Este trabalho foi financiado pela concessão Leverhulme Trust (RPG-2012-708) e uma subvenção BBSRC (BB / M00709X / 1) para GAW.

1. A captura das abelhas da colônia e do período de jejum Nota: Os experimentos aqui descritos foram realizados na Universidade de Newcastle, no Reino Unido com Bombus terrestris audax. Múltiplos (2-3) adquirida comercialmente colônias foram usadas por tratamento. As colônias foram mantidas em um banco em condições de laboratório (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% RH) na escuridão constante e foram alimentados com mel de abelha recolhido pólen e soluções de açúcar ad libitum. <ol><li> Recolha trabalhador individual abelhas utilizando um frasco de plástico (7 cm de comprimento, 2,8 cm de diâmetro interno) com uma rolha de plástico perfurado, depois de ter aberto o portão para a colônia apenas o tempo suficiente para uma abelha para sair e ser preso. </li><li> Antes do experimento, fome individualmente todas as abelhas para 2-4 hr nos frascos de plástico e manter a temperatura ambiente na escuridão completa. </li></ol> 2. Transferência de abelhas dentro dos tubos de exploração ea HFase abituation <ol><li> Após o período de fome, transferir uma abelha diretamente do frasco de plástico em um tubo de retenção. O tubo de retenção é de 15 ml tubo de centrífuga modificado (comprimento: 119 milímetros; diâmetro de 17 milímetros), com um orifício de 4 milímetros perfurados na ponta e uma parte de malha de aço (base: 8 mm; altura 30 mm) fixada no interior por fusão o plástico do tubo com uma agulha de dissecação de aço aquecido. </li><li> Fixar o tubo de retenção contendo a abelha em um suporte de poliestireno com cera dental. Fixar duas peças de cartão em ambos os lados do tubo de retenção. Isto é para proteger a abelha a partir de estímulos visuais que possam interferir com a experiência. </li><li> Posicionar uma câmera microscópica digital de 5 cm acima da ponta do tubo de retenção e conectar a câmera a um computador portátil compatível. </li><li> Ajustar o tubo de espera de modo a que pelo menos os primeiros 18 mm de comprimento da ponta de tubo de retenção está dentro do quadro de vídeo. Antes do experimento, iniciar o período de habituação de 3 min. </li></ol> 3.Fase pré-teste: Apresentando uma gota de Sacarose <ol><li> Ligar uma seringa a um adaptador fêmea, contendo uma gota de solução de sacarose (~ 3,5 mL, sacarose 500 mM dissolvido em água desionizada). Apresentar a sacarose no interior da ponta tubo de retenção para motivar a extensão das tromba. </li><li> Dê a abelha até 5 min para consumir a gota de sacarose. Se a gota não é consumido, remover o abelha do experimento. </li><li> Iniciar a gravação de vídeo após o período de habituação. Neste estudo, a atividade tromba foi gravado em 26,7 frames / seg -1 com uma taxa de ampliação 25X. </li></ol> 4. Fase de Testes: Apresentar a solução de ensaio <ol><li> Encher um tubo microcapilar de 100 ul com a solução de teste. Conectá-lo a um pedaço de tubo de silicone (comprimento 6 cm, 1 mm de diâmetro interno) e corrigi-lo a um micro manipulador. <ol><li> Conecte o tubo através de um adaptador macho para outro tubo de silicone (6 cm de comprimento, 4 mm de diâmetro interno), whiCH actua como um bolbo de pipeta. </li><li> Posicione o microcapilar tubo de 5-10 mm de distância da ponta do tubo de retenção. Suavemente espremer o tubo para manter a solução de alimentação na ponta do tubo microcapilar. </li></ol></li><li> Depois da abelha consome a gota de sacarose, retire imediatamente a seringa contendo a solução de sacarose 500 mM. </li><li> Comece a fase de teste 2 min, quando do bumble contatos tromba a solução dentro do tubo microcapilar. <ol><li> Para controlar possíveis evaporação, encher dois tubos microcapilares adicionais com sacarose ou água e manipulá-lo exatamente como durante a fase de teste. </li></ol></li><li> Antes e após cada ensaio digitalizar os níveis de líquido no interior do tubo microcapilar usando um scanner a 600 dpi para medir a quantidade de alimentos consumidos (Figura 4A). </li></ol> 5. Análise de Imagem <ol><li> Determinar o volume de consumo de solução usando ImageJ (versão 1.48), um proc imagemessing software. <ol><li> Faça o upload do arquivo de imagem e zoom na imagem (~ 400%). Para definir a escala de referência, selecione a ferramenta linha reta e desenhar uma linha entre as duas extremidades do tubo microcapilar. Selecione &quot;Analisar&quot;, em seguida, &quot;Scale Definir &#39;. Introduza o comprimento total do tubo em &quot;distância conhecida &#39;ea unidade correspondente em&quot; Unidade de comprimento &quot;. </li><li> Selecione a ferramenta linha reta novamente e traçar uma linha entre as duas extremidades do nível do líquido. Selecione &quot;Analisar&quot;, em seguida, &#39;Medida&#39;. Na janela de resultados do comprimento do líquido é dado na coluna «comprimento». </li></ol></li><li> Calcular o volume de consumo de solução por meio da seguinte fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq1.jpg" /> Onde <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq2.jpg" /> é o comprimento do tubo microcapilar e <img alt="equação 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq3.jpg" /> e <img alt= &quot;Equação 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54233 / 54233eq4.jpg&quot; /&gt; são os comprimentos medidos do líquido no interior do tubo microcapilar antes e após a fase de teste, respectivamente. </li></ol> 6. As análises de vídeo <ol><li> Marcar os comportamentos alimentares durante a fase de testes de 2 min de cada vídeo usando um software de registro de eventos (Ver Tabela de Materiais). <ol><li> No início, definir os comportamentos alimentares (ie. Os elementos) no menu aulas de comportamento do software de gravação. Os comportamentos de alimentação são como se segue: (1) proboscis out / contato: a tromba se estende e está em contacto com a solução dentro do tubo microcapilar (2) proboscis out / nenhum contato: a tromba se estende e não está em contacto com a solução dentro do tubo microcapilar, (3) tromba estivada: a tromba não for prorrogado, mas em vez arrumadas sob a cabeça e (4) fora de vista: a abelha está fora do quadro de vídeo. </li><li> Definir cada comportamentocomo um &#39;estado&#39; e &#39;mutuamente exclusivas &quot;no menu de propriedades e fazer gravações contínuas para um intervalo de 2 min. Reproduzir os vídeos no modo slow-motion (2 vezes mais lento) para obter mais precisão. </li></ol></li><li> Medir a velocidade de retracção tromba a partir da solução de ensaio após o primeiro contacto entre duas molduras consecutivas (separadas por 37,5 mseg nas gravações de vídeo mostrados aqui) utilizando um software de seguimento de movimento de vídeo (ver Materiais Tabela). <ol><li> Faça o upload do arquivo de vídeo e pular para o quadro onde a tromba primeiros contatos a solução. </li><li> Para definir a escala de referência, selecione a ferramenta de linha e desenhar uma linha na largura do tubo microcapilar no quadro do vídeo. Botão direito do mouse na linha e selecione &quot;Calibrar medida &#39;. A largura de entrada do tubo capilar e a unidade correspondente. </li><li> Selecione &#39;Imagem&#39; depois &#39;Coordenar origem do sistema&#39;. Na nova janela, clique na ponta da tromba e selecione9; Aplicar &#39;. </li><li> Selecione a ferramenta mover a mão, clique direito sobre a ponta da tromba no quadro de vídeo e selecione &#39;Path Track&#39;. Mover para o próximo quadro e reajustar o ponto de rastreamento para a ponta da tromba. </li></ol></li><li> Botão direito do mouse sobre o ponto de rastreamento e selecione &quot;Configuração&quot;. Selecione &#39;Caminho completo&#39; e selecione &#39;Speed&#39; sob medida. Selecione &quot;Aplicar&quot;. A velocidade é então exibido. </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Com este romance ensaio comportamental, quinino é mostrado para impedir a alimentação da abelha rabo-de-buff. O tempo de contato tromba reduzida e frequência de ataque de alimentação com água ou a solução de sacarose atado com quinino é interpretada aqui como uma recusa de iniciar ainda alimentando-se de soluções não nutritivos ou potencialmente tóxicos. Quando quinina é adicionado à solução de 1 M de sacarose, as abelhas não só reduzir o volume de solução que consomem, eles também retrair a tromba mais rápido, reduzindo assim o tempo de contacto entre as mandíbulas e a solução contendo uma toxina. Juntos, estes resultados sugerem que o quinino é percebida pelas células receptoras gustativas nas peças bucais da abelha, como já anteriormente identificados no mel de abelha 9. A quinina é uma toxina para insetos que induz comportamento mal-estar, como no mel de abelha 10 e knockdown no mosquito da malária (Anopheles gambiae) 23. Este ensaio pode muito bem levar ao identification de alguns compostos de dissuasão e potencialmente tóxicos que são percebidos pelas células receptoras gustativas nas peças bucais nas abelhas. É crucial para o tubo microcapilar para ser preenchida com um volume suficiente de solução de ensaio para durar durante toda a fase de teste. Recomenda-se que, pelo menos, cerca de três quartos do tubo microcapilar (por exemplo, 70-80 ul) é preenchido. No entanto, deve ser tomado cuidado para não encher completamente o tubo microcapilar para reduzir o risco de derrames durante o processo de digitalização e prender o tubo microcapilar para o aparelho experimental. Cuidados também devem ser tomados ao apresentar a gota de sacarose 500 mM à abelha, de modo que o experimentador evita vazamento a gota dentro do tubo de exploração. O buraco 4 mm na ponta do tubo de retenção é grande o suficiente para um adulto trabalhador bumble abelha para estender naturalmente sua tromba na direção da solução de teste. No entanto, é possível quebumble abelhas pode saborear a solução com suas antenas antes de estender as suas trombas. Isso pode afetar a probabilidade de extensão probóscide como PER poderia ser atingida em abelhas, estimulando suas antenas com uma solução de açúcar 15. Na verdade, a antenas de Hymenoptera como a vespa parasita (Trissolcus brochymenae) 24 ou a abelha 13 estão equipados com sensilla gosto, o que lhes permite saborear açúcares e toxinas como o quinino. Consequentemente, contatos antenais iniciais com soluções contendo compostos altamente dissuasão, como o quinino também poderia reduzir a motivação de uma abelha para estender sua tromba e, portanto, afetar a taxa de sucesso experimental. Embora o contato antenal com a solução de teste não pode ser controlada, no presente estudo, não encontramos qualquer efeito significativo de contato antenal na extensão probóscide para a solução de teste. Neste ensaio, imediatamente a configuração do tubo microcapilar após a fase de pré-teste when antenas das abelhas bumble ainda estão dentro do tubo de retenção pode reduzir a oportunidade para as abelhas para saborear a solução de teste com suas antenas. A principal limitação deste ensaio surge quando acompanhando a retração tromba longe da solução de teste após o primeiro contato tromba usando o software de rastreamento de movimento de vídeo. O vídeo mostra apenas o movimento 2D dos probóscide, então a saída dada da medição da velocidade pode ser sob ou sobre estimado. No entanto, com algumas modificações, este aspecto do ensaio pode ser melhorada. Este ensaio pode ser usado para observar as respostas de alimentação natural para soluções contendo diferentes compostos, incluindo metabólitos secundários de plantas naturais que ocorrem. Observando as respostas de alimentação imediatos com este ensaio dá informações detalhadas sobre como as abelhas detectar estes compostos. Isto é vantajoso em relação existente &#39;go-no ir &quot;métodos como PER 18,19 </sup&gt; E mais ensaios de duas escolha 7 porque este método produz várias medidas de resposta comportamental, incluindo o consumo de alimentos durante um ataque de alimentação discreta. Medição de vários parâmetros simultaneamente permite uma melhor avaliação da palatabilidade de um composto. Por exemplo, em nosso ensaio, as abelhas evitar consumir água ou a solução de sacarose atado com quinino. Retracção da tromba poderia ser causada por uma alteração nas respostas das células receptoras açúcar 12,13. Nosso ensaio mostra que as abelhas retrair a tromba mais rápida depois de entrar em contato com a solução de sacarose mais quinino do que a água só; isso poderia sugerir que o quinino afeta um conjunto distinto de neurônios, além de inibir neurônios de detecção de açúcar 9,12,13,25. O nosso ensaio permite a análise do padrão temporal de respostas comportamentais durante a alimentação. Um protocolo semelhante onde o consumo de tempo e o número de acessos é medida tem aipronto foram implementadas para avaliar a resposta de alimentação de Drosophila aos açúcares nutritivos e não nutritivos 26. Prevemos que as abelhas irá apresentar uma resposta mais fiável para alimentar estimulantes no nosso ensaio do que em outros métodos, tais como por porque as abelhas são livres para se moverem no tubo de retenção 21. Esta técnica irá permitir uma análise exaustiva dos limiares de sabor para os nutrientes e toxinas para iluminar os mecanismos de alimentação em abelhas e potencialmente outras espécies de abelhas.

interações planta-polinizador são complexas. Polinizadores visitam flores para a obtenção de néctar e pólen como alimento; por sua vez, polinizadores facilitar a reprodução sexual em plantas. Enquanto esta relação é principalmente mutualista, o néctar floral e pólen, por vezes contêm toxinas ou outra planta compostos 1-5 o que pode prejudicar polinizadores. A lógica ecológica para a presença desses compostos no néctar e pólen não é claro em todas as configurações. Uma questão pendente neste campo é como polinizadores, como as abelhas podem detectar e evitar as flores com néctar contendo toxinas. As espécies de abelhas bumble, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), é um polinizador generalista que visita as flores de muitas espécies de plantas, incluindo os néctar produzir toxinas contendo 6. As abelhas foram mostrados para evitar soluções consumindo contendo altas concentrações de toxinas num ensaio de 24 h duas-7 escolha. este ensaiodo consumo de alimentos descrito por Tiedeken et al. 7 revelou que as abelhas podem detectar compostos amargos em soluções. No entanto, este ensaio foi incapaz de distinguir o gosto dos processos pós-ingestivo, tais como mal-estar que podem afetar o comportamento alimentar durante este intervalo de tempo 8-10. As abelhas possuem sensilla gustativa em suas antenas, peças bucais e tarsos para detectar compostos 11-13. O reflexo de extensão probóscide (PER) experimentos envolvem restringindo abelhas individuais em um chicote de fios e, em seguida, estimulando sensilas antenais da abelha para produzir a alimentação reflexo 14-17. As abelhas pode ser contido em arneses individuais e, em seguida, estimulada para produzir o reflexo de alimentação como um ensaio da sua capacidade de provar compostos 18,19. Outros têm modificada do ensaio PER para estudar a sensibilidade do aparelho bucal ou antenas de toxinas 9,20. No entanto, as abelhas são submetidos ao estresse durante aproveitamento. Isso pode afetar a forma comoeles respondem a compostos 21. Aqui, um novo ensaio é descrito para avaliar a resposta ao gosto comportamental de livremente mover as abelhas para sacarose e quinino, um alcalóide que foi previamente relatado para ser dissuasivo 9 e tóxica 10 para as abelhas (Apis mellifera) e abelhas (Bombus terrestris) 7, 22. Embora quinina não foi encontrado no néctar planta, este alcalóide é frequentemente utilizado como um estímulo aversivo em estudos comportamentais e fisiológicas em abelhas 7,9,12,13,22. O método envolve a gravação de peças bucais das abelhas bumble vídeo em ótima resolução durante o contato tromba inicial com as soluções de ensaio. Especificamente, a estrutura fina da resposta de alimentação é examinado por conseguir continuamente o comportamento ao longo de um intervalo de 2 min. O volume de solução consumida é medida durante o período de alimentação e assim a quantidade de comida ingerida pode ser correlacionada com a microestrutura deo comportamento de alimentação. Também a velocidade de retracção da tromba é medida, como um indicador de uma evitação activa, e, por conseguinte, a detecção pré-ingestivos.

<table><tbody><tr><td>Bumblebee colonies</td><td>Koppert Biological Systems</td><td></td><td>NATUPOL Beehive</td></tr><tr><td>Digital microscopic camera&amp;nbsp;</td><td>Dino-lite Europe</td><td>AM4815ZT</td><td>Dino-Lite Edge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l microcapillary tube&amp;nbsp;</td><td>Blaubrand IntraEND</td><td>709144</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene centifuge tube&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849650</td><td></td></tr><tr><td>1 ml disposable plastic luer slip syringe</td><td>BD</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Dell Latitude 3550 laptop</td><td>Dell</td><td></td><td>Check for compatibility with video software&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Canon CanoScan LiDE 120</td><td>Canon</td><td></td><td>Check for compatibility with the computer/laptop</td></tr><tr><td>Observer software version 5.0.25</td><td>Noldus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinovea software version 0.8.15</td><td>Kinovea&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicone tubing</td><td></td><td></td><td>6&amp;nbsp;cm length, 1&amp;nbsp;mm inside &amp;Oslash; &amp;amp; 6&amp;nbsp;cm length, 4&amp;nbsp;mm inside &amp;Oslash;</td></tr><tr><td>Male luer x1/16&quot; standard hose barbed polypropylene adapter</td><td>Cole-Parmer</td><td>TW-45518-22</td><td></td></tr><tr><td>Female luer x 1/16&quot; standard hose barbed polypropylene adapter</td><td>Cole-Palmer</td><td>TW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Steel mesh&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 mm mesh size</td></tr><tr><td>Sucrose (grade II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>Quinine hydrochloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q1125</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software version 1.48</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel behavioral assay to investigate gustatory responses of individual, freely-moving bumble bees (bombus terrestris)

Polinizadores generalistas como a abelha-atado lustre, Bombus terrestris, encontrar ambos os nutrientes e toxinas no néctar floral que coletamos de plantas com flores. Apenas alguns estudos têm descrito as respostas gustativos de abelhas em direção toxinas nos alimentos, e estes experimentos utilizaram principalmente a resposta de extensão probóscide em abelhas produtoras de mel contido. Aqui, um novo ensaio comportamental é apresentado para medir as respostas de alimentação de liberdade de movimento, cada trabalhador abelhas para nutrientes e toxinas. Este ensaio mede a quantidade de solução ingerida por cada abelha e identifica como saborizantes nos alimentos influenciar a microestrutura do comportamento alimentar. As soluções são apresentadas em um tubo microcapilar para as abelhas individuais que tenham sido previamente carente de 2-4 hr. O comportamento é capturado em vídeo digital. A estrutura fina do comportamento alimentar é analisado continuamente por atingir a posição do Proboscis (bucais) de gravações de vídeo usando o software de log de eventos. A posição da tromba é definido por três diferentes categorias comportamentais: (1) tromba é estendido e em contacto com a solução, (2) tromba é estendido, mas não em contacto com a solução e (3) tromba é guardado debaixo da cabeça. Além disso, a velocidade de retracção da tromba de distância a partir da solução também é estimado. No presente ensaio o volume da solução consumida, o número de ataques de alimentação, a duração dos episódios de alimentação e a velocidade de retracção da tromba após o primeiro contacto é utilizado para avaliar a actividade phagostimulatory ou o impedimento dos compostos testados. Este ensaio gosto nova permitirá que pesquisadores para medir como compostos encontrados no néctar influenciar o comportamento alimentar de abelhas e também será útil para os biólogos polinização, toxicologistas e neuroethologists estudando sistema gosto do bumble.

O ensaio de novo é usado para testar as respostas de alimentação a 1 M de sacarose, 1 M de solução de sacarose mais quinina 1 mM e água desionizada sozinho. As respostas de alimentação imediatos para cada tratamento são determinados pela quantificação da duração dos contactos tromba com a solução de ensaio, a frequência dos ataques de alimentação e a velocidade da tromba de retracção de distância a partir da solução de ensaio após o primeiro contacto, durante a fase de teste de 2 minutos. O volume de solução consumida é também medido depois da fase de teste. Neste estudo, nós escolhemos um intervalo critério de ataque de 5 segundos (Figura 1, consulte Arquivo Suplementar) com base em trabalhos anteriores por French et al. 25, que usou um limiar de 5 segundos para caracterizar o comportamento tromba retração de Drosophila em resposta a dissuasivo compostos 25. Assim, definimos um ataque de alimentação como um contato entre a tromba estendida e a solução nãot interrompido por uma ausência de contactos de 5 segundos ou mais. Em comparação com sacarose e água desionizada sozinha, a adição de solução de sacarose a quinina, evidentemente, impede a alimentação de abelhas como eles vão afastar rapidamente se detectar uma substância aversivo (Vídeo Figura 1). Nesta experiência, os tratamentos têm um efeito significativo sobre a duração total de contactos tromba durante a fase de teste (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,31 = 41, p &lt;0,001). O período de tempo de contacto com sacarose contendo quinina é significativamente reduzida em comparação com sacarose sozinha (p &lt;0,001), mas não à água desionizada sozinho (P = 0,219) (Figura 2). Da mesma forma, os tratamentos têm um efeito significativo sobre a duração total de surtos de alimentação (ANOVA nos dados transformados de log-F, <sUB&gt; 2,31 = 27,95, p &lt;0,001, Figura 3A). O período de alimentação ataques com sacarose contendo quinina é significativamente reduzida em comparação com sacarose sozinha (p &lt;0,001) mas não em relação à água desionizada sozinha (p = 0,41). Os tratamentos também têm um efeito significativo sobre a frequência de ataques de alimentação (Poisson GLM com uma função de ligação de registo, mudança de desvio em relação à distribuição c 2: p &lt;0,050), em que o número de ataques com sacarose contendo quinina é significativamente mais elevada em comparação com sacarose (p &lt;0,01), mas marginalmente significativamente diferente ao tratamento de água deionizada (p = 0,055, devido a um zangão exibindo sete lutas que alimentam na água, Figura 3B). Da mesma forma, a velocidade de retracção tromba difere significativamente entre os tratamentos (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,31 = 5,12, P &lt;0,050). bumble abelhas retrair o proboscis distância a partir da solução de teste significativamente mais rápida após o primeiro contacto com sacarose contendo quinina que com sacarose ou água desionizada sozinho (p &lt;0,050, Figura 3C). Estes resultados sugerem que o quinino desencadeia um comportamento de evitação ativa em abelhas. Os tratamentos também têm um efeito significativo sobre o volume total da solução consumida (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,32 = 62,5, p &lt;0,001), pelo que o consumo de sacarose contendo quinina é reduzida em comparação com sacarose (p &lt;0,001), mas não a água desionizada (p = 0,457) (Figura 4B). O volume da solução evaporou-se a partir do capilar durante o período de teste é negligenciável. Em condições de laboratório (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% de humidade relativa), a evaporação varia entre 0,033 a 0,883 l com uma média de 0,276 mL e 0,171 mL de água desionizada e 1 M de sacarose, respectivamente. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Neste contatos ensaio entre a antena e a solução de teste não pode ser evitada. No entanto, a percentagem de abelhas usando suas antenas para saborear a solução de alimentação durante a fase de teste (sacarose: 46,1%, sacarose mais quinino: 60,0% e água deionizada: 33,3%) não é significativamente diferente entre os tratamentos (binomial GLM, mudança em desvio em relação à distribuição c 2: p = 0,450). Nenhum efeito dos tratamentos é encontrada na latência entre os primeiros contatos antenais e da solução de teste e os primeiros contactos da tromba (mediana: 2,67 seg para a sacarose; 1,10 seg para sacarose mais quinino; 0,80 seg para água deionizada, ANOVA na dados log-transformados, F 2,13 = 0,620, p = 0,550). Além disso, a percentagem de abelhas que se estendem a tromba para saborear a solução de teste permanece constante entre os tratamentos (sacarose: 66,7%; sacarose mais quinino: 50,0%; água deionizada: 52,2%; binomial GLM, mudança de desvio em relação à distribuição c 2: p = 0,840). Em conjunto, estes resultados sugerem que as antenas desempenhar um papel menor na detecção das toxinas no ensaio. Uma experiência separada examina se é necessário testar abelhas por um período de tempo superior a 2 minutos. A quantidade de alimento consumida por abelhas é testada com a sacarose 1 M ou quinino 1 mM em soluções de 1 M de sacarose em duas condições: um período de teste de 2 minutos e um período de teste de 10 min. Para ambos os tratamentos, o consumo total de alimentos não difere para os períodos de ensaio e não há interacções significativas ocorrer entre o período de teste e o tratamento (n = 6 - 13, de ANOVA nos dados de log transformado; efeito dos tratamentos: F = 1,31 54,8, p &lt;0,001; efeito do período de ensaio: F 1,31 = 0, p = 0,979; efeito da interacção: F = 0,1, P = 0,457). Em resumo, uma2 min período de teste é suficiente para avaliar o efeito da solução sobre a quantidade total de alimentos consumidos por abelhas e os efeitos inibidores de substâncias tóxicas ou repelentes neste ensaio. Assim, através da medição do consumo de alimentos e ensaiar o comportamento alimentar, é possível correlacionar consumo total de alimentos para a estrutura fina da alimentação durante o ensaio. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig1.jpg" /> Figura 1: períodos de latência entre a tromba Contatos durante os primeiros 2 min do ensaio de alimentação parcelas densidade dos períodos de latência tempo que separa cada contato tromba com a solução de sacarose 1 M, a solução quinino 1 M de sacarose + 1 mM e água.. Os dados cumulativos de 13, 10 e 11 abelhas estão representados, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig2.jpg" /> Figura 2: Tromba contato durações durante a Primeira 2 Min do ensaio de alimentação parcelas densidade das durações de contacto tromba de abelhas que se alimentam de 1 M de sacarose, 1 M de sacarose quinino mM + 1 ou água.. O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig3.jpg" /> Figura 3: Proboscis Atividade dos zangões de alimentação em 1 M de sacarose, 1 M de sacarose + Quinine 1 mM ou água (A) O período de crises de alimentação durante a fase de teste (B) a frequência de alimentação lutas e (C) a velocidade. da tromba retração após o primeiro contato. Lettering indica uma diferença significativa: tratamentos com letras diferentes indicam P &lt;0,05. Os diagramas de caixa representam a mediana (barras pretas), o menor eo maior número de pontos de dados ainda dentro 1.5 do intervalo interquartil (bigodes) e outliers (círculos). O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig4.jpg" /> Figura 4:. Suprime quinina alimentação por abelhas (A) imagens digitalizadas dos tubos microcapilares mostrando o nível de sacarose 1 M ou solução de quinino 1 M de sacarose, mais de 1 mm (indicado por uma linha preta) antes e depois da fase de teste respectivamente. (B) O consumo de 1 M de sacarose, 1 M de sacarose, mais quinina 1 mM ou água desionizada<html> sozinho por abelhas após a fase de teste. Lettering indica uma diferença significativa: tratamentos com letras diferentes indicam P &lt;0,001. Os diagramas de caixa representam a mediana (barras pretas), o menor eo maior número de pontos de dados ainda dentro 1.5 do intervalo interquartil (bigodes) e outliers (círculos). O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo Figura 1: As gravações de vídeo a Actividade tromba direccionada no sentido (A) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1A_1M_Sucrose.m4v" target="_blank">1 M de sacarose</a> , (B) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1B_Quinine.m4v" target="_blank">1 H sacarose mais quinina 1 mM</a> e (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Água deionizada durante a fase de teste.

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A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (<em&gt; Terrestris do Bombus</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

a-novel-behavioral-assay-to-investigate-gustatory-responses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

8.7K visualizações.  Newcastle University. A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution. 

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Neurociência

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Ensaio Escolha Vertical labirinto em T para a resposta de Artrópodes para odores

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification (RFID) readers built into artificial flowers that display various visual cues, and RFID tags (i.e., passive transponders) glued to the thorax of bumblebee workers. The novelty in our implementation is that RFID readers are built directly into artificial flowers that are capable of displaying several distinct visual properties such as color, pattern type, spatial frequency (i.e., &#8220;busyness&#8221; of the pattern), and symmetry (spatial frequency and symmetry were not manipulated in this experiment). Additionally, these visual displays in conjunction with the automated systems are capable of recording unrewarded and untrained choice behavior. The second method consists of recording choice behavior at artificial flowers using motion-sensitive high-definition camcorders. Bumblebees have number tags glued to their thoraces for unique identification. The advantage in this implementation over RFID is that in addition to observing landing behavior, alternate measures of preference such as hovering and antennation may also be observed. Both automation methods increase experimental control, and internal validity by allowing larger scale studies that take into account individual differences. External validity is also improved because bees can freely enter and exit the testing environment without constraints such as the availability of a research assistant on-site. Compared to human observation in real time, the automated methods are more cost-effective and possibly less error-prone.

This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees.

Radio Frequency Identification and Video Motion-sensível eficiente Automatizar Gravação de unrewarded escolha Comportamento por Zangões

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Acompanhamento em tempo real dos movimentos de antena do inseto e reflexo de extensão Proboscis usando uma preparação comum e Hardware convencional

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis. This has traditionally been done by netting foragers at nest entrances or on flowers, chilling the bees on ice, and then removing the pollen loads from the corbiculae with forceps or a brush. This method is time and labor intensive, may alter normal foraging behavior, and can result in stinging incidents for the worker performing the task. Pollen traps, such as those used on honey bee hives, collect pollen by dislodging corbicular pollen loads from the legs of workers as they pass through screens at the nest entrance. Traps can remove a large quantity of pollen from returning forager bees with minimal labor, yet to date no such trap is available for use with bumble bee colonies. Workers within a bumble bee colony can vary in size making size selection of entrances difficult to adapt this mechanism to commercially reared bumble bee hives. Using 3D printing design programs, we created a pollen trap that successfully removes the corbicular pollen loads from the legs of returning bumble bee foragers. This method significantly reduces the amount of time required by researchers to collect pollen from bumble bee foragers returning to the colony. We present the design, results of pollen removal efficiency tests, and suggest areas of modifications for investigators to adapt traps to a variety of bumble bee species or nest box designs.

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

We present a non-lethal and automated mechanism to collect pollen from bumble bee (Bombus) workers returning to a hive. Instructions for producing, preparing, installing and using the devices are included. By using 3D-printed objects, modification to the design was timely, efficient and allowed for quick turnaround for testing.

Uma armadilha de pólen impresso em 3D para entradas de colmeias de abelhas bumble(Bombus)

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (

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