This study was supported by NIH grants R21HL118661, R56HL124444, and R01HL124444 to CDK, and by NIH grants R00HL103797 and R01HL125695 to JMM.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo il protocollo approvato dal Comitato cura e l&#39;uso Duke Istituzionale Animal. topi maschi sono stati utilizzati in questo studio, anche se entrambi i sessi può essere utilizzato come indicato ai fini scientifica dello studio. 1. Depilazione <ol><li> Prima di induzione di anestesia, impostare una zona di preparazione pre-chirurgica consiste di una piastra elettrica coperta a 37 ° C e una porta nosecone connesso al flusso continuo di isoflurano. </li><li> Posizionare il mouse nella camera di induzione dell&#39;anestesia. Impostare il flussometro O 2 a 1 L / min e isoflurano per 1 - 3%. NOTA: L&#39;anestesia è tipicamente indotta in 25 g mouse con 2% isoflurano. </li><li> Controllare la risposta di stimolo del mouse delicatamente a dondolo della camera e osservando la mancanza di un riflesso di raddrizzamento. </li><li> Lavare la camera con 2 O per cancellare l&#39;isoflurano prima dell&#39;apertura. spostare rapidamente il mouse per il riscaldamento pannuncio e collegarlo al isoflurano attraverso il musetto. </li><li> Regolare il isoflurano al 1,5%. Controllare la risposta di stimolo da parte del pedale riflesso (pinch tep). </li><li> Applicare il lubrificante oftalmica liberamente in entrambi gli occhi per evitare l&#39;essiccamento durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Radere i capelli da entrambi gli arti posteriori con un piccolo trimmer elettrico. Tenere la pelle tesa durante la rasatura per evitare di lacerare la pelle. </li><li> Applicare pre-riscaldato crema depilatoria e lasciate riposare per 1 min. Delicatamente spazzare via con un tampone di garza inumidito. </li><li> Per la procedura chirurgica in un secondo momento, disattivare l&#39;isoflurano e spostare il mouse a un asciugamano foderata gabbia di recupero di carta vuoto per garantire il mouse non aspirare il assestamento gabbia. Monitorare l&#39;animale fino a quando è in grado di mantenere decubito sternale. In caso contrario, spostare il mouse al tavolo operatorio. NOTA: Il processo di rimozione dei capelli può irritare la pelle e influire sulle misurazioni della perfusione. Si consiglia di attendere 1 - 2 giorni dopo la rimozione dei peli dell&#39;animale prima di performing una scansione perfusione pre-chirurgica o l&#39;esecuzione di un intervento chirurgico. </li></ol> Preparazione 2. Pre-chirurgica <ol><li> Utilizzare i seguenti strumenti durante questa procedura; piccole forbici chirurgiche rette, 2 punta fine pinze ad angolo, piccole pinze Graefe, ago pinze driver, 3 divaricatori, forbici piccola sorgente, e tamponi di cotone punta fine. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti utilizzando un autoclave prima dell&#39;inizio della chirurgia. Utilizzare uno sterilizzatore a caldo tallone prima e tra ogni intervento chirurgico, per un massimo di 5 animali. Sterilizzare ulteriori pacchetti di strumento chirurgico per la chirurgia di gruppi superiori a 5. </li><li> Preparare un campo chirurgico sterile, costituita da una piastra elettrica coperta e una porta isoflurano. Eseguire tutti i lavori sotto un microscopio dissezione 10 stereo. </li><li> Anestetizzare e preparare il mouse come descritto nei punti da 1.1 a 1.5. </li><li> Controllare che il mouse è completamente sedato e posto in posizione supina sul tavolo operatorio. Fissare entrambe le gambe con nastro chirurgico. &lt;/ Li&gt; <li> Se si utilizza una piastra elettrica a temperatura controllata, fissare la sonda di temperatura e fissarlo alla base della piattaforma chirurgica con nastro chirurgica per garantire che non venga accidentalmente estratta durante la procedura. </li><li> Pulire il sito di incisione con 3 alternati iodopovidone e alcool salviette. Coprire l&#39;animale con un telo chirurgico sterile e un foro per esporre il sito di incisione. </li></ol> 3. L&#39;induzione di ischemia degli arti <ol><li> Utilizzare un bisturi per fare una incisione iniziale lungo il centro della coscia mediale, che va dal ginocchio verso l&#39;addome, ed allungare l&#39;incisione per circa 1 cm con forbici sottili (Figura 1A). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig1.jpg" /> Figura 1. sito chirurgico e vascolari anatomici Luoghi di interesse per la chirurgia degli arti posteriori del mouse ischemia. (A) Vista esternal&#39;arti posteriori di un mouse in posizione supina. La linea tratteggiata indica il sito di incisione per eseguire correttamente le procedure degli arti posteriori ischemia. (B) Veduta del prossimale vascolarizzazione degli arti posteriori del mouse. L&#39;estremità prossimale dell&#39;arteria femorale (FA) deriva da sotto del legamento inguinale (IL). L&#39;estremità distale della FA si trova a sua biforcazione nell&#39;arteria poplitea (PA) e l&#39;arteria safena (SA). Le principali arterie collaterali al largo della FA sono l&#39;arteria femorale laterale circonflessa (LCFA), il prossimale femorale caudale (PCFA), e il superficiale dell&#39;arteria epigastrica caudale (SCEA). La vena femorale (FV) corre adiacente alla FA e rami venosi può essere visto parallelamente ai principali rami arteriosi. Gli asterischi (*) indicano i siti prossimale e distale per il posizionamento dei costrittori AMEROID o legature, a seconda che saranno indotte subacuta o ischemia acuta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig1large.jpg" target="_blank">Si prega cli</a>ck qui per vedere una versione più grande di questa figura. <ol start="2"><li> Utilizzando pinze, aprire l&#39;incisione ed esporre la membrana che copre il tessuto adiposo inguinale (IFT). </li><li> Utilizzando chiuse-pinze, forare attraverso la membrana nella separazione tra IFT e l&#39;addome. Delicatamente rilasciare pressione sulle pinze per separare il IFT dai muscoli addominali, esponendo il fascio neurovascolare sotto. Osservare il prossimale e rami caudali superficiali come importanti punti di riferimento anatomici (Figura 1B). </li><li> Inserire un divaricatore e tirare il tessuto addominale prossimale per esporre il AMEROID constrictor o legatura sito prossimale, proprio in prossimità del laterale circonflessa femorale (Figura 1B). L&#39;arteria circonflessa laterale si trova circa 5 mm prossimale al prossimale e arterie caudale superficiali. <ol><li> Inserire due divaricatori nella parte distale dell&#39;incisione, uno mediale e l&#39;altra laterale, di tirare il IFT distalmente dalsito chirurgico per allargare il campo chirurgico. </li></ol></li><li> Utilizzare due pinza sottile per rimuovere la membrana più esterna che copre il fascio neurovascolare. Inserire delicatamente la metà della punta pinza sottile tra la vena e arteria, scorrere la punta pinza sotto la membrana che li unisce. Chiudere la pinza e delicatamente strappare la membrana. </li><li> Inserire la punta di una pinza chiuse tra la vena e arteria e creare un divario tra loro rilasciando la pressione sulle pinze. Ripetere questa tecnica per creare un divario tra l&#39;arteria e il nervo. </li><li> Per subacuta ischemia, posizionare un costrittore AMEROID sull&#39;arteria femorale prossimale (Figura 2). <ol><li> Per installare il costrittore AMEROID prossimale, far scorrere la punta di una pinza sotto l&#39;arteria femorale per isolarlo dal fascio neurovascolare. Utilizzare una seconda serie di pinze angled- per afferrare il bordo del costrittore e guidare sotto l&#39;arteria femorale. </li><li> Posare l&#39;arteria femorale nelle smolto nel constrictor. Ripetere per costrittore distale, posizionandolo immediatamente prossimale alla biforcazione dell&#39;arteria femorale nell&#39;arteria poplitea e arteria safena (Figura 2). </li></ol></li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig2.jpg" /> Figura 2. Collocamento di AMEROID costrittori e Legature. (A) Esempio di due costrittori AMEROID immessi sul arteria femorale per indurre subacuta degli arti posteriori ischemia. Il constrictor prossimale si trova appena prossimale al femorale circonflessa laterale (LCFA). Il constrictor distale si trova appena prossimale alla biforcazione del popliteo (PA) e le arterie safena (SA). Costrittori sono installati con la scanalatura rivolta verso l&#39;alto al fine di garantire l&#39;arteria è impostato correttamente all&#39;interno del constrictor. (B) Esempio di legature dell&#39;arteria femorale per indurre ischemia degli arti posteriori acuta. Ligatures (frecce gialle) sono posizionati in modo tale che fiancheggiano la posizione dei costrittori pannello (B), e l&#39;arteria femorale viene transected tra ciascun gruppo di due legature (asterischi). Bar, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="8"><li> Per ischemia degli arti acuta, legare e transetto l&#39;arteria femorale prossimale. <ol><li> Per transetto l&#39;arteria femorale, filo 7 - O sutura sotto l&#39;arteria appena prossimale alla posizione del costrittore prossimale (vedi punto 3.7) e legare. Tie una seconda legatura circa 1 mm distalmente alla prima. </li><li> Usare le forbici a molla al transetto l&#39;arteria tra le due legature. Per la transection arteriosa distale, ripetere questi passaggi, mettendo due legature di circa 1 mm l&#39;una dall&#39;altra, proprio prossimali alla biforcazione dell&#39;arteria femorale in arteria poplitea e l&#39;arteria safena, ma assicurando che essi sono distale al caud superficialiAl arteria epigastrica (vedi Figura 1) </li></ol></li><li> Chiudere l&#39;incisione utilizzando interrotto 5 - punti di sutura Vicryl O. </li></ol> 4. Perfusion Imaging <ol><li> Muovi il mouse per un 37 ° piastra elettrica C impostare sotto l&#39;imager laser doppler perfusione (LDPI) e collegare tramite un nosecone alla fonte isoflurano. Se nessun controllo della temperatura è disponibile, per consentire 5 min per il mouse per riscaldare fino a 37 ° C. </li><li> Accendere l&#39;imager e lanciare il software di acquisizione delle immagini. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &#39;Nuova Immagine singolo&#39; per aprire la finestra &#39;Setup Scanner&#39;. Impostare il &#39;Formato scansione&#39; per &#39;Large&#39; e la &#39;velocità di scansione&#39; a &#39;4 ms / pixel&#39;. Impostare l&#39;area di scansione modificando i valori X e Y sotto il &#39;Area di scansione (unità)&#39; riquadro. </li><li> Fare clic sulla scheda &#39;Video e Distanza&#39; per visualizzare il feed video, e di organizzare il mouse per adattarsi l&#39;area di scansione indicata da un contorno rosso. Fare clic su &#39;Auto Distanza&#39; per calibrarela distanza dal laser al soggetto. Fare clic su &#39;Next&#39; per aprire la finestra il &quot;soggetto Dettagli. </li><li> Inserire le informazioni oggetto e eventuali commenti. Fare clic sul pulsante &#39;Avanti&#39; per passare alla finestra di scansione. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Start misura&#39; per aprire il &#39;Confermare o Override Scan Distanza&#39; di dialogo. Fare clic su &#39;OK&#39; per confermare la distanza di scansione. Osservare il processo di scansione inizia e correre per 4 - 8 min a seconda delle dimensioni dell&#39;area di scansione. </li><li> Dopo la scansione, di osservare la finestra &#39;Salva con nome&#39;. Assegnare un nome al file e salvarlo. </li><li> Spegnere il isoflurano e spostare il mouse per una gabbia di recupero vuoto e monitorare fino a quando l&#39;animale è in grado di mantenere decubito sternale. Non mettere mai un mouse recupero dall&#39;anestesia in una gabbia con altri topi. </li><li> Aprire il software di analisi delle immagini. Fare clic sull&#39;icona &#39;Open&#39; e individuare e aprire il file immagine per l&#39;analisi. Nella finestra del file, osservare il cambiamento continuo,foto, e immagini a colori del mouse. </li><li> Per celebrare la regione di interesse (ROI) sull&#39;immagine di flusso, fare clic sull&#39;icona &#39;Mostra ROI. Avanti fare clic sul pulsante &#39;Aggiungi poligono&#39; e trascinare il cursore intorno all&#39;arto non chirurgica per disegnare il ROI. Tasto destro del mouse per chiudere la forma. Seleziona &#39;Aggiungi poligono&#39; di nuovo e di tracciare un ROI corrispondente intorno all&#39;arto chirurgica. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &#39;statistiche&#39; per aprire la finestra &#39;ROI statistici Risultati (PU) Immagine&#39;. Osservare la differenza percentuale in continuo mutamento nella colonna &#39;Flux%&#39;. NOTA: La prima ROI disegnato servirà da riferimento. NOTA: Prima di ogni successiva scansione perfusione seguire la procedura descritta nella Sezione 1 per anestetizzare il mouse e in passi da 4.1 a 4.11 per l&#39;immagine dell&#39;animale. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Forse il passo più difficile in questa procedura è la separazione dell&#39;arteria femorale dalla vena femorale. Il diametro maggiore e pareti più sottili della vena femorale rispetto a quelli dell&#39;arteria aumentano la suscettibilità alle perforazioni e strappi durante la manipolazione chirurgica. La probabilità di interferire vena può essere ridotto mantenendo la ferita umida utilizzando un tampone sterile inumidito con PBS. È altresì importante garantire che tutti pinze sono affilate, allineate, e priva di...

Malattia periferica arteriosa (PAD) è una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare nei paesi sviluppati 1. risultati PAD da ostruzione aterosclerotica delle arterie periferiche che porta a ischemia con conseguente dolore da sforzo o di riposo e, occasionalmente, ulcere e cancrena che necessitano di amputazione degli arti non-guarigione. Terapie mirate PAD sono dirette principalmente verso endovascolare 2 o rivascolarizzazione chirurgica 3, come essenzialmente terapie mediche efficaci esistono 4. Purtroppo, la rivascolarizzazione è spesso di beneficio limitato, come bypass hanno alti tassi di fallimento (fino al 50% entro 5 anni) 5 che sono peggio in alcune popolazioni (ad esempio, per fumatori, le donne, non vena safena innesti) 6,7. approcci endovascolari, come angioplastica e stenting, sono anche compromesse da elevati tassi di restenosi (superiore al 50% in 1 anno), particolarmente in femoropoplitea malattia 8, anche se l&#39;uso di palloncini e stent medicati ha migliorato i risultati un po &#39;9-11. Al fine di sviluppare nuovi trattamenti per la PAD è essenziale sviluppare modelli animali che riproducono in modo affidabile la malattia umana. Fino ad oggi, il modello più comune della PAD è il modello degli arti posteriori ischemia (HLI), che viene più frequentemente eseguita nei topi 12,13. Nella sua manifestazione più comune, il modello comporta legatura chirurgica dell&#39;arteria femorale prossimale e distale e suoi intermedi rami laterali seguita da escissione della nave, con conseguente occlusione del flusso sanguigno e induzione di ischemia dell&#39;arto acuta. HLI è stato utilizzato principalmente per studiare le risposte angiogeniche e arteriogenic nel tessuto muscolare degli arti periferici e gli effetti di varie terapie (ad esempio, la droga, la consegna del gene, le cellule staminali) su queste risposte. Più di recente, il nostro gruppo ha utilizzato questo modello per esaminare il ruolo delle cellule del muscolo scheletrico in la risposta alla ischemia e gli effetti delle differenze genetiche sui risultati 14. Il modello HLI ha facilitato la nostra comprensione corrente che le risposte vascolari e muscolari all&#39;ischemia dipendono genetica (cioè, ceppo inbred) 15, 16 anni, e la presenza o assenza di altre malattie o condizioni pertinenti ad aterosclerosi, compreso il diabete mellito 17 e ipercolesterolemia 18. Tuttavia, un importante debolezza del modello tradizionale HLI è che è un modello di ischemia acuta 12,13, mentre PAD umana provoca ischemia cronica a seguito del progressivo sviluppo di lesioni aterosclerotiche occlusive nelle arterie periferiche. Nel tentativo di aggirare questa debolezza, Tang e colleghi hanno inizialmente sviluppato un modello murino di graduale occlusione arteriosa femorale utilizzando constrictor AMEROID 19, e lo stesso gruppo poi developed un modello di topo simile 20. Costrittori AMEROID sono stati descritti inizialmente nel 1950 in un modello canino di ischemia miocardica cronica 21,22. Questi dispositivi hanno un manicotto metallico esterno che racchiude uno strato interno di un materiale igroscopico, di solito di caseina, e quando disposto intorno un&#39;arteria inducono progressiva occlusione di vasi che assorbono l&#39;umidità dai tessuti circostanti. Nella modifica del modello, Yang et al. Costrittori posizionato su entrambi prossimale e distale femorale in siti analoghi ai siti legatura chirurgica, e ligato i rami laterali dell&#39;arteria femorale, come nel modello tradizionale. Rispetto al HLI acuta, ischemia AMEROID constrictor indotta portato a bassa espressione di geni infiammatori e di taglio di stress-dipendente, più bassa di recupero il flusso di sangue 4 - 5 settimane dopo l&#39;intervento, e meno necrosi muscolare 20. Sulla base di queste osservazioni, si è ritenuto che progressiva occlusione arteriosa potrebbe fornire un modello di PAD più rilevante per la malattia umana. In particolare, nel rapporto originale, effetti di AMEROID ischemia indotta constrictor sono stati esaminati solo in topi C57BL / 6 19, che sono relativamente resistenti alla ischemia indotta necrosi muscolare 15. Recentemente abbiamo modificato il modello di ischemia graduale ulteriormente e esplorato i suoi effetti nel più ischemia-sensibili BALB / c del mouse ceppo 23. Nella prima manifestazione del modello, abbiamo messo constrictor sia prossimale e distale femorale ma lasciato intatti tutti rami laterali. In un secondo, modifica mite, abbiamo posizionato un singolo costrittore solo sulla arteria femorale prossimale e ancora lasciato tutti collaterali rami dell&#39;arteria intatta. In entrambe le modifiche di questo modello, abbiamo scoperto che i topi BALB / c, ma non C57BL / 6 topi, visualizzata significativa necrosi muscolare pur avendo simile flusso di sangue e la densità vascolare. Simile al nostro precedente studio 14, questi risultati hanno dimostrato che il muscolo degli artipregiudizio non è solo influenzata dal flusso di sangue, ma è in parte dipendente background genetico. Inoltre, abbiamo scoperto che il flusso di sangue arto è sceso al suo nadir entro 3 giorni, così il modello sembra essere più uno dei &#39;subacuta&#39; piuttosto che graduale ischemia degli arti. Sulla base di questi studi precedenti, appare chiaro che un singolo metodo per indurre hindlimb ischemia può non essere adatto in tutti i casi. A causa di una varietà di condizioni (ad esempio, le differenze genetiche e la presenza o assenza di condizioni di co-morbidità) influenza sia il vascolare e le risposte specifiche del muscolo scheletrico, gli investigatori potrebbe essere necessario modificare la cronicità e / o la gravità delle arti posteriori ischemia al meglio soddisfare i loro scopi. Inoltre, precedenti descrizioni del modello tipicamente mancavano punti di riferimento anatomici idonee ad agevolare affidabile inter-investigatore riproducibilità della tecnica. In questo lavoro, i metodi per indurre ischemia degli arti posteriori acuta o subacuta nel toposono descritti, e punti di riferimento anatomici precisi sono forniti.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Dumoxel</td></tr><tr><td>Dumont Style 5 Mini Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-14</td><td>Inox</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>7 - 0 Silk Suture</td><td>Sharpoint</td><td>DA-2527N</td><td></td></tr><tr><td>5 - 0 Coated Vicryl Suture</td><td>Ethicon</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Artifical Tears Ointment</td><td>Rugby Laboratories</td><td>0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Fine Cotton Swabs</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2DF</td><td></td></tr><tr><td>Ameroid Constrictors</td><td>Research Instruments SW</td><td>MMC-0.25 x 1.00-SS</td><td></td></tr><tr><td>Hot Bead Sterilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase Isothermal Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Moor LDPI</td><td>Moor Instruments</td><td>moorLDI2</td><td></td></tr><tr><td>moorLDI Measurement software</td><td>Moor Instruments</td><td>v. 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Cream</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia

malattia periferica arteriosa (PAD) è una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare nei paesi sviluppati, e modelli animali che riproducono in modo affidabile la malattia umana sono necessarie per lo sviluppo di nuove terapie per questa malattia. Il modello di topo hindlimb ischemia è stato ampiamente utilizzato per questo scopo, ma la pratica standard di indurre ischemia dell&#39;arto acuta mediante legatura dell&#39;arteria femorale può provocare la necrosi tissutale sostanziale, compromettere la capacità degli investigatori di studiare le risposte vascolari e tessuto muscolare scheletrico all&#39;ischemia . Un approccio alternativo alla legatura dell&#39;arteria femorale è l&#39;induzione di progressiva occlusione dell&#39;arteria femorale attraverso l&#39;uso di costrittori AMEROID. Quando posizionato intorno femorale uguali o differenti posizioni come i siti di legatura dell&#39;arteria femorale, questi dispositivi occludono l&#39;arteria più di 1 - 3 giorni con conseguente più graduale, subacuta ischemia. Ciò si traduce in meno consistente necrosi dei tessuti muscolo scheletrico, which può imitare più da vicino le risposte visto in PAD umana. Perché background genetico influenze esiti in entrambi i modelli di ischemia acuta e subacuta, considerazione del ceppo di topi in fase di studio è importante nella scelta del modello migliore. Questo documento descrive la procedura corretto posizionamento anatomico di legature o costrittori AMEROID sul mouse arteria femorale per indurre subacuta o ischemia degli arti posteriori acuta nel topo.

La corretta identificazione del sistema vascolare del mouse arti posteriori è fondamentale per garantire la riproducibilità delle tecniche per indurre sia subacuta e ischemia degli arti posteriori acuta, come descritto qui. Oltre alla variazione intrinseca in studi sugli animali, altri fattori possono introdurre variabilità laser Doppler perfusione (LDPI), compreso il tipo di anestesia, la posizione dell&#39;animale (vs supina prona), e la temperatura corporea (vedere <strong...

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Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.2K Views.  Duke University Medical Center. Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion. 

Video: Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Legatura dell&#39;arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Ricerca

Medicina

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Modello murino di ischemia degli arti posteriori

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Biologia

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to stimulate microcirculation. The choice of delivery method for these agents is important because the route of administration profoundly affects the bioactivity and efficacy of these agents1,2. In this article, we demonstrate how to locally administer a substance in ischemic hindlimbs by using a catheterized osmotic pump. This pump can deliver a fixed volume of aqueous solution continuously for an allotted period of time. We also present our mouse model of unilateral hindlimb ischemia induced by ligation of the common femoral artery proximal to the origin of profunda femoris and epigastrica arteries in the left hindlimb. Lastly, we describe the in vivo cannulation and ligation of the infrarenal abdominal aorta and perfusion of the hindlimb vasculature with Microfil, a silicone radiopaque casting agent. Microfil can perfuse and fill the entire vascular bed (arterial and venous), and because we have ligated the major vascular conduit for exit, the agent can be retained in the vasculature for future ex vivo imaging with the use of small specimen micro-CT3.

We show here the in vivo insertion of an osmotic pump for constant local drug delivery and the creation of hindlimb ischemia in a mouse model. Moreover, the hindlimb vasculature is perfused with Microfil, a silicone radiopaque agent, to prepare for micro-computed tomography (micro-CT) imaging.

Osmotica Drug Delivery per arti posteriori ischemico e la perfusione dei vasi con Microfil per Micro-Tomografia Computerizzata Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

Riproducibile Paraplegia da Toracica aortica occlusione in un modello murino di Spinal Cord ischemia-riperfusione

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Induzione di ictus ischemico e di ischemia-riperfusione nei topi mediante la tecnica di occlusione dell&#39;arteria Medio e visualizzazione di Infarct Area

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Occlusione dell'arteria media distale per sviluppare un modello murino di ictus ischemico

Induction of Acute Ischemic Stroke in Mice Using the Distal Middle Artery Occlusion Technique

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic stroke patients are eligible to receive intravascular thrombolysis or mechanical thrombectomy therapy within the optimal time window. Among those stroke survivors, around two-thirds suffer neurological dysfunctions over an extended period. Establishing a stable and repeatable experimental ischemic stroke model is extremely significant for further investigating the pathophysiological mechanisms and developing effective therapeutic strategies for ischemic stroke. The middle cerebral artery (MCA) represents the predominant location of ischemic stroke in humans, with the MCA occlusion serving as the frequently employed model of focal cerebral ischemia. In this protocol, we describe the methodology of establishing the distal MCA occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6 mice. Since the occlusion site is located at the cortical branch of MCA, this model generates a moderate infarcted lesion restricted to the cortex. Neurological behavioral and histopathological characterization have demonstrated visible motor dysfunction, neuron degeneration, and pronounced activation of microglia and astrocytes in this model. Thus, this dMCAO mouse model provides a valuable tool for investigating the ischemiastroke and worth of popularization.

Autore in primo piano: Stabilire un modello di occlusione MCA distale affidabile nei topi per la ricerca sull'ictus

Here, we present a protocol to establish a distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6J mice and evaluate the subsequent neurological behavior and histopathological features.

Induzione di ictus ischemico acuto nei topi utilizzando la tecnica di occlusione dell'arteria media distale

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic ...

Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia

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Legatura dell'arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto