Questo protocollo presenta come creare un modello di cancrena del piede del topo utilizzando la somministrazione di inibitori di massa e coagulazione dell'arteria femorale. La perfusione DiI consente quindi la visualizzazione ad alta risoluzione della vascolarizzazione del cuscinetto del piede. Questo modello è clinicamente rilevante e può essere utilizzato per test preclinici sui farmaci e per studiare l'ischemia degli arti.
La visualizzazione ad alta risoluzione della vascolarizzazione offre un mezzo tecnicamente facile per valutare la neovascolarizzazione. Questo modello di cancrena plantare ha importanti applicazioni nella ricerca preclinica della malattia arteriosa periferica e dell'ischemia critica degli arti. La perfusione DiI è uno strumento utile per studiare la neovascolarizzazione in modelli animali.
A dimostrare la procedura saranno Antoine Ribieras, di residente chirurgico, e Yulexi Ortiz, un ricercatore associato del mio laboratorio. Innanzitutto, creare una soluzione di lavoro DiI aggiungendo 200 microlitri di soluzione madre DiI a 10 millilitri della soluzione diluente di lavoro immediatamente prima dell'uso. Agitare la mano per mescolare bene.
Collegare due o tre rubinetti a tre vie e un ago a farfalla calibro 25 in serie. Preparare siringhe da 10 millilitri con quattro millilitri di PBS, 10 millilitri di soluzione DiI e 10 millilitri di formalina tamponata neutra al 10%. Collegare la siringa con formalina alla porta di afflusso prossimale e iniettare la soluzione per lavare l'aria dalla linea.
Quindi ruotare il rubinetto per chiudere la porta. Ripetere la stessa procedura, collegando le siringhe con DiI e quindi PBS rispettivamente alle porte di afflusso centrale e distale. Dopo l'eutanasia, posizionare l'animale in posizione supina su un cuscinetto assorbente e fissare le ascelle e gli arti inferiori con aghi.
Usando le forbici, fai un'incisione trasversale per aprire la cavità addominale, quindi esponi e dividi il diaframma sinistro e destro per accedere alla cavità toracica. Tagliare la parete toracica su entrambi i lati dello sterno dalle costole inferiori alla prima o alla seconda costola. Usa un emostato per afferrare l'estremità inferiore dello sterno e rifletterlo verso la testa dell'animale per esporre la cavità toracica.
Identifica il ventricolo sinistro, che appare di colore più chiaro rispetto al destro. Afferrare delicatamente il cuore con una pinza smussata e inserire l'ago a farfalla nel ventricolo sinistro. Utilizzare forbici o un ago calibro 18 per perforare l'atrio destro, consentendo al sangue e alle soluzioni di perfusione di tornare al cuore per drenare.
Aprire la porta della siringa con PBS e iniettare manualmente da due a quattro millilitri ad una velocità di uno o due millilitri al minuto per uno o due minuti per lavare il sangue dal sistema vascolare. Garantire una perfusione di successo osservando il sanguinamento dall'atrio destro. Dopo l'iniezione, chiudere la porta della siringa PBS.
Aprire la porta della siringa con DiI e iniettare da cinque a 10 millilitri ad una velocità di uno o due millilitri al minuto per cinque minuti. Dopo l'iniezione, chiudere la porta della siringa DiI e attendere due minuti per consentire l'incorporazione del colorante prima dell'iniezione del fissativo. Aprire la porta della siringa con formalina e iniettare da cinque a 10 millilitri ad una velocità di uno o due millilitri al minuto per cinque minuti.
Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago dal ventricolo sinistro. Usando forbici pesanti, dislocare la tibia alla caviglia, separando completamente i piedi sinistro e destro dalla parte inferiore delle gambe. Posizionare i piedi raccolti in una piastra da 12 pozzetti con uno o due millilitri di soluzione di formalina al 10%.
Avvolgere il piatto con un foglio e conservare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, sostituire la soluzione fissativa in una piastra a 12 pozzetti con uno o due millilitri di PBS per pozzetto. Fai un'incisione longitudinale con un bisturi sulla parte plantare e dorsale del piede.
Quindi utilizzando una pinza dentata e un piccolo emostato, rimuovere con cura tutta la pelle dal piede e dalle dita, non danneggiando i tessuti molli sottostanti. Per montare i tessuti, posizionare individualmente i piedi tra due vetrini per microscopio di vetro con un tampone per biopsia in schiuma ripiegato su se stesso a ciascuna estremità. Utilizzare due piccole clip leganti per comprimere le diapositive di vetro insieme a ciascuna estremità.
In alternativa, riportare il cuscinetto del piede su una piastra a 12 pozzetti con uno o due millilitri di PBS. Dopo averlo coperto con un foglio, conservalo a quattro gradi Celsius per mantenere la fluorescenza per un massimo di un mese. Accendere il sistema di imaging, avviare il software di acquisizione e utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento o a bassa apertura numerica per acquisire le immagini.
Fare clic su Sì nella finestra di dialogo Attiva fase. Attivare il laser a 561 nanometri nella scheda di configurazione. Nella schermata principale, attiva un percorso del fascio visibile facendo clic sul pulsante visibile.
Impostare un rilevatore sull'intervallo da 570 a 600 nanometri facendo clic sulla casella di controllo attiva corrispondente. Selezionare l'icona di scansione dei riquadri nella scheda di acquisizione e impostare la risoluzione desiderata. Posizionare il campione di tessuto montato a secco compresso tra i vetrini sul palco del microscopio e mettere a fuoco il tessuto.
Passare a un angolo dell'esempio. Nel menu di scansione delle tessere, fare clic sul pulsante Segna posizione. Passare all'angolo opposto e fare nuovamente clic sul pulsante di posizione del segno impostando i limiti di scansione.
Per impostare la profondità dello Z-stack, fare clic sul pulsante live. Passare al centro dell'esempio e utilizzare la manopola dell'asse z per scorrere fino alla parte inferiore del campione. Nella scheda di acquisizione sotto il menu Z-stack, fare clic sul pulsante Diinizio.
Scorri fino alla parte superiore dell'esempio e fai clic sul pulsante fine. Fare clic sulla dimensione z-step e impostare sul valore desiderato. Quindi fare clic su Start per iniziare l'acquisizione delle immagini.
La figura mostra la variazione della perdita di tessuto che ci si può aspettare da questo modello una settimana dopo l'intervento chirurgico con punteggi FABER registrati nell'angolo in basso a destra di ogni immagine. Le immagini al microscopio di ricostruzione rivelano una normale anatomia vascolare nel cuscinetto del piede di controllo non legato rispetto alla perfusione gravemente ridotta al cuscinetto del piede dell'arto posteriore legato cinque giorni dopo l'intervento chirurgico. 20 giorni dopo l'intervento chirurgico, la perfusione al cuscinetto del piede è migliorata in modo significativo, anche se non nella misura del controllo non legato.
Il video mostra che il rendering della superficie è stato creato utilizzando la funzionalità di animazione. Lavare tutte le bolle d'aria dal gruppo di perfusione. Se i polmoni si espandono e diventano rosa durante la perfusione, l'ago è penetrato nel ventricolo destro e deve essere leggermente retratto.
I tessuti degli arti possono essere utilizzati per l'immunocolorazione per valutare la necrosi muscolare, la rigenerazione dei tessuti, la densità dei vasi e il reclutamento di cellule progenitrici e altre cellule di riparazione dei tessuti. La tecnica della perfusione DiI in questo modello di cancrena murina è stata utilizzata in studi di terapie geniche e cellulari. La ricerca mira a migliorare la perfusione negli arti di pazienti con ischemia critica degli arti.
