 신선한 시스템 물에 계란을 유지합니다. </li></ol></li><li> TALEN의 mRNA를 주입한다. <ol><li> 독성과 효율 TALEN 쌍마다 다를으로 주입을위한 최적의 농도를 측정하는 총 mRNA를 (상기 한 쌍의 각 TALEN 동일한 양)의 상이한 양을 주입한다. 400-800 페이지입니다 전체의 mRNA의 농도를 주입하여 시작합니다. 희석하고 1.5 NL를 분사 목적의 mRNA 농도를 결합한다. </li><li> 로드 바늘의 뒷면에의 mRNA를 희석시키고 마이크로 주사기에 바늘을 연결합니다. </li><li> 집게를 사용하여 바늘 브레이크. </li><li> 바늘을 보정합니다. 예를 들어, 10 회 배출 및 마이크로 모세관의 결과 강하를 수집합니다. 10 × 100 일회용 1.081, L 32 mm 마이크로 모세관, 드롭 1.5 NL / 1 주입 0.5 mm에 마이크로 모세관을 작성해야합니다. 필요에 따라 분사 시간 및 압력을 조정한다. </li><li> 하나의 셀에 바늘을 삽입하고 mRNA를 주입. 하지 노른자로, 셀에 직접 mRNA를 주입한다. </li><li> 유리 그릇에 주입 된 배아를 수집합니다. 23 ~ 25 ℃에서 배아를 유지합니다. 죽은 태아 정기적으로 주입 다음 처음 몇 일 동안 (흐린 및 불규칙한 모양이 될 배아)를 제거합니다. 제어 (uninjected) 및 주입 판에서 죽은 변형 배아의 기록 번호. 참고 : 증가 된 mRNA의 농도가 증가 독성과 태아의 기형 / 죽음으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 효율성에 비해 독성은 주입의 mRNA의 최고 농도를 결정하기 위해 균형을 이루어야한다. </li></ol></li></ol> 5. 표현형의 설립자 물고기와 TALEN 효율성 평가 <ol><li> 기관 동물 프로토콜에 따라 배아를 희생. 참고 : 우리는 안락사빠른에 의한 배아 얼음에 냉각. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 0.8 μl의 PCR 스트립 튜브로 배아를 수집합니다. 참고 : 유전자형 개별 배아 또는 태아의 풀을 수행 할 수 있습니다. </li><li> DNA의 압축을 풉니 다. <ol><li> 100 ㎕의 50 mM의 수산화 나트륨 (NaOH)와에 장소 배아는 4 ° C까지 다음 냉각, 30 분 동안 95 ° C에서 품어. </li><li> 1 M 트리스 - 염산 pH가 8 1/10 일 볼륨 (10 μL)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 단계 1.3에서 디자인 된 프라이머를 (샘플 프로토콜에 대한 표 8 및 9 참조)를 사용하여 영역에 PCR을 수행합니다. 개별 배아를 들어 DNA 1 μL는 PCR 반응에 충분하다. </li><li> 적절한 제한 효소로 생성 된 PCR 생성물을 소화하고 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔을 실행. <ol><li> 예를 들면, 주입 된 배아의 oculocutaneous 백색증 2 (oca2) 궤적 유전형에 0을 추가하여 제한 효소 BSR I을 사용하여 PCR 생성물을 소화2 시간 동안 65 ° C에서 배양 완성 된 PCR 반응의 12.5 μL에 BSR 직접 I의 0.5 μL. 소화되지 않은 및 겔에 소화 제품을 실행합니다. 제한 효소 저항 밴드 (즉, 소화되지 않는 밴드) TALEN에 의한 돌연변이가 존재한다 (그림 2) 있음을 나타냅니다. </li></ol></li><li> (선택적) 이전 29 바와 같이 각 밴드의 강도 값을 계산하기 위해 겔 분석 도구를 사용하여 피지 38 겔의 이미지를 분석하여 미가공 생성물의 비율을 측정하여 백분율 돌연변이 비율을 계산한다. </li><li> TA는 겔 정제 제한 효소 내성 돌연변이 밴드를 복제하고 클론을 시퀀싱하여 돌연변이 대립 유전자의 순서를 결정합니다. <ol><li> 젤은 제한이 제조업체의 지침에 따라 내성 돌연변이 밴드 효소 정화. TA는 제조업체의 지침에 따라 밴드를 복제. 식민지를 선택하고 진탕에서 37 ° C에서 1.5 ml의 LB O / N에서 성장부란기. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 미니 프렙 문화. 염기 서열의 DNA를 보냅니다. </li><li> 예컨대 APE 같은 프로그램을 이용하여 야생형 서열에 돌연변이 서열 정렬. <ol><li> 복사 및 APE 파일에 두 시퀀스를 붙여 넣습니다. &quot;도구&quot;메뉴에서 &quot;정렬 두 시퀀스&quot;도구를 선택합니다. </li><li> 드롭 다운 메뉴를 사용하여 두 개의 DNA 시퀀스를 지정합니다. 참고 : 복제 된 순서의 반대로 보완이 PCR은 클로닝 벡터에 들어갔다 방향에 따라 사용해야 할 수도 있습니다. 서열이 일치하지 않을 경우, &quot;정렬 DNA&quot;상자에서 &quot;계-COM&quot;확인란을 선택 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 적절한 단계에서 표현형 및 예상 표현형 (29)에 대한 적절한 방법 (예를 들어, 그림 3)를 사용 설립자 물고기를 평가합니다. 표현형의 방법은 protoc를 사용하여 연구원의 대상 유전자의 예상 표현형을 기반으로합니다올. </li></ol> 생식선 전송 6. 화면 참고 : A. mexicanus 4~8개월에서 성적 성숙에 도달. <ol><li> 야생형 물고기에 성적으로 성숙 설립자 물고기를 교차. </li><li> 화면 배아 또는 단계 5.1-5.7의 방법을 사용하여 성인 물고기 (그림 4). 성인 물고기 꼬리의 조각은 마취 다음 잘릴 수 있습니다. <ol><li> 핀 클리핑 동안 응력을 감소시키기 tricaine (3- 아미노 벤조산 에틸 에스테르)의 용액에 침지하여 생선 고기 마취. 핀 클리핑에 따라, 물고기가 민물에 복구 할 수 있습니다. 물고기는 빠르게 회복; 그들은 (일반적으로 수영) 회복 될 때까지 관찰합니다. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

커다란 진보는 특성의 전개의 유전 적 기초를 이해 향해 최근에 이루어지고있다. 형질 다수의 진화를 기초 후보 유전자가 확인되었지만, 인해 가장 흥미로운 진화 종의 유전자 취급 용이성의 부족으로 생체 내에서 이들 유전자를 테스트 도전 남아있다. 여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을보고 mexicanus, 종 동굴 동물의 진화를 연구하는 데 사용. 유전자지도는 1,21,23</...

특성 진화의 유전 적 기초를 이해하는 것은 진화 생물학의 중요한 연구 목표입니다. 상당한 진전이 특성의 진화를 기본 궤적을 확인하고 (실시 예 1-3)이 유전자좌에서의 후보 유전자를 정확히 파악을했다. 그러나, 기능적으로 이들 유전자의 역할 특성의 진화 연구에 사용 된 많은 유기체 도전 유지하고 테스트하는 것은 현재 유전자 취급 용이하지 않다. 게놈 편집 기술의 출현은 크게 유기체의 광범위한 유전 조작성 증가했다. 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs) 및 클러스터 정기적 interspaced 짧은 반복 팔린 드롬 (CRISPRs)은 (실시 예 4-11) 유기체의 여러 유전자 ​​표적 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다. 진화론 관련 시스템에 적용이 도구는, 진화 생물 학자들이 진화의 유전 적 기초를 공부하는 방법을 혁신 할 수있는 잠재력을 가지고. 아 스티 아낙 스의 mexicanus는 두 가지 형태로 존재하는 물고기의 종입니다. 강에 사는 표면 형태 (표면 생선)과 여러 동굴 주거 형태 (cavefish) A. mexicanus의 cavefish은 (12에서 검토) 표면의 물고기 조상에서 진화. cavefish의 인구는 학교 행동의 감소, 증가 침략, 자세와 과식증 (13) 먹이의 변화로 동작 입맛과 두개골 neuromasts, 변화의 수를 증가, 감소 또는 색소 침착의 손실, 눈의 손실을 포함하여 특성의 숫자를 진화 -19. Cavefish 표면 물고기 interfertile, 그리고 유전자지도 실험은 동굴 특성 1,20-26에 대한 궤적 및 후보 유전자를 식별하기 위해 수행되었다. 일부 후보 유전자가 다른 종 (21)의 모델 생물 또는 과발현 27 또는 과도 최저 U에 의해, 세포 배양 1,19에서 동굴의 특성에 기여하는 기능 역할에 대해 테스트되었습니다A.에 morpholinos 28 노래 mexicanus. 그러나, 이러한 각각의 방법은 한계가있다. A. 이러한 유전자의 돌연변이 대립 유전자를 생성 할 수있는 능력 mexicanus는 cavefish의 발전에 그 기능을 이해하는데 중요하다. 따라서, A. mexicanus는 게놈 편집 기술의 응용 프로그램에 대한 이상적인 후보 유기체이다. 여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을 간략하게 설명 mexicanus TALENs를 사용하여. 이 방법은 표현형에 대한 관심 (29)의 유전자 안정 돌연변이 물고기의 라인을 분리하기위한 모자이크 주입 설립자 물고기를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (ordered through Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1,000x solution)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bsa&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>provided with restriction enzymes</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Quick ligation kit</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Esp&lt;/em&gt; 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (Ordered through Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sac&lt;/em&gt; I</td><td>Promega (Ordered through Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&amp;nbsp;</td><td>Ambion (ordered through Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (ordered through Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (ordered through Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN 쌍 주사 (NHEJ)를 결합 비 상동 단부를 통해 복구 될 수 이중 가닥 나누기 39의 결과 FokI 따라서 도메인의 이량 체화를 특정 DNA 뉴클레오티드에 RVDS 바인딩을 초래한다. NHEJ 자주 삽입 또는 삭제 (삽입과 삭제)에서 발생하는 오류를 소개합니다. 삽입과 삭제가 TALEN 대상 부위 주변의 영역을 증폭하며 TALEN 스페이서 영역 내에서 절단하는 제한 효소로 ?...

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

유전자 돌연변이는 유전자 타겟팅 편집 기법을 사용하여 유기체의 광범위한 이제 가능하다. 여기, 우리는 아 스티 아낙 스 mexicanus, 표면 물고기와 cavefish를 포함 물고기의 종 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 등의 전사 활성을 이용하여 표적 유전자의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 보여줍니다.

의 게놈 편집<em&gt; 아 스티 아낙 스의 mexicanus</em&gt; 사용 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

8.2K 조회수.  Iowa State University.  유전자 돌연변이는 유전자 타겟팅 편집 기법을 사용하여 유기체의 광범위한 이제 가능하다. 여기, 우리는 아 스티 아낙 스 mexicanus, 표면 물고기와 cavefish를 포함 물고기의 종 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 등의 전사 활성을 이용하여 표적 유전자의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 보여줍니다. 

비디오: Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

연구

유전학

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

발생학

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

생물학

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

아스티야낙스 멕시코의 게임테 컬렉션 및 체외 수정

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Genome Editing

A well-established technique for modifying specific sequences in the genome is gene targeting by homologous recombination, but this method can be laborious and only works in certain organisms. Recent advances have led to the development of &#8220;genome editing&#8221;, which works by inducing double-strand breaks in DNA using engineered nuclease enzymes guided to target genomic sites by either proteins or RNAs that recognize specific sequences. When a cell attempts to repair this damage, mutations can be introduced into the targeted DNA region. In this video, JoVE explains the principles behind genome editing, emphasizing how this technique relates to DNA repair mechanisms. Then, three major genome editing methods&#8212;zinc finger nucleases, TALENs, and the CRISPR-Cas9 system&#8212;are reviewed, followed by a protocol for using CRISPR to create targeted genetic changes in mammalian cells. Finally, we discuss some current research that applies genome editing to alter the genetic material in model organisms or cultured cells.

의 게놈 편집

요약

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