Gli autori ringraziano Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e lo Small Animal Imaging Stanford Nucleo per l&#39;assistenza tecnica. Gli autori hanno anche ringraziare AM Bickford, Inc. per il supporto di attrezzature veterinarie. Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca dal National Institutes of Health (R01 HL-75774, CA098303 R01, R21 HL085743, 1K12 HL087746), il tabacco California sul programma di ricerca sulle malattie della University of California (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e l&#39;Istituto di Medicina Rigenerativa della California (RS1-00183). NH è sostenuto da una borsa di studio della American Heart Association.

1. Induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterali <ol><li> Gli strumenti chirurgici necessari per questa operazione sono: belle pinze a punta, pinze a punta, forbici primavera, forbici chirurgiche, porta aghi, e divaricatore. Noi facciamo il nostro retrattore usando una graffetta, perché è più piccolo di divaricatori disponibili in commercio. Sterilizzare questi strumenti prima di un intervento da parte di un autoclave o di un hot-tallone sterilizzatore. Uno strumento di cauterizzazione e sterile, tamponi di cotone fatto bene sarà anche necessaria per questo tipo di chirurgia. Si raccomanda che gli strumenti essere ri-sterilizzati alle punte, se necessario durante la procedura. </li><li> Quando gli strumenti sono pronti, posizionare il mouse nella camera di induzione dell&#39;anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min. </li><li> Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l&#39;animale dalla camera di induzione. Si consiglia di lavare l&#39;anestetico dalla finestra prima di aprire il coperchio, per ridurre l&#39;esposizione dell&#39;operatore isoflurano. </li><li> Poi posto l&#39;animale in posizione supina sul tavolo pre-operativi e collegarlo a un flusso continuo di isoflurano. Utilizzando un rasoio elettrico, togliere i capelli dalla arti posteriori. Applicare la crema di rimozione dei capelli per rimuovere completamente i capelli. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina su un pad riscaldato drappeggiato sul tavolo operatorio, e collegarlo a un flusso continuo di isoflurano. Estendere e proteggere le arti posteriori con un pezzo di nastro adesivo. Una volta che l&#39;arti posteriori è sicuro, pulire la pelle con tre scrub alternati Betadine e alcol. Per il resto della procedura chirurgica, l&#39;uso di un microscopio a dissezione 10X o 20X di ingrandimento di ottenere una visione allargata della regione degli arti posteriori. </li><li> Utilizzando una pinza sottile e forbici chirurgiche, fare un&#39;incisione della pelle, circa 1 cm di lunghezza, dal ginocchio verso la coscia mediale. </li><li> Utilizzando tampone fosfato (PBS)-tamponi di cotone inumiditi multa a punta, delicatamente spazzare via tessuto adiposo sottocutaneo che circondano il muscolo della coscia. </li><li> Successivamente, applicare il cauterio trasversalmente a incidere e sezionare attraverso il tessuto grasso sottocutaneo per rivelare l&#39;arteria femorale sottostante. </li><li> Utilizzare un divaricatore per aprire la ferita e per ottenere una migliore visione del sistema vascolare delle estremità inferiori. </li><li> Utilizzando una pinza sottile e un batuffolo di cotone sottile a punta, delicatamente trafiggerà la guaina membranosa femorale per esporre il fascio neurovascolare. </li><li> Poi, utilizzando una serie pulita di una pinza sottile e tampone di cotone, sezionare e separare l&#39;arteria femorale dalla vena femorale e al nervo posizione prossimale vicino all&#39;inguine. Dopo la dissezione, passare un filo di sutura di seta sotto 7-0 alla fine prossimale dell&#39;arteria femorale. Occludere l&#39;arteria femorale prossimale con doppi nodi. Posizionare la cravatta sulla nave come prossimale nella ferita il più possibile in modo da lasciare lunghezza per il pareggio secondo e un segmento di intervento che verranno recisi. </li><li> Separare l&#39;arteria femorale dalla vena femorale nella posizione distale vicino al ginocchio. Passare un filo di sutura sotto 7-0 alla fine distale dell&#39;arteria femorale prossimale all&#39;arteria poplitea. Occludere il vaso con doppi nodi. </li><li> Occludere l&#39;arteria femorale distale con una seconda serie di doppi nodi appena prossimale alla prima serie di nodi. Questa seconda serie di punti di sutura saranno utilizzati per la presa l&#39;arteria durante la procedura di transazione. </li><li> Allo stesso modo, per scopi di presa, occludere l&#39;arteria femorale prossimale con una seconda serie di doppi nodi appena distale rispetto alla prima serie di nodi. </li><li> Transetto il segmento di arteria femorale tra i nodi distali e prossimali con un tampone di cotone sottile a punta e un paio di forbici primavera. Fare attenzione a non forare la parete della vena femorale. </li><li> Rimuovere il riavvolgitore e chiudere l&#39;incisione con 5-0 punti di sutura Vicryl. Questi punti di sutura non devono essere rimosse in un secondo momento, come si dissolvono da soli. </li><li> Una volta che l&#39;incisione è chiuso, l&#39;animale posto in cima ad un pad riscaldato drappeggiata nella gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando sveglio. </li><li> Dopo animale ha recuperato per 1 ora, procedere con il passaggio del sangue perfusione laser Doppler per confermare l&#39;induzione di ischemia. </li></ol> 2. Laser Doppler sangue perfusione <ol><li> Per iniziare la perfusione laser Doppler passo, posizionare il mouse nella camera di induzione dell&#39;anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min. </li><li> Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l&#39;animale dalla camera di induzione. Si consiglia di lavare l&#39;anestetico dalla finestra prima di aprire il coperchio, per ridurre l&#39;esposizione dell&#39;operatore isoflurano. </li><li> Posto l&#39;animale sul pre-tavolo operatorio collegato al flusso continuo di isoflurano. Quindi rimuovere il pelo dal arti posteriori con un rasoio elettrico seguito da crema di rimozione dei capelli, se necessario. </li><li> Dopo aver rimosso i capelli,posto l&#39;animale su una superficie di 37 ° C riscaldata per 5 minuti sotto flusso continuo di isoflurano. Monitorare la temperatura interna per assicurare euthermia, come sbalzi di temperatura sarà notevolmente influenzare la perfusione. </li><li> Dopo 5 minuti, mettere l&#39;animale in posizione supina su una base non-riflettenti che assorbono la luce di superficie come colore verde panno, collegato ad un flusso continuo di isoflurano. Estendere l&#39;arti posteriori. </li><li> Successivamente, accendere il laser Doppler imager e il software di acquisizione e inizializzare il software. Specificare la dimensione del campo visivo e la risoluzione. E &#39;meglio tenere il campo visivo e la densità dei pixel coerenti tra gli animali in modo da rendere più facile l&#39;analisi future. </li><li> Aprire un nuovo file. Premere start per iniziare l&#39;acquisizione dei dati immagine. In generale, l&#39;imager rileva automaticamente la distanza del mouse, ma se richiesto, specificare la distanza degli animali per l&#39;imager. Il laser mostra i confini del campo di vista e quindi iniziare l&#39;acquisizione dati. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione è stata completata, l&#39;immagine inizia a mostrare una gamma di colori che sono indicative del livello di perfusione di sangue alle gambe. I colori possono essere impostati per una vasta perfusione specifica per confrontare meglio i dati tra gli animali. </li><li> Quando l&#39;acquisizione dei dati è completa, salvare il file. </li><li> Poi rispedire l&#39;animale verso la gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando l&#39;animale sveglio. </li><li> Per analizzare i dati, utilizzare la regolazione della soglia del software di analisi per sottrarre qualsiasi rumore di fondo. Una soglia di 0,2 di solito è un valore ragionevole. Selezionare 2 regioni di interesse, o ROI, che coprono ogni area degli arti posteriori. Una varietà di punti di riferimento possono essere utilizzate per standardizzare il ROI tra le arti e gli animali. Quindi determinare la perfusione media e variabilità del ROI. La differenza e il rapporto perfusione perfusione tra l&#39;arto ischemico e degli arti di controllo può essere facilmente determinato. </li><li> Questa procedura può essere ripetuta per seguire i cambiamenti della perfusione degli arti posteriori nel tempo. Ad un certo punto di tempo desiderato, l&#39;animale può essere eutanasia per la valutazione della funzione di tessuti e di confronto per i dati delle immagini di perfusione. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: L&#39;anatomia della vascolarizzazione degli arti posteriori è illustrato nella figura 1 2. Un diagramma rappresentante della arti posteriori dopo espianto arteria femorale è illustrato nella figura 2. Per confermare l&#39;induzione di ischemia agli arti posteriori, l&#39;analisi della perfusione laser Doppler immagine mostra una drastica riduzione del flusso di sangue per l&#39;arto ischemico, rispetto al controllo degli arti, come mostrato nella Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="Figura 1" width="600" height="406" /> Figura 1. Anatomia della vascolarizzazione degli arti posteriori. Asterischi indicano le posizioni dei legatura per l&#39;induzione di ischemia degli arti posteriori. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="Immagine 2" width="600" height="450" /> Figura 2. Diagramma rappresentante che mostra l&#39;anatomia delle arti posteriori dopo la legatura dell&#39;arteria femorale nei siti prossimale e distale dopo la rimozione l&#39;arteria femorale. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="Figura 3" width="600" height="256" /> Figura 3. Laser Doppler immagini che mostrano il flusso di sangue prima e dopo l&#39;induzione di ischemia agli arti posteriori sinistra (indicato dalla freccia).

<ol>
	<li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia.">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The anatomy of the laboratory mouse. , (1976).</li><li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization.">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li><li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li></ol>

Ci sono alcune fonti di variabilità di prendere in considerazione durante la pianificazione e l&#39;esecuzione di modelli di ischemia degli arti posteriori. In primo luogo, il livello di ischemia può variare a seconda della posizione della legatura rispetto a quella dei rami laterali. Pertanto, per coerenza del modello, gli animali devono subire lo stesso livello di legatura arteriosa. Un&#39;altra fonte di variabilità nel recupero ischemico è legato alla età degli animali, con gli animali giovani (6-8 settimane) con i tassi di recupero più veloce e più completa di animali più vecchi (8-10 mesi), valutata in base emodinamica (cioè laser Doppler perfusione) o funzionale (cioè di test tapis roulant) misure. Per gli studi in cui si sta valutando un agente angiogenico, può essere preferibile utilizzare animali più vecchi, perché la differenza maggiore tra i gruppi possono essere osservati con un intervento terapeutico. Al contrario, per gli studi in cui si sta valutando un anti-angiogenico fattore, può essere preferibile utilizzare animali più giovani per massimizzare la misura 3 effetto. Se eseguito correttamente, ci dovrebbe essere complicazioni minime come sanguinamento, infezione, o la mortalità. Se l&#39;emorragia si verifica dalla rottura accidentale della vena femorale o di altre navi, la pressione moderata con un applicatore con punta di cotone sterile o garza deve essere applicato al sito di emorragia fino a quando l&#39;emorragia si ferma. Gli animali che presentano segni di infezione devono essere trattati con agenti anti-infettivi. Animali espositrici cancrena significativo potrebbe essere necessario beeuthanized. Questa complicanza è più comune negli animali più vecchi, e in alcuni ceppi, come topi BALB c 4. Inoltre, il modello di ischemia degli arti posteriori possono causare dolore da lieve a moderata. Pertanto, gli analgesici come la buprenorfina o carprofene deve essere somministrato come necessari per il trattamento del dolore, secondo le raccomandazioni del IACUC. In conclusione, abbiamo dimostrato un metodo semplice e riproducibile per lo studio PAD in un modello murino di ischemia degli arti posteriori. Il modello di ischemia degli arti posteriori con l&#39;analisi laser Doppler è un sistema eccellente per studiare patologie vascolari e per la valutazione dei candidati terapeutici.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constix Cotton Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Contec</td>
<td>SC-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine (Povidone-iodine)</td>
<td>Reagent</td>
<td>PDI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Kendall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>7-0 silk suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Genzyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 vicryl suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Ethicon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electric shaver</td>
<td>Tool</td>
<td>GE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cautery</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System</td>
<td>Equipment</td>
<td>Perimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model of hindlimb ischemia 

Negli Stati Uniti, malattia arteriosa periferica (PAD) colpisce circa 10 milioni di persone, ed è anche diffusa in tutto il mondo. Terapie mediche per alleviare la sintomatologia sono limitati. Interventi chirurgici o endovascolari sono utili per alcuni individui, ma a lungo termine i risultati sono spesso deludenti. Di conseguenza, vi è la necessità per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di PAD. Il murini preparazione ischemia degli arti posteriori è un modello di PAD, ed è utile per testare nuove terapie. Rispetto ad altri modelli di ischemia tissutale, come la legatura dell&#39;arteria coronarica o cerebrale, la legatura dell&#39;arteria femorale prevede un modello più semplice del tessuto ischemico. Altri vantaggi di questo modello sono la facilità di accesso all&#39;arteria femorale e tasso di mortalità bassa. In questo video, dimostriamo la metodologia per il modello murino di ischemia hindimb unilaterale. I materiali e procedure specifiche per la creazione e la valutazione del modello sarà descritto, compresa la valutazione della perfusione con laser Doppler. Questo protocollo può essere utilizzato anche per il trapianto e non invasivo il monitoraggio delle cellule, che è dimostrato da Huang et al. 1.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of Hindlimb Ischemia at JoVE.com

Murine Model of Hindlimb Ischemia

La procedura chirurgica per l&#39;induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterale è dimostrato, con la conferma di ischemia da imaging laser Doppler perfusione.

Modello murino di ischemia degli arti posteriori

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

57.1K Views.  Stanford University. La procedura chirurgica per l'induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterale è dimostrato, con la conferma di ischemia da imaging laser Doppler perfusione.

Video: Murine Model of Hindlimb Ischemia

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

Il modello di encefalopatia ipossico ischemica di ischemia perinatale

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Ricerca

Biologia

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Cellule embrionali staminali endoteliali derivati ​​dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD-Legatura: un modello murino di infarto miocardico

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying disuse-atrophy in rodents 4-6. Our study evaluated an alternant method to the gold-standard Morey-Holton HU tail-traction technique in mice. Fifty-four female mice (4-8 mo.) were HU for 14 days (n=34) or 28 days (n=20). Recovery from HU was assessed after 3 days of normal cage ambulation following HU (n=22). Aged matched mice (n=76) served as weight-bearing controls.
Prior to HU a tail ring was formed with a 2-0 sterile surgical steel wire that was passed through the 5th, 6th, or 7th inter-vertebral disc space and shaped into a ring from which the mice were suspended. Vertebral location for the tail-ring was selected to appropriately balance animal body weight without interfering with defecation.
We determined the success of this novel HU technique by assessing body weight before and after HU, degree of soleus atrophy, and adrenal mass following HU. Body weight of the mice prior to HU (24.3 &plusmn; 2.9g) did not significantly decline immediately after 14d of HU (22.7 &plusmn; 1.9g), 28d of HU (21.3 + 2.1g) or after 3 days recovery (24.0 &plusmn; 1.8g). Soleus muscle mass significantly declined (-39.1%, and -46.6%) following HU for 14 days and 28 days respectively (p&lt;0.001). Following 3 days of recovery soleus mass significantly increased to 74% of control values. Adrenal weights of HU mice were not different compared to control mice.
The success of our novel HU method is evidenced by the maintenance of animal body weight, comparable adrenal gland weights, and soleus atrophy following HU, corresponding to expected literature values 2, 7, 8. The primary advantages of this HU method include: 1) ease of tail examination during suspension; 2) decreased likelihood of cyanotic, inflamed, and/or necrotic tails frequently observed with tail-taping and HU; 3) no possibility of mice chewing the traction tape and coming out of the suspension apparatus; and 4) rapid recovery and normal cage activity immediately after HU.

We developed an alternant hindlimb unloading model in mice. The primary advantage of our hindlimb unloading tail-ring method over the conventional Morey-Holton tail-traction technique is a simple straightforward procedure that minimizes stress upon the animal.

Un metodo alternant al tradizionale modello della NASA arti posteriori di scarico in topi

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

La murino colina-carenti, etionina-completati (CDE) dieta modello della lesione epatica cronica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. Bariatric surgery is currently the most effective long-term treatment for obesity. In addition to weight loss, bariatric surgery produces additional health benefits such as remission of type 2 diabetes, remission of hypertension, and decreased risk of developing certain types of cancer. The mechanisms beyond weight loss for these benefits remain incompletely defined. Therefore, animal models of bariatric surgery are being developed and validated to identify the mechanisms leading to these benefits, with the goal of improving understanding of gastrointestinal physiology and identifying new therapeutic targets. VSG has become the most commonly performed bariatric procedure in the clinic in the United States because it is highly effective at producing weight loss and metabolic improvement, and is simpler to perform than other bariatric procedures. Therefore, we have developed and validated a murine model of VSG. This murine VSG model recapitulates many of the effects of VSG seen in humans, including improved glucose and blood pressure regulation. The method is based on isolation of the stomach, ligation of gastric vessels, and removal of 70% of the stomach by transecting along the greater curvature of the stomach. We have successfully applied this surgical protocol to various genetically modified mouse lines to define the mechanistic contributors to the benefits of VSG. Furthermore, this murine VSG model has been combined with other surgical techniques, to achieve deeper mechanistic insight. Therefore, this is a simple and versatile model for studying gastrointestinal physiology and the health benefits of bariatric surgery.

The following describes the performance of vertical sleeve gastrectomy in mice. This is a type of weight-loss surgery that involves removal of approximately 70% of the stomach.

Un modello murino di gastrectomia verticale

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Un modello Murine di una ferita da ustione ricostruita con un innesto di pelle allogenica

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most animal laboratories.&#160;Contrary to the conventional approach for double ligation of the femoral artery (DLFA), a smaller incision on the right inguinal region was made to expose the proximal femoral artery (FA) to perform DLFA. Then, using a 7-0 suture, the incision was dragged to the knee region to expose the distal FA. Magnetic resonance imaging (MRI) on bilateral hind limbs was used to detect FA occlusion after the surgery. At 0, 1, 3, 5, and 7 days after the surgery, functional recovery of the hind limbs was visually assessed and graded using the Tarlov scale. Histologic evaluation was performed after euthanizing the animals 7 days after DLFA. The procedures were successfully performed on the right leg in ten ApoE-/- mice, and no mice died during subsequent observation. The incision sizes in all 10 mice were less than 5 mm (4.2 &#177; 0.63 mm). MRI results showed that FA blood flow in the ischemic side was clearly blocked. The Tarlov scale results demonstrated that hind limb function significantly decreased after the procedure and slowly recovered over the following 7 days. Histologic evaluation showed a significant inflammatory response on the ischemic side and reduced microvascular density in the ischemic hind limb. In conclusion, this study introduces a modified technique using a miniature incision to perform hind limb ischemia (HLI) using DLFA.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

This article demonstrates an efficient surgical approach to establish acute ischemia in mice with a small incision. This approach can be applied by most research groups without any laboratory upgrades.

Un modello chirurgico modificato di ischemia dell'arto posteriore in ApoE-/- Topi utilizzando un'incisione in miniatura

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...