L'obiettivo generale di questo esperimento, il nostro modello di ischemia hindlimb è quello di illuminare l'esperimento come base per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari degli agenti angiogenici putativi. Questo protocollo eroga uno standard per il test di possibili terapie angiogeniche in un piccolo modello animale con il potenziale per applicazioni future nel contesto clinico. Poiché la rivascolarizzazione non è adatta nel venti-trenta per cento dei pazienti critici con ischemia, l'angiogenesi terapeutica è emersa come una nuova strategia per migliorare la profusione di sangue nel sito ischemico.
Questo protocollo sperimentale potrebbe fornire una comprensione completa dei meccanismi attraverso i quali le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti nella misura della loro efficacia in ciascuno dei loro risultati. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del piede in un topo femmina C57 nero di 22 settimane, radersi i capelli dall'arto posteriore destro e fissare l'animale nella posizione dorsale a cubito su un cuscinetto riscaldato. Posizionare l'animale al microscopio di sezionamento.
E usa una lama chirurgica bisturi numero undici per fare un'incisione cutanea di un centimetro sulla coscia dell'arto posteriore destro. Sezionare contundente il grasso sottocutaneo per esporre il fascio neurovascolare. E usa pinzi appuntiti, forbici a molla e un portaaghi oftalmici per aprire la fodera ileofemorale membraneale per esporre i vasi iliac e femoral esterni distale.
Dopo aver sezionato e separato l'arteria e la vena dal nervo, utilizzare sette suture di polipropilene non assorbibili per legare l'arteria e la vena femorale distale e l'arteria iliaca esterna distale e la vena. L'identificazione dell'arteria iliaca esterna distale e la legatura e l'escissione dell'arteria iliaca esterna distale e femorale e delle vene sono fondamentali per il successo della procedura. Usa le forbici a molla per trasliare il segmento dell'arteria iliofemorale e le vene tra i nodi distale e prossimale.
E chiudere l'incisione con una sutura assorbibile. Quindi, fornire inter-peritonealmente soluzione antisedativa nell'animale e riportare il topo nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Per raccogliere i muscoli gastroclio, rimuovere la pelle da entrambi gli arti posteriori.
E usa il batuffolo di cotone per separare la pelle dai muscoli. Tenendo il tendine d'Achille, utilizzare le forbici a molla per separare il muscolo dalla tibia e dalla perone fino all'articolazione del ginocchio. E separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemio.
Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti del muscolo gastrocnemio a livello dell'articolazione del ginocchio. E usa il 10%trigasanth per posizionare i muscoli raccolti con un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero. Quindi, snap congelare i campioni in azoto liquido raffreddato isopentane per meno 80 gradi Celsius stoccaggio.
Per la cattura laser a microdisezione capillare, dopo aver ottenuto sezioni di 12 micrometri dei campioni muscolari, fissare i tessuti alle diapositive in 50 millilitri di acetone puro raffreddato per cinque minuti a meno venti gradi Celsius. Dopo l'essiccazione dell'aria e cerchiare ogni esemplare con una penna idrofobica. E reidratare i campioni con due cloruri di sodio molare in PBS a quattro gradi Celsius.
Al termine della reidratazione, etichettare i campioni con l'anticorpo primario appropriato di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. Seguito da due lavaggi di tre minuti in cloruro di sodio molare fresco in PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, etichettare le sezioni con un anticorpo secondario appropriato per trenta minuti a quattro gradi Celsius seguito da due lavaggi in cloruro di sodio in PBS come dimostrato.
Successivamente, etichettare i campioni con complesso di perossidasi coniugato avidina per trenta minuti a quattro gradi celsius. Seguito da un lavaggio e cinque minuti di etichettatura con substrato di perossidasi DAB. Al termine dell'incubazione, disidratare i tessuti in ghiaccio freddo sequenziale al 90% di etanolo e al 100% di emersioni di etanolo.
Quindi, utilizzare un successivo sistema di microdisezione, dotato di un laser a stato solido da 355 nanometri per sezionare 10.000 capillari per topo e catapultare i capillari della seziona in un cappuccio adesivo a tubo di microfugo. Come illustrato, una completa perdita di perfusione dell'arto posteriore si osserva immediatamente dopo l'induzione dell'ischemia dell'arto posteriore. La valutazione quantitativa del flusso sanguigno, espressa come rapporto tra isc e arto NISC, ha dimostrato una perfusione di sangue degli arti significativamente migliorata nei topi esposti allo stimolo pro-angiogenico ai giorni 15 e 45 post-HLI.
La quantificazione dei capillari positivi cd31 nelle sezioni istologiche delle sezioni del tessuto muscolare gastrocnomio mostra che la densità capillare è maggiore nell'arto ischemico rispetto all'arto non ischemico. Come previsto. Ma questo effetto viene ulteriormente amplificato dopo il trattamento con l'agente pro-angiogenico.
Anche la densità collaterale del vaso aumenta costantemente nell'arto ischemico e questo aumento è significativamente più elevato dopo l'esposizione con lo stimolo pro-angiogenico. L'analisi inversa della reazione a catena della transcriptasi polimerasi dell'espressione genica pro-angiogenica nelle cellule endoteliali positive del CD31 dimostra una chiara variazione nell'espressione genica tra topi esposti o meno all'agente pro-angiogenico. È importante utilizzare un ago oftalmico più vecchio per aprire la fodera iliofemorale membraneale per evitare lo strappi dell'arteria e della vena durante la dissezione del vaso.
Il vaso risponde all'ischemia hindlimb nelle misurazioni perfusioni basate su doppler laser e la quantificazione istologica della densità capillare del vaso ci consente di valutare l'angiogenesi.
