Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni della Nature Science Foundation della provincia di Hubei (2022CFC057).

Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Jianghan ed è stato condotto in conformità con le Linee Guida Etiche per gli Animali da Esperimento emesse dal Centro per il Controllo delle Malattie della Cina. In questo protocollo sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6J, di 10 settimane, del peso di 24-26 g. Tutti i topi sono stati alloggiati in un ambiente controllato con ciclo luce/buio di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.
1. Preparazione preoperatoria
NOTA: Gli strumenti e le apparecchiature chiave necessari per questo protocollo sono mostrati nella Figura 1.
<ol><li>Prima della procedura, sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave.</li>
	<li>Somministrare meloxicam per via sottocutanea alla dose di 5 mg/kg per analgesia 60 minuti prima dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Anestetizzare il topo con isoflurano al 5% in una camera di induzione.</li>
	<li>Pulire la tavola chirurgica con etanolo al 75% e azionare l'interruttore del riscaldamento con la temperatura impostata a 37 °C. Quindi, posiziona il mouse in una posizione laterale sinistra sulla tavola, con la testa posizionata lontano dal chirurgo e la coda rivolta verso il chirurgo.</li>
	<li>Applicare una maschera al viso del topo che fornisca un apporto costante del 2% di isoflurano e 0,3 L/min di ossigeno per l'anestesia di mantenimento. Applicare l'unguento per gli occhi sulla cornea per proteggerla dalla secchezza durante la procedura.</li>
	<li>Radi il pelo dall'orbita sinistra al condotto uditivo sinistro con un rasoio. Utilizzare creme depilatorie per rimuovere il pelo rimanente per la sterilizzazione.</li>
	<li>Preparare l'area chirurgica applicando tre volte il disinfettante a base di iodio povidone ed etanolo al 75%.</li>
</ol>2. Modello MCAO distale
<ol><li>Controlla se il topo è profondamente anestetizzato valutando i riflessi del pizzicamento del dito del piede.</li>
	<li>Praticare un'incisione verticale tra l'orbita sinistra e il condotto uditivo sinistro utilizzando una lama di bisturi sterile.</li>
	<li>Ritrarre i tessuti molli della pelle con i divaricatori ed esporre il muscolo temporale.</li>
	<li>Usa micropinze diritte per separare i segmenti apicale e dorsale del muscolo temporale dal cranio.</li>
	<li>Identificare la biforcazione dell'MCA, che assume una forma a "Y" sotto l'osso temporale con una tendenza verso la base del cranio (Figura 2A). NOTA: Se la biforcazione dell'MCA non è visivamente distinguibile (a causa di una variazione anatomicamente normale), accertare il vaso più rostrale.</li>
	<li>Usa un trapano cranico elettrico per assottigliare il cranio per creare una finestra ossea (4 mm di diametro) fino a quando la dura madre, con la sua consistenza traslucida, diventa visibile. NOTA: Aggiungere in modo intermittente gocce di soluzione fisiologica normale al cranio per evitare il surriscaldamento durante questo processo.</li>
	<li>Rimuovere la dura madre sopra l'arteria con una micro pinza curva per esporre il ramo MCA.</li>
	<li>Impostare l'elettrocauterizzazione a 7 W. Coagulare l'arteria utilizzando la pinza elettrica per coagulazione nei siti prossimali e distali rispetto alla biforcazione dell'MCA (Figura 2A). Quando la biforcazione non è visibile a causa di una variazione anatomica, eseguire la coagulazione sul ramo MCA accuratamente identificato (come menzionato sopra) in due posizioni separate a circa 1 mm di distanza13.</li>
	<li>Monitora il flusso sanguigno del ramo corticale sinistro dell'MCA utilizzando un misuratore di flusso sanguigno a macchie laser. NOTA: I topi che presentavano una riduzione del flusso sanguigno inferiore al 40% del valore basale dopo l'elettrocoagulazione sono stati esclusi dallo studio.</li>
	<li>Sutura il muscolo e la pelle separatamente utilizzando suture di acido poliglicolico 5-0. Applicare il gel di diclofenac sodico e l'unguento alla mupirocina sull'incisione cutanea utilizzando un batuffolo di cotone sterile.</li>
	<li>Posiziona il mouse in una camera di recupero. Monitora tutti i topi fino a quando non sono completamente svegli. Somministrare meloxicam (5 mg/kg, SC) per l'analgesia ogni 24 ore fino a 72 ore.</li>
</ol>3. Operazione fittizia
<ol><li>Riprodurre la stessa procedura sopra menzionata, escluso il processo di coagulazione arteriosa.</li>
</ol>4. Test comportamentali
NOTA: Prima del dMCAO, i topi sono stati sottoposti a training comportamentale due volte al giorno per 3 giorni. Il 3° giorno dopo il dMCAO, spostare i topi nella sala dei test comportamentali per un adattamento ambientale di 2 ore prima del test.
<ol><li>Test di forza di presa14 NOTA: Il misuratore della forza di presa comprende un estensimetro push-pull e una barra orizzontale in metallo.<ol><li>Afferra la base della coda del topo. Abbassare gradualmente il mouse verso la barra di presa in metallo fino a quando non afferra la barra orizzontale con entrambe le zampe anteriori (Figura 2B).</li>
		<li>Tirare il mouse all'indietro a una velocità costante di circa 2 cm/s e mantenere il corpo orizzontale.</li>
		<li>Registra la forza di picco in grammi (g) quando il topo rilascia le zampe anteriori dalla barra.</li>
	</ol></li>
	<li>Prova con i bastoncini15<ol><li>Posiziona il topo sulla cima di un palo di legno verticale (50 cm di altezza, 1 cm di diametro) con la testa rivolta verso l'alto e lascialo scendere dal palo (Figura 2B).</li>
		<li>Registra il tempo impiegato dal mouse per girarsi (inversione a T) e il tempo totale per scendere dal palo (T-total) con un tempo limite di 60 secondi.</li>
	</ol></li>
	<li>Test di rimozione del nastro adesivo16<ol><li>Tenere il mouse e applicare un cerotto di nastro adesivo (2 × 2 mm) alla zampa anteriore destra del mouse (Figura 2B).</li>
		<li>Rimetti il topo nella gabbia di allevamento e lascialo muovere liberamente.</li>
		<li>Registra il tempo impiegato dal mouse per rimuovere l'adesivo con un limite di 60 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Prova cilindro17<ol><li>Posizionare il topo in un cilindro di vetro trasparente aperto (diametro: 14 cm; altezza: 20 cm) e registrare il suo comportamento esplorativo spontaneo in piedi per 3 minuti utilizzando una telecamera (Figura 2B). NOTA: Durante la procedura sperimentale, due specchi sono stati posizionati lungo il cilindro per garantire una registrazione ottimale dei movimenti degli arti anteriori.</li>
		<li>Pulire il cilindro con etanolo al 75% per eliminare i segnali olfattivi residui prima di testare il mouse successivo.</li>
		<li>Riduci la velocità di riproduzione del video a 1/5 della velocità effettiva e conta il numero di tocchi con la zampa anteriore sinistra (L) o destra (R) o l'uso simultaneo di entrambe le zampe anteriori (B). Calcola il tasso di utilizzo della zampa anteriore destra come (L-R)/(L + R + B) × 100%.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Perfusione e preparazione del campione
<ol><li>Eutanasia del topo mediante sovradosaggio di pentobarbital per iniezione peritoneale (300 mg/kg). Posizionare il mouse in posizione supina e immobilizzare gli arti.</li>
	<li>Praticare un'incisione sulla linea mediana sulla pelle, partendo dalla cavità medio-addominale ed estendendosi verso la regione superiore del torace.</li>
	<li>Apri il torace usando le forbici chirurgiche e piega lo xifoide verso l'alto usando un emostato. Rimuovere con cautela il polmone e il diaframma per esporre il cuore.</li>
	<li>Inserire la punta dell'ago di perfusione nel ventricolo sinistro e perforare l'atrio destro con le forbici. Perfondere il cuore con 20 ml di soluzione fisiologica normale attraverso il ventricolo sinistro.</li>
	<li>Decapita il topo e taglia il cuoio capelluto lungo la linea mediana tra gli occhi. Taglia l'osso lungo entrambi i lati, partendo dalla base del cranio e aprendoti fino all'orbita.</li>
	<li>Solleva il calvario e stacca delicatamente il cervello dalla base del cranio usando una pinza. NOTA: I cervelli di metà dei topi sono stati sottoposti a colorazione con 2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro (TTC), mentre i cervelli dell'altra metà sono stati sottoposti a esame istologico.</li>
	<li>Immergere il cervello in una soluzione di paraformaldeide al 4% durante la notte per l'analisi istologica di follow-up.</li>
</ol>6. Identificazione del volume dell'infarto
<ol><li>Mettere il cervello in uno scomparto congelatore a -20 °C del frigorifero per 20 minuti.</li>
	<li>Posizionare il cervello nella matrice cerebrale di 1 mm e tagliare il cervello in sezioni coronariche con uno spessore di 2 mm utilizzando lame per microtomo.</li>
	<li>Trasferire le sezioni cerebrali in una piastra di coltura a 24 pozzetti e aggiungere il 2% di TTC per coprire il tessuto cerebrale. Mettere la piastra di coltura a 24 pozzetti in un forno a temperatura costante per 30 minuti con la temperatura impostata a 37 °C.</li>
	<li>Sollevare con cautela le sezioni cerebrali e fissarle in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 15 minuti.</li>
	<li>Eseguire la scansione ottica di queste sezioni cerebrali con una risoluzione di 1200 x 1200 dpi con una scandina.</li>
	<li>Misurare il volume dell'infarto cerebrale sommando l'area dell'infarto di ciascuna sezione (area dell'emisfero destro meno l'area illesa dell'emisfero sinistro) utilizzando il software Image J (https://imagej.net/software/imagej/index)18. Calcolare la percentuale di volume dell'infarto come volume/volume dell'infarto dell'emisfero destro × 100%.</li>
</ol>7. Analisi istopatologica e immunofluorescente
<ol><li>Prelevare i campioni di cervello dalla soluzione di paraformaldeide e sciacquarli con acqua corrente per 1 ora.</li>
	<li>Trasferire i campioni di cervello nella macchina di disidratazione dei tessuti di automazione. Avvia il programma preimpostato per la disidratazione, la vetrificazione e l'immersione in cera. Incorporare i campioni di cervello disidratato nella paraffina e tagliarli in sezioni spesse 5 μm con un microtomo.</li>
	<li>Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)<ol><li>Decerare le sezioni con xilene 3 volte per 8 minuti ciascuna.</li>
		<li>Reidratare le sezioni immergendole successivamente in etanolo a gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) e acqua distillata per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Colorare le sezioni con la soluzione di ematossilina per 5 minuti.</li>
		<li>Sciacquare le sezioni con acqua distillata per lavare il residuo di ematossilina, quindi immergerle in alcol di acido cloridrico al 5% per una differenziazione di 5 secondi. Lavare le sezioni con acqua distillata per 2 minuti.</li>
		<li>Colorare le sezioni con una soluzione di eosina per 30 s e risciacquare il liquido colorante in eccesso con acqua distillata.</li>
		<li>Immergere le sezioni in etanolo al 90%, etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene (2 volte) in successione per 5 minuti ogni volta. Montare le sezioni con un mezzo di montaggio balsamico neutro.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione in immunofluorescenza<ol><li>Decerare le sezioni con xilene 3 volte per 8 minuti ogni volta.</li>
		<li>Reidratare le sezioni immergendole successivamente in etanolo a gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) e acqua distillata per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Preriscaldare la soluzione di recupero dell'antigene citrato per farla bollire nel microonde. Immergere le sezioni nella soluzione di recupero dell'antigene. Riscaldare il tampone di recupero dell'antigene a bassa potenza (20 W) per 20 minuti.</li>
		<li>Spegni il microonde e lascia raffreddare il tampone di recupero dell'antigene a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Lavare le sezioni tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 0,1 mM per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Incubare le sezioni con una soluzione bloccante (albumina sierica bovina al 5%) a RT per 1 ora per bloccare il legame non specifico dell'immunoglobulina.</li>
		<li>Incubare le sezioni con anticorpi anti-NeuN di coniglio (1: 300), anticorpi anti-Iba-1 di coniglio (1: 500) e anticorpi anti-GFAP di topo (1: 500) a 4°C per una notte.</li>
		<li>Lavare le sezioni tre volte con 0,1 mM di PBS per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Incubare le sezioni con IgG coniugate Alexa 594 anti-coniglio di capra (1:500) o IgG coniugate Alexa 488 anti-topo di capra (1:500) per 1 ora a RT.</li>
		<li>Lavare le sezioni con 0,1 mM di PBS e montarle con un supporto di montaggio antisbiadimento contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).</li>
		<li>Acquisire immagini di tre campi microscopici (300 μm × 300 μm) all'interno della penombra ischemica utilizzando un microscopio a fluorescenza rispettivamente a 594 nm e 488 nm.</li>
		<li>Utilizzando il software ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/index), stimare la densità cellulare colorata positivamente facendo la media dei conteggi nella penombra ischemica19.</li>
	</ol></li>
</ol>

Occlusione dell'arteria media distale per sviluppare un modello murino di ictus ischemico

<ol>
	<li>Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperacute+management+of+ischemic+strokes:+JACC+Focus+Seminar.">Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar.</a> J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).</li><li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+burden+of+stroke,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+study+2016.">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).</li><li>Joo, H., Wang, G., George, M. 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Gli autori non hanno interessi contrastanti da rivelare.

Nell'attuale protocollo del modello dMCAO per elettrocoagulazione per craniotomia, le procedure chirurgiche sono condotte con un'invasività minima, in cui solo una parte del muscolo temporale viene separata per mitigare gli effetti avversi sulla funzione masticatoria. Tutti i topi si sono ripresi bene dopo la procedura, senza che siano stati osservati casi di difficoltà alimentari. L'MCA può essere facilmente individuato nell'osso temporale del topo, facilitando così l'identificazione precisa delle posizioni idonee p...

L'ictus è una comune malattia cerebrovascolare acuta caratterizzata da un'elevata incidenza di disabilità e mortalità1. Di tutti i casi di ictus, quasi l'80% appartiene all'ictus ischemico2. Fino ad ora, la trombolisi endovenosa rimane uno dei pochi approcci produttivi per il trattamento dell'ictus ischemico acuto. Tuttavia, l'efficacia del trattamento trombolitico è limitata dalla ristretta finestra temporale effettiva e dal verificarsi di trasformazione emorragica3. Nella fase di riabilitazione a lungo termine a seguito di un ictus ischemico, è probabile che un numero considerevole di pazienti manifesti disfunzioni neurologiche durature4. Sono urgentemente necessarie ulteriori indagini per svelare i meccanismi fisiopatologici alla base dell'ictus ischemico, nonché per facilitare lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate all'ictus ischemico. La creazione di un modello affidabile e replicabile di ictus ischemico è fondamentale per la ricerca di base e per la successiva ricerca traslazionale nel campo dell'ictus ischemico.
Nel 1981, Tamura et al. hanno sviluppato un modello di ischemia cerebrale focale impiegando l'elettrocoagulazione transcranica nel sito prossimale dell'arteria cerebrale media (MCA)5. Da allora, numerosi ricercatori hanno utilizzato varie metodologie come la legatura, la compressione o il clipping per indurre l'occlusione MCA distale (dMCAO) per stabilire modelli di ictus ischemico transitorio o permanente 6,7,8. Rispetto al modello a filamento, il modello dMCAO presenta notevoli vantaggi come dimensioni dell'infarto più piccole e un tasso di sopravvivenza più elevato, che lo rendono più adatto per studiare il recupero funzionale a lungo termine dopo l'ictus ischemico9. Inoltre, il modello dMCAO dimostra un tasso di sopravvivenza più elevato nei roditori anziani rispetto al modello a filamento, rendendolo uno strumento vantaggioso per studiare l'ictus ischemico in modelli animali anziani e in comorbidità10. È stato dimostrato che il modello di ictus fototrombotico (PT) possiede le caratteristiche di una minore invasività chirurgica e di un tasso di mortalità significativamente basso. Tuttavia, il modello PT mostra un grado maggiore di necrosi cellulare ed edema tissutale rispetto al modello dMCAO, portando all'assenza di circolazione collaterale11. Inoltre, è interessante notare che le lesioni ischemiche osservate nel modello PT derivano prevalentemente dall'occlusione microvascolare, che differisce sostanzialmente dall'ischemia cerebrale indotta da embolia dei grandi vasi nel modello dMCAO12.
In questo articolo, presentiamo la metodologia per indurre il modello murino di dMCAO coagulando l'MCA distale tramite craniotomia a finestra ossea piccola. Inoltre, abbiamo condotto esami istologici e valutazioni comportamentali per caratterizzare in modo completo gli insulti ischemici e gli esiti dell'ictus in questo modello sperimentale. Il nostro obiettivo è quello di far conoscere ai ricercatori questo modello e facilitare ulteriori indagini sui meccanismi patologici dell'ictus ischemico.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium 
			Chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108380</td>
			<td>Dye for TTC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>Corning (USA)</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Vessel for TTC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Wuhan Servicebio Technology 
			Co., Ltd.</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% bovine serum albumin</td>
			<td>Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.</td>
			<td>AR004</td>
			<td>Non-specific antigen blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Polyglycolic acid suture</td>
			<td>Jinhuan Medical Co., Ltd</td>
			<td>KCR531</td>
			<td>Material for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Midmark Corporation</td>
			<td>VMR</td>
			<td>Anesthetized animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium</td>
			<td>Beyotime Biotech</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Seal for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automation-tissue-dehydrating&#160; 
			machine</td>
			<td>Leica Biosystems (Germany)</td>
			<td>TP1020</td>
			<td>Dehydrate tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet (France)</td>
			<td>20220328</td>
			<td>Material for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diclofenac&#160;sodium&#160;gel</td>
			<td>Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical 
			&#160;Co., Ltd.</td>
			<td>H10950214</td>
			<td>Analgesia for animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill tip (0.8 mm)</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining solution</td>
			<td>Wuhan Servicebio Technology 
			Co., Ltd.</td>
			<td>G1001</td>
			<td>Dye for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>H44023098</td>
			<td>Material for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus (Japan)</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP Mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>3670</td>
			<td>Primary antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 
			488-conjugated IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>4408</td>
			<td>Second antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 
			594-conjugated IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>8889</td>
			<td>Second antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grip strength meter</td>
			<td>Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.</td>
			<td>XR501</td>
			<td>Equipment for behavioral test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin staining solution</td>
			<td>Wuhan Servicebio Technology 
			Co., Ltd.</td>
			<td>G1004</td>
			<td>Dye for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 Rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178846</td>
			<td>Primary antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td>Anesthetized animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser doppler blood flow meter</td>
			<td>Moor Instruments (UK)</td>
			<td>moorVMS</td>
			<td>Blood flow monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer-Ingelheim</td>
			<td>J20160020</td>
			<td>Analgesia for animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrill</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td>78001</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical instruments set</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td>SP0009-R</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td>
			<td>HM325</td>
			<td>Tissue section production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Leica Biosystems (Germany)</td>
			<td>819</td>
			<td>Tissue section production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopolar electrocoagulation generator</td>
			<td>Spring Scenery Medical Instrument 
			Co., Ltd.</td>
			<td>CZ0001</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupirocin ointment</td>
			<td>Tianjin Smith Kline &#38; French 
			Laboratories Ltd.</td>
			<td>H10930064</td>
			<td>Anti-infection for animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN Rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>24307</td>
			<td>Primary antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Absin Bioscience</td>
			<td>abs9177</td>
			<td>Seal for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding center</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Produce paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>Euthanized animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Rinsing for tissue section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Shenzhen Codos Electrical Appliances 
			Co.,Ltd.</td>
			<td>CP-9200</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate solution</td>
			<td>Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>P0083</td>
			<td>Antigen retrieval for IF staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of acute ischemic stroke in mice using the distal middle artery occlusion technique

L'ictus ischemico rimane la causa predominante di mortalità e compromissione funzionale tra le popolazioni adulte a livello globale. Solo una minoranza di pazienti con ictus ischemico è idonea a ricevere la trombolisi intravascolare o la terapia di trombectomia meccanica entro la finestra temporale ottimale. Tra i sopravvissuti all'ictus, circa due terzi soffrono di disfunzioni neurologiche per un periodo prolungato. La creazione di un modello sperimentale stabile e ripetibile di ictus ischemico è estremamente importante per indagare ulteriormente i meccanismi fisiopatologici e sviluppare strategie terapeutiche efficaci per l'ictus ischemico. L'arteria cerebrale media (MCA) rappresenta la posizione predominante dell'ictus ischemico nell'uomo, con l'occlusione MCA che funge da modello frequentemente impiegato di ischemia cerebrale focale. In questo protocollo, descriviamo la metodologia per stabilire il modello di occlusione MCA distale (dMCAO) attraverso l'elettrocoagulazione transcranica in topi C57BL/6. Poiché il sito di occlusione si trova nel ramo corticale dell'MCA, questo modello genera una lesione infartuale moderata limitata alla corteccia. In questo modello, la caratterizzazione neurologica, comportamentale e istopatologica ha dimostrato una visibile disfunzione motoria, degenerazione neuronale e pronunciata attivazione di microglia e astrociti. Pertanto, questo modello murino dMCAO fornisce uno strumento prezioso per indagare sull'ischemiaictus e merita la popolarità.

Stroke is a common acute cerebrovascular disease characterized by high incidences of disability and fatality1. Of all stroke cases, nearly 80% belong to ischemic stroke2. Up to now, intravenous thrombolysis remains one of a limited number of productive approaches for the treatment of acute ischemic stroke. However, the effectiveness of thrombolytic treatment is restricted by the narrow effective time window and the occurrence of hemorrhagic transformation3. In the long-term rehabilitation phase following an ischemic stroke, a considerable number of patients are likely to experience durable neurological dysfunctions4. Further investigation is urgently required to unravel the underlying pathophysiological mechanisms of ischemic stroke, as well as to facilitate the development of novel therapeutic strategies targeting ischemic stroke. The establishment of a dependable and replicable model of ischemic stroke is crucial for basic research as well as subsequent translational research in the field of ischemic stroke.
In 1981, Tamura et al. developed a focal cerebral ischemia model by employing transcranial electrocoagulation at the proximal site of the middle cerebral artery (MCA)5. Since then, numerous researchers have utilized various methodologies such as ligation, compression, or clipping to induce distal MCA occlusion (dMCAO) for establishing transient or permanent ischemic stroke models6,7,8. Compared to the filament model, the dMCAO model exhibits notable advantages such as smaller infarct size and higher survival rate, rendering it more suitable for investigating long-term functional recovery subsequent to ischemic stroke9. In addition, the dMCAO model demonstrates a higher survival rate in aged rodents compared to the filament model, making it an advantageous tool for investigating ischemic stroke in elderly and comorbid animal models10. The photothrombotic (PT) stroke model has been demonstrated to possess the characteristics of less surgical invasiveness and a significantly low mortality rate. However, the PT model exhibits a greater degree of cellular necrosis and tissue edema compared to the dMCAO model, leading to the absence of collateral circulation11. Furthermore, it is noteworthy that the ischemic lesions observed in the PT model predominantly arise from microvascular occlusion, which differs substantially from the cerebral ischemia induced by large vessel embolism in the dMCAO model12.
In this paper, we present the methodology for inducing the murine dMCAO model by coagulating the distal MCA via small bone window craniotomy. Additionally, we conducted histological examinations and behavioral evaluations to comprehensively characterize the ischemic insults and stroke outcomes in this experimental model. We aim to acquaint researchers with this model and facilitate further investigations into the pathologic mechanisms of ischemic stroke.

Autore in primo piano: Stabilire un modello di occlusione MCA distale affidabile nei topi per la ricerca sull'ictus

Induzione di ictus ischemico acuto nei topi utilizzando la tecnica di occlusione dell'arteria media distale

In the present research, we aim to provide a comprehensive and detailed protocol for establish middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6J mice using transcranial electrocoagulation and we evaluated the subsequent neurological behavior and histopathological features. The middle cerebral artery or MCA is recognized as the primary site of ischemic stroke in humans. The MCA occlusion methods, including technique, photochemical introduction, and occlusion have been extensively employed to induce focal cerebral ischemia in rodents.Compared to other ischemia stroke models, this model has the advantage of less surgical invasiveness, smaller infarct size, and higher survival rate, rendering it more suitable for investigation the long-term functional recovery after ischemic stroke. Overall, the current approach effectively generates a reliable experimental ischemic stroke model that exhibits high survivability and excellent repeatability. Consequently, this methodology serves as an invaluable tool for both foundation and translational research in the field of stroke.In the future, we will employ behavior paradigms such as novel object recognition and water maze to investigate the dynamic alterations in long-term learning and memory capabilities among distal MCA-occluded mice. This will enable us to ascertain the viability of utilizing them as animal model for cognition-impairment studies post-stroke.

Gli strumenti chiave utilizzati per eseguire il dMCAO sono il set di strumenti microchirurgici, il vaporizzatore di isoflurano e il generatore di elettrocoagulazione microchirurgica monopolare mostrato nella Figura 1. La procedura sperimentale di questo studio è illustrata nella Figura 2. In breve, è stata impiegata una craniotomia a finestra ossea piccola per esporre l'MCA distale, che è stato successivamente coagulato per indurre un'ischemia cerebrale foca...

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Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello di occlusione dell'arteria cerebrale media distale (dMCAO) attraverso l'elettrocoagulazione transcranica in topi C57BL/6J e valutare il successivo comportamento neurologico e le caratteristiche istopatologiche.

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic ...

Nella presente ricerca, miriamo a fornire un protocollo completo e dettagliato per stabilire un modello di occlusione dell'arteria cerebrale media in topi C57BL/6J utilizzando l'elettrocoagulazione transcranica e abbiamo valutato il successivo comportamento neurologico e le caratteristiche istopatologiche. L'arteria cerebrale media o MCA è riconosciuta come il sito principale dell'ictus ischemico nell'uomo. I metodi di occlusione MCA, compresa la tecnica, l'introduzione fotochimica e l'occlusione, sono stati ampiamente impiegati per indurre l'ischemia cerebrale focale nei roditori.Rispetto ad altri modelli di ictus ischemico, questo modello ha il vantaggio di una minore invasività chirurgica, dimensioni dell'infarto più piccole e un tasso di sopravvivenza più elevato, rendendolo più adatto per lo studio del recupero funzionale a lungo termine dopo ictus ischemico. Nel complesso, l'approccio attuale genera efficacemente un modello sperimentale affidabile di ictus ischemico che mostra un'elevata sopravvivenza e un'eccellente ripetibilità. Di conseguenza, questa metodologia funge da strumento inestimabile sia per la ricerca di base che per la ricerca traslazionale nel campo dell'ictus.In futuro, impiegheremo paradigmi comportamentali come il riconoscimento di nuovi oggetti e il labirinto d'acqua per studiare le alterazioni dinamiche nelle capacità di apprendimento e memoria a lungo termine tra i topi occlusi con MCA distale. Questo ci permetterà di accertare la fattibilità di utilizzarli come modello animale per studi di compromissione cognitiva post-ictus.

induction-acute-ischemic-stroke-mice-using-distal-middle-artery

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Induction of Acute Ischemic Stroke in Mice Using the Distal Middle Artery Occlusion Technique

1.2K Views.  Jianghan University. Nella presente ricerca, miriamo a fornire un protocollo completo e dettagliato per stabilire un modello di occlusione dell'arteria cerebrale media in topi C57BL/6J utilizzando l'elettrocoagulazione transcranica e abbiamo valutato il successivo comportamento neurologico e le caratteristiche istopatologiche. L'arteria cerebrale media o MCA è riconosciuta come il sito principale dell'ictus ischemico nell'uomo. I metodi di occlusione MCA, compresa la tecnica, l'introduzione fotochimica e l'occlu...

Video: Autore in primo piano: Stabilire un modello di occlusione MCA distale affidabile nei topi per la ricerca sull'ictus

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic stroke patients are eligible to receive intravascular thrombolysis or mechanical thrombectomy therapy within the optimal time window. Among those stroke survivors, around two-thirds suffer neurological dysfunctions over an extended period. Establishing a stable and repeatable experimental ischemic stroke model is extremely significant for further investigating the pathophysiological mechanisms and developing effective therapeutic strategies for ischemic stroke. The middle cerebral artery (MCA) represents the predominant location of ischemic stroke in humans, with the MCA occlusion serving as the frequently employed model of focal cerebral ischemia. In this protocol, we describe the methodology of establishing the distal MCA occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6 mice. Since the occlusion site is located at the cortical branch of MCA, this model generates a moderate infarcted lesion restricted to the cortex. Neurological behavioral and histopathological characterization have demonstrated visible motor dysfunction, neuron degeneration, and pronounced activation of microglia and astrocytes in this model. Thus, this dMCAO mouse model provides a valuable tool for investigating the ischemiastroke and worth of popularization.

Here, we present a protocol to establish a distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6J mice and evaluate the subsequent neurological behavior and histopathological features.

Ricerca

Neuroscienze

Distal Middle Artery Occlusion Procedure to Induce Ischemic Stroke in Mice

To begin, wipe the heating surgery board with 75%ethanol and set the temperature to 37 degrees Celsius. Place the anesthetized mouse in a right lateral position on the board with the head positioned away. To protect the cornea from drying, apply eye ointment.After shaving the fur from the left orbit to the left ear canal, use a depilatory cream to remove the remaining fur. Disinfect the surgical area three times with povidone iodine and 75%ethanol. Perform a toe-pinch assessment.After making a vertical incision between the left orbit and the left ear canal, retract the soft skin tissue to expose the temporal muscle. Using straight micro forceps, separate the apical and dorsal segments of the temporal muscle from the skull. Identify the Y-shaped bifurcation of the middle cerebral artery, or MCA, beneath the temporal bone.Then using an electric cranial drill, thin out the skull to make a bone window until the dura mater becomes visible. Remove the dura mater above the MCA with curved micro forceps. Using electric coagulation forceps, coagulate the artery at the site's proximal and distal to the bifurcation.Monitor the blood flow of the left MCA cortical branch in a laser speckle blood-flow meter. Then suture the muscle and the skin separately with polyglycolic acid sutures, and apply diclofenac sodium gel and mupirocin ointment to the skin incision. Place the mouse in a recovery chamber.

Procedura di occlusione dell'arteria media distale per indurre l'ictus ischemico nei topi

Neurological Behavioral Tests in Distal Middle Artery Occluded Mice to Study Ischemic Stroke Outcomes

To perform the grip strength test in the previously developed distal MCAO model, grasp the posterior section of a mouse tail and gradually lower the mouse until it holds the horizontal bar with both forepaws. Keeping the body horizontal, pull the mouse backward at a constant speed of two centimeters per second. When the mouse releases its forepaws from the bar, record the peak force in grams.For the pole test, place the mouse vertically on the top of a wooden pole. Record the time taken by the mouse to turn around and the total time to climb down the pole with a 60-second cutoff time. To conduct the adhesive test, attach a patch of adhesive tape to the right forepaw of the mouse.Put the mouse back into the rearing cage and record the time taken by the mouse to remove the adhesive with a 60-second cutoff time. To conduct a cylinder test, wipe an open top clear glass cylinder with 75%ethanol, and place the mouse in it. Using a camera, record its spontaneous standing exploratory behavior for three minutes.The distal MCAO mice showed a significant reduction in grip strength and contralateral forepaw usage rate as compared to the sham operated group. Further, the occluded mice showed a significant increase in the descent time in the pole test, and in the time taken to remove the adhesive.

Test neurologici comportamentali in topi occlusi con arteria media distale per studiare gli esiti dell'ictus ischemico

Mouse Brain Histology to Study the Pathological Mechanisms of Ischemic Stroke Induced by Distal Middle Artery Occlusion

To begin, obtain the dissected brain of the euthanized distal MCAO mouse model after behavioral testing, and place it in a minus 20 degrees Celsius freezer for 20 minutes. Then position the brain into a one-millimeter brain matrix. And using microtone blades, slice the brain into two-millimeter-thick coronary sections.Transfer the brain sections to a 24-well culture plate and add 2%TTC to cover the brain tissue. Incubate the plate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Then carefully fix the brain section in 4%Paraldehyde solution for 15 minutes.Using a scanister, perform optical scanning of the brain sections. The histological analysis of the brain revealed the disordered arrangement of neuron cells and a significant reduction in the density of NeuN positive cells in the peri-infarct area of the distal MCA occluded mice.