Name: a novel behavioral assay to investigate gustatory responses of individual, freely-moving bumble bees (bombus terrestris)
Uploaded: 2016-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione Leverhulme Trust (RPG-2012-708) e una borsa di studio BBSRC (BB / M00709X / 1) per GAW.

1. Acquisizione di api dalla colonia e il periodo di fame Nota: esperimenti descritti qui sono stati eseguiti presso l&#39;Università di Newcastle, Regno Unito con Bombus terrestris audax. Multipli (2-3) acquistabile colonie sono stati utilizzati per il trattamento. Le colonie sono state mantenute su una panchina in condizioni di laboratorio (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% RH) nel buio costante e sono stati alimentati con il miele polline d&#39;api raccolte e soluzioni zuccherine ad libitum. <ol><li> Raccogliere singolo lavoratore bombi utilizzando una fiala di plastica (lunga 7 cm, 2,8 cm di diametro interno) con un tappo di plastica perforata, dopo aver aperto la porta alla colonia giusto il tempo per un ape per uscire e essere intrappolati. </li><li> Prima dell&#39;esperimento, fame singolarmente tutti i bombi per 2-4 ore in flaconi di plastica e conservare a temperatura ambiente in completa oscurità. </li></ol> 2. Trasferire api nei tubi della tenuta e la Habituation Phase <ol><li> Dopo il periodo di fame, trasferire un calabrone direttamente dalla fiala di plastica in un tubo di supporto. La tenendo il tubo è un 15 ml tubo da centrifuga modificato (lunghezza 119 mm, diametro 17 mm), con fori da 4 mm forato in punta e un pezzo di maglia di acciaio (base: 8 mm, altezza 30 mm) fissata all&#39;interno per fusione la plastica del tubo con ago in acciaio dissezione riscaldata. </li><li> Fissare il tubo di supporto che contiene il calabrone su un supporto in polistirolo con impronte dentarie. Fissare due pezzi di cartone su entrambi i lati del tubo di supporto. Questo per proteggere il ape da stimoli visivi che potrebbero interferire con l&#39;esperimento. </li><li> Posizionare una fotocamera digitale microscopica 5 cm sopra la punta del tubo di supporto e collegare la fotocamera a un computer portatile compatibile. </li><li> Regolare il tubo di supporto in modo che almeno i primi 18 mm di punta tubo Holding è all&#39;interno del frame video. Prima dell&#39;esperimento, possono cominciare il periodo di assuefazione 3 min. </li></ol> 3.Fase pre-test: Presentare una goccia di saccarosio <ol><li> Collegare una siringa ad un adattatore femmina contenente una goccia di soluzione di saccarosio (~ 3,5 ml, 500 mM saccarosio disciolto in acqua deionizzata). Presentare il saccarosio all&#39;interno della punta tubo di supporto per motivare l&#39;estensione della proboscide. </li><li> Dare il calabrone fino a 5 minuti per consumare la goccia di saccarosio. Se la goccia non viene consumato, rimuovere il calabrone dall&#39;esperimento. </li><li> Iniziare la registrazione video dopo il periodo di assuefazione. In questo studio, l&#39;attività proboscide è stato registrato a 26,7 fotogrammi / sec -1 con un tasso di ingrandimento 25X. </li></ol> 4. fase di test: Presentazione della soluzione di prova <ol><li> Riempire un microcapillare 100 ml con la soluzione di prova. Collegarlo a un pezzo di tubo in silicone (lunghezza 6 centimetri, 1 mm di diametro interno) e fissarlo ad un micro manipolatore. <ol><li> Collegare il tubo tramite un adattatore maschio ad un altro tubo in silicone (6 cm di lunghezza, 4 mm di diametro interno), WHIch agisce come una lampadina pipetta. </li><li> Posizionare il microcapillare tubo di 5-10 mm di distanza dalla punta del tubo azienda. Premere delicatamente il tubo per mantenere la soluzione di alimentazione a punta del tubo microcapillare. </li></ol></li><li> Dopo il calabrone consuma la goccia di saccarosio, rimuovere immediatamente la siringa contenente la soluzione di saccarosio 500 mm. </li><li> Inizia la fase di test 2 minuti quando il dell&#39;ape Bumble proboscide in contatto con la soluzione all&#39;interno del tubo microcapillare. <ol><li> Per controllare per possibili evaporazione, riempire due tubi microcapillari supplementari con saccarosio o di acqua e manipolare esattamente come durante la fase di test. </li></ol></li><li> Prima e dopo ogni prova scansionare i livelli del liquido all&#39;interno del tubo microcapillare utilizzando uno scanner a 600 dpi per misurare la quantità di cibo consumato (Figura 4A). </li></ol> 5. Analisi Immagine <ol><li> Determinare il volume del consumo di soluzione con ImageJ (versione 1.48), un proc immagineessing software. <ol><li> Carica il file immagine e ingrandire l&#39;immagine (~ 400%). Per impostare la scala di riferimento, selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea tra le due estremità del tubo microcapillare. Seleziona &#39;Analizza&#39; poi &#39;Set Scala&#39;. Inserire la lunghezza totale del tubo sotto &#39;distanza nota&#39; e la corrispondente unità sotto &#39;Unità di lunghezza&#39;. </li><li> Selezionare nuovamente lo strumento retta e tracciare una linea tra le due estremità del livello del liquido. Seleziona &#39;Analizza&#39; poi &#39;Misura&#39;. Nella finestra dei risultati della lunghezza del liquido è dato nella colonna &#39;intera&#39;. </li></ol></li><li> Calcolare il volume del consumo soluzione utilizzando la formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq1.jpg" /> dove <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq2.jpg" /> è la lunghezza del tubo e microcapillare <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq3.jpg" /> e <img alt= &quot;Equazione 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54233 / 54233eq4.jpg&quot; /&gt; sono le lunghezze misurate del liquido all&#39;interno del microcapillare prima e dopo la fase di test, rispettivamente. </li></ol> 6. Le analisi Video <ol><li> Punteggio i comportamenti di alimentazione durante la fase di test 2 minuti di ogni video utilizzando un software di registrazione degli eventi (vedi Materiali Tavolo). <ol><li> Dapprima, definire i comportamenti alimentari (cioè gli elementi.) Nel menu classi comportamentali del software di registrazione. I comportamenti alimentari sono come segue: (1) proboscide out / contatto: la proboscide estende ed è in contatto con la soluzione all&#39;interno del tubo microcapillare (2) proboscide out / assenza di contatto: la proboscide estende e non è in contatto con la soluzione all&#39;interno del tubo microcapillare, (3) proboscide sistemati a bordo: la proboscide non si estende invece riposti sotto la testa e (4) fuori dalla vista: il calabrone è fuori dal fotogramma video. </li><li> Impostare ogni comportamentocome uno &#39;stato&#39; e &#39;escludono a vicenda&#39; nel menu delle proprietà e di effettuare registrazioni continue per un intervallo di 2 min. Riprodurre i video in modalità slow-motion (2 volte più lento) per una maggiore precisione. </li></ol></li><li> Misurare la velocità della proboscide retrazione dalla soluzione test dopo il primo contatto tra due fotogrammi consecutivi (separati da 37,5 msec nelle registrazioni video mostrato qui) utilizzando un software di video motion tracking (vedi Materiali Tavolo). <ol><li> Carica il file video e passare al fotogramma in cui la proboscide primi contatti la soluzione. </li><li> Per impostare la scala di riferimento, selezionare lo strumento Linea e tracciare una linea sulla larghezza del microcapillare nel fotogramma video. Fare clic destro sulla linea e selezionare &#39;Calibrare misura&#39;. Inserire la larghezza del capillare el&#39;unità corrispondente. </li><li> Selezionare &#39;Immagine&#39; poi &#39;coordinate origine del sistema&#39;. Nella nuova finestra cliccare sulla punta della proboscide e selezionare9; Applica &#39;. </li><li> Selezionate lo strumento mano mossa, fare clic destro sulla punta della proboscide sul telaio video e selezionare &#39;Percorso Traccia&#39;. Spostare al fotogramma successivo e regolare il punto di tracking per la punta della proboscide. </li></ol></li><li> Fare clic destro sul punto di monitoraggio e selezionare &#39;Configurazione&#39;. Seleziona &#39;completa Path&#39; e selezionare &#39;Speed&#39; sotto misura. Seleziona &#39;Applica&#39;. Viene visualizzata la velocità. </li></ol>

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Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

Con questo test comportamentale romanzo, il chinino è mostrato per scoraggiare l&#39;alimentazione del calabrone appassionato di coda. Il tempo di contatto proboscide ridotto e la frequenza attacco alimentazione con acqua o la soluzione di saccarosio cucita con il chinino è interpretato qui come un rifiuto di avviare ulteriori nutrendosi di soluzioni non nutritivi o potenzialmente tossici. Quando chinina viene aggiunto alla soluzione 1 M di saccarosio, calabroni non solo riducono il volume di soluzione che consumano, anche ritirano proboscide veloce, riducendo così il tempo di contatto tra i boccale e la soluzione contenente una tossina. Insieme, questi risultati suggeriscono che il chinino è percepita da parte delle cellule del recettore gustative sulle apparato boccale del calabrone, come già precedentemente identificato nel miele delle api 9. Il chinino è una tossina per gli insetti che induce un comportamento malessere simile a l&#39;ape 10 e atterramento nel malaria zanzare (Anopheles gambiae) 23. Questo test potrebbe portare alla identificationi di alcuni composti di dissuasione e potenzialmente tossici che sono percepite da parte delle cellule del recettore gusto sulle apparato boccale dei bombi. È fondamentale per la microcapillare di essere riempito con un volume sufficiente di soluzione di prova all&#39;ultimo durante la fase di test. Si raccomanda che almeno circa tre quarti della microcapillare (ad esempio 70-80 ml) è pieno. Tuttavia, occorre prestare attenzione a non riempire completamente il microcapillare per ridurre il rischio di perdite durante il processo di scansione e di presa del microcapillare per l&#39;apparato sperimentale. Si deve anche essere presa in sede di presentazione della 500 mm gocciolina di saccarosio al calabrone, in modo che lo sperimentatore evita che perde la goccia nel tubo azienda. Il foro 4 mm alla punta del tubo partecipazione è abbastanza grande per un adulto lavoratore Bumble Bee di estendere naturalmente la sua proboscide verso la soluzione di prova. Tuttavia è possibile chebombi possono gustare la soluzione con le loro antenne prima di estendere le loro proboscidi. Questo potrebbe influenzare la probabilità di estensione proboscide come PER potrebbe essere raggiunta in bombi, stimolando la loro antenne con una soluzione di zucchero 15. Infatti le antenne di imenotteri come la vespa parassitoide (Trissolcus brochymenae) 24 o l&#39;ape 13 sono dotati di gusto sensilli, permettendo loro di degustare gli zuccheri e le tossine come il chinino. Di conseguenza, i contatti delle antenne iniziali con soluzioni contenenti composti altamente deterrenti come il chinino potrebbero anche ridurre la motivazione di un calabrone di estendere la sua proboscide e quindi influenzare il tasso di successo sperimentale. Sebbene il contatto antennale con la soluzione in esame non può essere controllato, nel presente studio non abbiamo trovato alcun effetto significativo di contatto antenne sulla estensione proboscide verso la soluzione di test. In questo saggio, subito impostazione del microcapillare dopo la fase di pre-test wgallina antenne dei bombi &#39;sono ancora all&#39;interno del tubo di supporto in grado di ridurre la possibilità per i bombi per gustare la soluzione di test con le loro antenne. Il limite principale di questo saggio sorge quando il tracciamento della retrazione proboscide dalla soluzione di prova dopo il primo contatto proboscide utilizzando il software di monitoraggio motion video. Il filmato mostra solo il movimento in 2D della proboscide, quindi l&#39;uscita data della misurazione della velocità può essere sotto o sopra previsto. Tuttavia, con alcune modifiche, questo aspetto del dosaggio potrebbe essere migliorata. Questo test può essere usato per osservare le risposte alimentazione naturale verso soluzioni contenenti composti diversi, tra cui metaboliti secondari naturali che si verificano vegetali. Osservando le risposte immediate di alimentazione con questo test fornisce informazioni dettagliate su come bombi rilevare questi composti. Questo è vantaggioso rispetto agli attuali &#39;go-no go&#39; metodi come PER 18,19 </sup&gt; E più saggi di due a scelta 7 perché questo metodo produce una serie di misure di risposta comportamentale, tra cui il consumo di cibo durante un attacco di alimentazione discreta. Misurazione diversi parametri contemporaneamente permette una migliore valutazione della appetibilità di un composto. Ad esempio nel nostro test, bombi evitare di consumare l&#39;acqua o la soluzione di saccarosio cucita con il chinino. Retrazione della proboscide potrebbe essere causato da un cambiamento nelle risposte delle cellule recettori zucchero 12,13. La nostra analisi mostra che bombi ritraggono la proboscide più veloce dopo aver contattato la soluzione di saccarosio chinino di sola acqua; questo potrebbe suggerire che il chinino colpisce una serie distinta di neuroni, oltre a inibire i neuroni sensori zucchero 9,12,13,25. La nostra analisi permette l&#39;analisi del pattern temporale delle risposte comportamentali durante l&#39;alimentazione. Un protocollo simile in cui viene misurato il tempo di consumo e il numero di attacchi ha alpronti stato implementato per valutare la risposta alimentazione di Drosophila di zuccheri nutritivi e non nutritivi 26. Prevediamo che api mostrano una risposta più affidabile ad alimentare stimolanti nei nostri test che in altri metodi come PER perché le api sono liberi di muoversi nel tubo di supporto 21. Questa tecnica permetterà un&#39;analisi esaustiva delle soglie gustative per i nutrienti e le tossine per illuminare i meccanismi di alimentazione in bombi e potenzialmente altre specie di api.

interazioni pianta-impollinatori sono complesse. Impollinatori visitano i fiori per ottenere nettare e polline come cibo; a sua volta, impollinatori facilitano la riproduzione sessuale nelle piante. Anche se questo rapporto è in gran parte mutualistica, nettare e polline floreale a volte contengono tossine o altri composti vegetali 1-5 che possono danneggiare gli impollinatori. Il razionale ecologico per la presenza di tali composti in nettare e polline non è chiaro in tutti gli ambienti. Una domanda eccezionale in questo campo è come impollinatori come le api in grado di rilevare ed evitare i fiori con nettare contenente tossine. Le specie di bombi, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), è un impollinatore generalista che visita i fiori di molte specie di piante, tra cui quelli che producono il nettare contenente tossine 6. Bombi sono stati indicati per evitare soluzioni che consumano contenenti elevate concentrazioni di tossine in un test di 24 ore due scelta 7. Questo testdei consumi alimentari descritto da Tiedeken et al. 7 hanno rivelato che le api in grado di rilevare i composti amari nelle soluzioni. Tuttavia, questo test è stato in grado di distinguere il gusto da processi post-ingestive come malessere che potrebbe anche influenzare il comportamento alimentare su questo intervallo di tempo 8-10. Le api possiedono sensilla gustative sulle loro antenne, apparato boccale e tarsi per rilevare composti 11-13. Il riflesso di estensione proboscide (PER) esperimenti coinvolgere frenare singole api in una imbracatura e quindi stimolando sensilli antennali delle api per produrre l&#39;alimentazione reflex 14-17. Le api possono essere trattenuti nei singoli cablaggi e poi stimolate a produrre il riflesso di alimentazione come un saggio della loro capacità di gustare i composti 18,19. Altri hanno modificato il saggio PER studiare la sensibilità delle antenne o boccale a tossine 9,20. Tuttavia, le api sono sottoposti a stress durante lo sfruttamento. Questo potrebbe influenzare il modoessi rispondono ai composti 21. Qui, un nuovo test è descritto per valutare la risposta gusto comportamentale dei liberamente muoversi bombi per il saccarosio e il chinino, un alcaloide che è stato precedentemente segnalato per essere deterrente 9 e tossici 10 alle api (Apis mellifera) e bombi (Bombus terrestris) 7, 22. Anche se il chinino non è stato trovato nel nettare di piante, questo alcaloide è spesso usato come uno stimolo avversivo in studi comportamentali e fisiologici nelle api 7,9,12,13,22. Il metodo prevede la registrazione video apparato boccale dei bombi &#39;a grande risoluzione durante il contatto iniziale con proboscide le soluzioni di prova. In particolare, la struttura fine della risposta alimentazione viene esaminato segnando continuamente il comportamento in un intervallo di 2 min. Il volume di soluzione consumato viene misurata durante il periodo di alimentazione e quindi la quantità di cibo ingerito può essere correlata con la microstruttura diil comportamento alimentare. Anche la velocità di retrazione proboscide è misurata, come indicatore di evitamento attivo, e quindi di rilevamento pre-ingestive.

<table><tbody><tr><td>Bumblebee colonies</td><td>Koppert Biological Systems</td><td></td><td>NATUPOL Beehive</td></tr><tr><td>Digital microscopic camera&amp;nbsp;</td><td>Dino-lite Europe</td><td>AM4815ZT</td><td>Dino-Lite Edge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l microcapillary tube&amp;nbsp;</td><td>Blaubrand IntraEND</td><td>709144</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene centifuge tube&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849650</td><td></td></tr><tr><td>1 ml disposable plastic luer slip syringe</td><td>BD</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Dell Latitude 3550 laptop</td><td>Dell</td><td></td><td>Check for compatibility with video software&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Canon CanoScan LiDE 120</td><td>Canon</td><td></td><td>Check for compatibility with the computer/laptop</td></tr><tr><td>Observer software version 5.0.25</td><td>Noldus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinovea software version 0.8.15</td><td>Kinovea&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicone tubing</td><td></td><td></td><td>6&amp;nbsp;cm length, 1&amp;nbsp;mm inside &amp;Oslash; &amp;amp; 6&amp;nbsp;cm length, 4&amp;nbsp;mm inside &amp;Oslash;</td></tr><tr><td>Male luer x1/16&quot; standard hose barbed polypropylene adapter</td><td>Cole-Parmer</td><td>TW-45518-22</td><td></td></tr><tr><td>Female luer x 1/16&quot; standard hose barbed polypropylene adapter</td><td>Cole-Palmer</td><td>TW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Steel mesh&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 mm mesh size</td></tr><tr><td>Sucrose (grade II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>Quinine hydrochloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q1125</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software version 1.48</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel behavioral assay to investigate gustatory responses of individual, freely-moving bumble bees (bombus terrestris)

Impollinatori generalisti come il calabrone appassionato di coda, Bombus terrestris, incontrano entrambe le sostanze e le tossine nel nettare floreale che raccolgono da piante da fiore. Solo pochi studi hanno descritto le risposte gustative di api verso tossine nei prodotti alimentari, e questi esperimenti hanno utilizzato principalmente la risposta estensione proboscide in api mellifere trattenuto. Qui, un nuovo test comportamentale è presentato per misurare le risposte di alimentazione di liberamente in movimento, singolo lavoratore bombi ai nutrienti e le tossine. Questo test misura la quantità di soluzione ingerita da ogni calabrone ed identifica come tastants negli alimenti influenzano la microstruttura del comportamento alimentare. Le soluzioni sono presentati in un microcapillare ai singoli bombi che sono stati precedentemente digiuno per 2-4 ore. Il comportamento è catturato in video digitale. La struttura fine del comportamento alimentare viene analizzato segnando costantemente la posizione della ProboSIC (apparato boccale) da registrazioni video utilizzando il software di registrazione degli eventi. La posizione della proboscide è definito da tre diverse categorie comportamentali: (1) proboscide viene estesa e in contatto con la soluzione, (2) proboscide è estesa ma non in contatto con la soluzione e (3) proboscide è sistemato sotto la testa. Inoltre la velocità della proboscide a scomparsa dalla soluzione viene anche stimato. Nel presente saggio il volume di soluzione consumato, il numero di attacchi di alimentazione, la durata dei periodi di alimentazione e la velocità di retrazione proboscide dopo il primo contatto è utilizzato per valutare la phagostimulatory o l&#39;attività deterrente dei composti testati. Questo nuovo test gusto permetterà ai ricercatori di misurare quanto composti trovati in nettare influenzano il comportamento alimentare delle api e sarà anche utile per biologi impollinazione, tossicologi e neuroethologists che studiano il sistema gusto del calabrone.

Il nuovo metodo di analisi è utilizzato per testare le risposte di alimentazione a 1 M di saccarosio, 1 M soluzione di saccarosio più 1 mM chinino e acqua deionizzata solo. Le risposte di alimentazione immediate a ciascun trattamento sono determinati quantificando la durata dei contatti proboscide con la soluzione in esame, la frequenza degli attacchi di alimentazione e la velocità della proboscide a scomparsa dalla soluzione di prova dopo il primo contatto durante la fase di test 2 min. Il volume di soluzione consumato è misurato anche dopo la fase di test. In questo studio, abbiamo scelto un intervallo di criterio di attacco di 5 secondi (Figura 1, vedere File supplementare) sulla base di precedenti lavori da French et al. 25 che ha usato una soglia di 5 secondi per caratterizzare il comportamento proboscide retrazione da Drosophila in risposta a dissuasive composti 25. Così, abbiamo definito un attacco di alimentazione come un contatto tra la proboscide estesi e la soluzione nont interrotto da una assenza di contatti di 5 sec. In confronto al saccarosio e acqua deionizzata da solo, aggiungendo il chinino di soluzione di saccarosio scoraggia evidentemente alimentazione da bombi in quanto saranno rapidamente allontanarsi se rilevano una sostanza avversione (Video Figura 1). In questo esperimento, i trattamenti hanno un effetto significativo sulla durata di contatti cumulativo proboscide durante la fase di prova (ANOVA sui dati di log-trasformati, F 2,31 = 41, p &lt;0.001). La durata complessiva del tempo di contatto con il saccarosio contenente chinino è significativamente ridotta rispetto a solo saccarosio (p &lt;0.001), ma non all&#39;acqua deionizzata solo (p = 0,219) (Figura 2). Allo stesso modo, i trattamenti hanno un effetto significativo sulla durata cumulata di attacchi di alimentazione (ANOVA sui dati di log-trasformati, F <sub&gt; 2,31 = 27.95, p &lt;0.001, Figura 3A). La durata complessiva del alimentazione periodi con saccarosio contenente chinino è significativamente ridotta rispetto a solo saccarosio (p &lt;0.001), ma non rispetto alla sola acqua deionizzata (p = 0,41). I trattamenti hanno anche un effetto significativo sulla frequenza di attacchi di alimentazione (Poisson GLM con una funzione di collegamento log, variazione devianza rispetto alla distribuzione c 2: p &lt;0.050), per cui il numero di periodi con saccarosio contenente chinino è significativamente maggiore nei rispetto al saccarosio (p &lt;0,01), ma marginalmente significativamente differente al trattamento acqua deionizzata (p = 0,055, a causa di una bumblebee visualizzazione sette periodi alimentazione sull&#39;acqua, Figura 3B). Analogamente, la velocità di retrazione proboscide differisce significativamente tra i trattamenti (ANOVA sui dati di log-trasformati, F 2,31 = 5.12, p &lt;0.050). bombi ritraggono il proboscis dalla soluzione di prova significativamente più veloce dopo il primo contatto con saccarosio contenente chinina che con saccarosio o acqua deionizzata solo (p &lt;0,050, Figura 3C). Questi risultati suggeriscono che il chinino attiva un comportamento di evitamento attivo di bombi. I trattamenti hanno anche un effetto significativo sul volume totale di soluzione consumata (ANOVA sui dati di log-trasformati, F 2,32 = 62,5, p &lt;0.001), per cui il consumo di saccarosio contenente chinina si riduce rispetto al saccarosio (p &lt;0.001), ma non in acqua deionizzata (p = 0,457) (Figura 4B). Il volume di soluzione evaporata dal capillare durante il periodo di prova è trascurabile. In condizioni di laboratorio (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% RH), l&#39;evaporazione varia tra 0,033 a 0,883 microlitri con una media di 0,276 ml e 0,171 microlitri per acqua deionizzata e 1 M di saccarosio, rispettivamente. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; In questo test i contatti tra l&#39;antenna e la soluzione non può essere evitato. Tuttavia, la percentuale di bombi con le loro antenne di gustare la soluzione di alimentazione durante la fase di prova (saccarosio: 46,1%, saccarosio chinino: 60,0% e acqua deionizzata: 33,3%) non è significativamente diversa tra i trattamenti (binomiale GLM, cambiamento in devianza rispetto alla distribuzione c 2: p = 0.450). Nessun effetto dei trattamenti si trova sulla latenza tra i primi contatti antennali e la soluzione di prova ed i primi contatti della proboscide (mediana: 2,67 sec per saccarosio; 1,10 sec per saccarosio chinina; 0,80 sec per acqua deionizzata, ANOVA sulla i dati di log-trasformati, F 2,13 = 0.620, p = 0,550). Inoltre, la percentuale di bombi estendono la proboscide di gustare la soluzione di test rimane costante attraverso i trattamenti (saccarosio: 66,7%; saccarosio chinino: 50,0%; acqua deionizzata: 52,2%; binomio GLM, variazione devianza rispetto alla distribuzione c 2: p = 0.840). Insieme, questi risultati suggeriscono che le antenne hanno un ruolo minore nella rilevazione delle tossine in questo saggio. Un esperimento separato esamina se sia necessario testare api per un periodo di tempo più lungo di 2 min. La quantità di cibo consumato dalle api viene testato con il 1 M di saccarosio o 1 mM chinino in 1 M soluzioni di saccarosio in due condizioni: un periodo di prova 2 minuti e un periodo di prova di 10 min. Per entrambi i trattamenti, il consumo totale di cibo non differisce per i periodi di prova e interazioni significative verifica tra il periodo di prova e il trattamento (N = 6 - 13 ANOVA sui dati registro trasformati; effetto dei trattamenti: F = 1,31 54,8, p &lt;0,001; effetto del periodo di prova: F 1,31 = 0, p = 0,979; effetto dell&#39;interazione: F = 0.1, p = 0,457). In sintesi, un2 min periodo di prova è sufficiente per valutare l&#39;effetto della soluzione sulla quantità totale di cibo consumata dai bombi e gli effetti deterrenti di sostanze tossiche o repellenti in questo saggio. Pertanto, misurando il consumo di cibo e saggiando comportamento alimentare, è possibile correlare il consumo totale di cibo alla struttura fine dell&#39;alimentazione durante il dosaggio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig1.jpg" /> Figura 1: periodi di latenza tra la proboscide contatti durante i primi 2 min del test di alimentazione trame densità dei periodi di latenza di tempo che separa ogni contatto proboscide con la soluzione di saccarosio 1 M, la soluzione di chinino 1 M saccarosio + 1 mm ed acqua.. I dati cumulativi da 13, 10 e 11 le api sono rappresentate rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig2.jpg" /> Figura 2: proboscide contatto durate durante la prima 2 min del test di alimentazione trame densità della durata di contatto proboscide di bombi si nutrono di 1 M di saccarosio, 1 M di saccarosio + 1 mM chinino o acqua.. La dimensione del campione, come in Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig3.jpg" /> Figura 3: Proboscis Attività di Bombi si nutrono di 1 M saccarosio, 1 M saccarosio + 1 mM chinino o acqua (A) La durata complessiva di attacchi di alimentazione durante la fase di test (B) la frequenza di alimentazione attacchi e (C) la velocità. della proboscide retrazione dopo il primo contatto. Scrittura indica una differenza significativa: trattamenti con diverse lettere indicano P &lt;0.05. trame Box rappresentano la mediana (barre nere), il i punti dati più alti e più bassi ancora a 1,5 della gamma interquartile (baffi) e gli outlier (cerchi). La dimensione del campione, come in Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig4.jpg" /> Figura 4:. Sopprime i chinino alimentazione da calabroni (A) digitalizzate immagini dei tubi microcapillari indicanti il grado di saccarosio 1 M o 1 M di saccarosio 1 mM soluzione chinina (indicata da una linea nera) prima e dopo la fase di test rispettivamente. (B) Il consumo di 1 M di saccarosio, 1 M di saccarosio 1 mM chinino o deionizzata<html> solo da bombi dopo la fase di test. Scrittura indica una differenza significativa: trattamenti con diverse lettere indicano P &lt;0.001. trame Box rappresentano la mediana (barre nere), il i punti dati più alti e più bassi ancora a 1,5 della gamma interquartile (baffi) e gli outlier (cerchi). La dimensione del campione, come in Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Video Figura 1: registrazioni video della proboscide attività verso (A) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1A_1M_Sucrose.m4v" target="_blank">1 M saccarosio</a> , (B) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1B_Quinine.m4v" target="_blank">1 M di saccarosio 1 mM chinino</a> e (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; deionizzata durante la fase di test.

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A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

8.6K Views.  Newcastle University. A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution. 

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Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth (labellum), there are hair-like structures called sensilla which houses taste neurons. When an attractive substance makes contact to the labellum, the fly extends its proboscis to consume the material. Proboscis Extension Response (PER) assay measures this taste behavior response, and it is a useful method to learn about food preferences in a single fly. Solutions of various sugars, such as sucrose, glucose and fructose, are very attractive to the fly. The effect of aversive substances can also be tested as reduction of PER when mixed in a sweet solution.Despite the simplicity of the basic procedure, there are many things that can prevent it from working. One of the factors that requires attention is the fly's responsive state. The required starvation time to bring the fly to the proper responsive state varies drastically from 36 to 72 hours. We established a series of controls to evaluate the fly's state and which allows screening out of non-responsive or hyper-responsive individual animals. Another important factor is the impact level and the position of the contact to the labellum, which would be difficult to describe by words. This video presentation demonstrates all these together with several other improvements that would increase the reproducibility of this method.

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

Proboscis extension response or PER is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees. When the proboscis makes contact with an attractive substance, the fly extends its proboscis to consume the substance. Solutions of various sugars are very attractive to the fly.

Proboscide Estensione di risposta (PER) Assay in Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Ricerca

Biologia

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Neuroscienze

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Verticale T-maze test di scelta per risposta artropodi di odori

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, mechanoreception, hearing, and chemoperception through taste, via direct contact or through olfaction, which represents the response to a volatile molecule acting at longer range. Volatile chemical molecules are very important signals for most animals in the detection of danger, a source of food, or to communicate between individuals. Drosophila melanogaster is one of the most common biological models for scientists to explore the cellular and molecular basis of olfaction. In order to highlight olfactory abilities of this small insect, we describe a modified choice protocol based on the Y-maze test classically used with mice. Data obtained with Y-mazes give valuable information to better understand how animals deal with their perpetually changing environment. We introduce a step-by-step protocol to study the impact of odorants on fly exploratory response using this Y-maze assay.

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

We present a choice test to reveal the influence of odorants on Drosophila behavior using a Y-maze assay.

Test<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfatto con un test Y-maze

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Gusto Preferenza Assay per adulti<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Proboscide Estensione di risposta (PER) Assay in Drosophila

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (

Verticale T-maze test di scelta per risposta artropodi di odori

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Test

Gusto Preferenza Assay per adulti

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali