We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).

1. Preparazione del reagente <ol><li> Preparare tampone di lisi cellulare (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0,5% NP-40). Supplemento 2 mM DTT, 1x completo cocktail proteasi, e 250 UI / ml benzonasi prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare tampone per sedimento (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl 2). Supplemento 2 mM DTT, 1x completo cocktail proteasi e 250 UI / ml benzonasi prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare tampone di ebollizione 3x (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplemento 150 mM DTT prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare terreno DMEM bassa fluorescenza per i test che utilizzano lettore di micropiastre a fluorescenza. Mescolare 25 mM glucosio, 0,4 mm glicina, 0,4 mm arginina, 0,2 mM cisteina, 4,0 mm glutammina, 0,2 mM istidina, 0,8 mm isoleucina, 0,8 mm leucina, 0,8 mm lisina, 0,2 mM metionina, 0,4 mm fenilalanina, 0,4 mm serina, 0,8 mM treonina, triptofano 0,078 mM, 0,4 mm tirosina, valina 0,8 mm, 1,8 mm CaCl 2, 0,81 mM MgSO 4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO 3, 110 mM NaCl, 0,9 mmNaH 2 PO 4. Regolare il pH della soluzione con HCl o NaOH a pH 7,4. Sterilizzare il medium attraverso la filtrazione. NOTA: Questo terreno contiene componenti del terreno standard DMEM con elevato glucosio, tranne che Fe (NO 3) 3, vitamine e rosso fenolo vengono omessi. Fenolo rosso, riboflavina e pyridoxal a regolare terreno di coltura DMEM significativamente interferisce con il rilevamento del segnale di fluorescenza 21. Terreno di coltura senza quei componenti è fondamentale per il successo di imaging GFP cellule vive. Il mezzo è stabile per 12 mesi se conservato in frigorifero. </li></ol> 2. Il degrado del test di ATXN1 82Q GFP <ol><li> Piastra di circa 3 x 10 5 cellule HeLa in piastre da 35 mm con terreno DMEM supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS), in modo che dopo O / N cellule di coltura crescere ad una confluenza del 40-60% al momento della transfezione. NOTA: Il numero di piatti necessari si basa sul numero di punti di tempo e trattamenti described sotto. </li><li> Cellule HeLa trasfezione con 0,3 mg di ATXN1 82Q-GFP / pRK5 plasmide in tutti i pozzetti usando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore 9. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e trasfezione reagente e un&#39;aliquota per ogni pozzetto. </li><li> 4-5 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l&#39;espressione della GFP con eccitazione lunghezza d&#39;onda di 450-490 nm. Rientro cellule torna a incubatrice dopo l&#39;imaging. NOTA: Osservare entrambi i segnali GFP diffusi e piccole macchie di segnali GFP a nucleo in questo momento. </li><li> Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente 50 mg / ml CHX. Trattare cellule per 0, 4, 8, 12 e 16 ore con CHX prima della raccolta. Per esaminare la degradazione proteasoma, includere proteasoma inibitore MG132 (10 mM) in una piastra trattate per 16 ore come controllo. </li><li> Raccolto un piatto di cellule in ogni punto. Rimuovere il supporto dal vuoto di aspirazione di und lavare le piastre due volte con 3 ml ghiacciata 1x tampone fosfato salino (PBS). Snap-congelare la piastra in ghiaccio secco. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo (16 ore), raschiare le cellule congelate (da tutti i punti di tempo) in 150 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciato e incubate in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare i lisati cellulari in una centrifuga da banco a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante, contenente NP-40-solubili proteine ​​(NS), in un&#39;altra provetta con una pipetta. NOTA: Utilizzare surnatanti per misurare concentrazioni di proteine ​​da saggio Bradford, se necessario. </li><li> Lavare il pellet con l&#39;aggiunta delicatamente circa 200 microlitri 1x PBS per i tubi senza disturbare il pellet. Rimuovere con attenzione PBS mediante aspirazione a vuoto o una pipetta. li Risospendere in 150 microlitri di buffer pellet cellulare ghiacciata, seguito da 15-30 min di incubazione in ghiaccio. NOTA: La frazione sedimento risospeso contiene NP-40 insolubili proteine ​​(NI). Si veda la Figura 1B per un diagram di detergente frazionamento. </li><li> Aggiungere 75 ml di 3x tampone bollente in frazioni NS e 40 NP-insolubili frazioni (NI) risospese dal pellet. Riscaldare i campioni a 95 ° C su un blocco di calore per 5 min. NOTA: Ciuffi nei NP-40 frazioni insolubili sono sciolti dopo il riscaldamento ed i campioni diventerà chiaro. </li><li> Aggiungere tampone di caricamento SDS-gel per una aliquota di NS bollite e NI. Caricare uguale volume di campioni raccolti da tutti i punti di tempo a gel SDS-PAGE. Il volume caricato corrisponda a circa 20 mg di NS dal campione prelevato al tempo 0. NOTA: NS, oltre che di proteine ​​SDS-solubili (SS) da NI fazione, possono essere risolti mediante SDS gel separazione. Al contrario, SDS-resistente (SR) aggregati da frazione NI sono bloccati nei pozzetti di gel di carico (Figura 1B). Per migliorare il rilevamento Western Blot, doppio volume di NI può essere caricato. </li><li> Rileva NS e SS ATXN1 82Q-GFP mediante western blot utilizzando un anticorpo anti-GFP e chemiluminescenza (ECL). NOTA: ATXN1 82Q nella frazione SS è generalmente inferiore rispetto alla frazione NS quando si utilizza questo protocollo. è necessaria più di esposizione per i segnali ECL ottimali. </li><li> Esaminare SR ATXN1 82Q dalla frazione pellet mediante saggi ritardo filtro utilizzando un apparato di dot-blot (Figura 1B). In breve, ha istituito un apparato dot-blot in possesso di una membrana di acetato di cellulosa 0,2 micron. Carico 80-120 microlitri di bollito NI in ogni pozzetto dell&#39;apparato dot-blot. NOTA: Poiché solo piccole quantità di aggregati SR si formano nelle cellule, per il saggio dot blot, caricare un volume della frazione SR che è circa 10-15 volte del volume della frazione NS usato per analisi western blot. <ol><li> Dopo filtrazione dei campioni attraverso la membrana dal vuoto, aggregati ATXN1 82Q-GFP bloccato sulla membrana può essere rilevato da anti-GFP immunoblotting 9,12,22. NOTA: Vedere precedenti relazioni 9,12,22 per la descrizione dettagliata del test del filtro di ritardo. Questo passaggio è facoltativoperché SR ATXN1 82Q è minima rispetto a SS e NS frazioni seguenti breve trasfezione descritto in questo protocollo. Inoltre, i livelli di SR ATXN1 82Q in gran parte rimangono gli stessi nel corso CHX Chase (Figura 2B). Tuttavia, è ancora fondamentale per esaminare se le quantità di SS ATXN1 82Q sono influenzati nel tempo per qualsiasi trattamento farmacologico o espressione genica in esperimenti iniziali. Specie proteina SS rimanere in pozzetti di caricamento del gel SDS-PAGE possono essere rilevati mediante western blot. Tuttavia, questo metodo è meno sensibile e genera risultati variabili più (Figura 1B). </li></ol></li></ol> 3. Degradazione Assay di NLS-luciferasi-GFP Utilizzando SDS-PAGE e Western Blot <ol><li> Piastra di circa 3 x 10 5 cellule HeLa in piastre da 35 mm con terreno DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS). Dopo O / N coltura, una confluenza del 40-60% viene raggiunta al momento della transfezione. Il numero di piatti necessari si basa sul numero di tpunti IME e trattamenti descritti di seguito. </li><li> Cellule HeLa trasfezione con 1,0 mcg NLS-luciferasi-GFP / pRK5 plasmide in tutti i pozzetti usando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore 9. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e reagenti trasfezione per aliquota di ogni bene. </li><li> Dopo O / N trasfezione (circa 15 ore), esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l&#39;espressione della GFP con eccitazione lunghezza d&#39;onda di 450-490 nm. Rientro cellule torna a incubatrice dopo l&#39;imaging. NOTA: Diffusa segnale GFP nucleare può essere osservato nella maggior parte delle cellule (70%). Una piccola percentuale (5%) di cellule hanno aggregati nucleari. </li><li> Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente 50 mg / ml CHX. Il trattamento di cellule per 0, 1.5, 3, 4,5 e 6 ore con CHX prima della raccolta. Per esaminare la degradazione del proteasoma, includere ulteriori MG132 inibitore del proteasoma (10 micron) in una piastra trattati per 6 ore come controllo. </li><li> Raccolto un piatto di cellule in ogni punto. Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e lavare due volte le piastre con 3 ml ghiacciata tampone fosfato salino (PBS). Snap-congelare la piastra in ghiaccio secco. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo (6 ore) è terminata, cellule congelate a tutti i tempi punti vengono raschiati in 150 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciato e incubate in ghiaccio per 30 min. </li><li> Aggiungere SDS tampone di gel-loading di lisati cellulari totali per una concentrazione finale del 2% SDS e 50 mM DTT. Incubare i campioni su un blocco di calore a 95 ° C per 5 min. </li><li> Analizzare NLS-luciferasi-GFP mediante SDS-PAGE e Western Blot utilizzando anticorpi anti-GFP. Caricare uguale volume di campioni raccolti da tutti i punti di tempo a gel SDS-PAGE. Il volume caricato corrisponde a circa 20 mg di lisati cellulari intero da campione prelevato al tempo 0. </li></ol> 4. in tempo reale degradazione Assay di NLS-luciferasi-GFP Usando fluorescenza lettore di micropiastre <ol><li> Seme di circa 1 x 10 4cellule HeLa in 96 pozzetti piastre di coltura di tessuto nero con fondo trasparente. Dopo O / N coltura, una confluenza del 50-70% viene raggiunta al momento della transfezione. NOTA: 60 ml di mezzo contenente cellule HeLa completamente in sospensione sono seminati direttamente in tutti i pozzetti. Non aggiungere ulteriore piatto di medie o rock avanti e indietro dopo la semina, in caso contrario le cellule possono essere distribuiti in modo non uniforme. </li><li> Cellule HeLa trasfezione con 0,05-0,1 mg di NLS-luciferasi-GFP / pRK5 plasmide 9 in ogni pozzetto utilizzando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e trasfezione reagente e un&#39;aliquota per ogni pozzetto. Tre pozzetti con cellule non sono trasfettate con DNA, che serve come controllo per il segnale fluorescenza per ogni condizione di trattamento. NOTA: Un modo alternativo per ridurre le variazioni transfezione è trasfezione le cellule prima della semina. Tuttavia, una grande porzione di cellule trasfettate con la proteina misfoldeds non riescono a collegare o mostrare la vitalità ridotta utilizzando questo metodo. E &#39;probabile che alcune cellule non possono sopportare lo stress causato dalla tripsina digestione quando esprimono le proteine ​​mal ripiegate tossici. Come risultato, il segnale fluorescente complessiva è significativamente ridotta. </li><li> 20-24 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l&#39;espressione della GFP con eccitazione lunghezza d&#39;onda di 450-490 nm. </li><li> Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto. Aggiungere circa 200 ml PBS 1X a ciascun bene e poi aspirare per rimuovere quantità residua di terreno DMEM. </li><li> Aggiungere 60 ml di bassa fluorescenza media DMEM con il 5% FBS e 50 ug / ml CHX. Per esaminare la degradazione del proteasoma, includere ulteriori MG132 inibitore del proteasoma (10 micron) in una serie di campioni. Set triplicato di pozzi per ogni trattamento / condizione. NOTA: il trattamento MG132 è incluso come controlli per la degradazione del proteasoma, perché è fondamentale per escludere altri fattori che possono causare goccia di fluoSegnale rescence, tra cui la morte cellulare e fluorescenza tempra. </li><li> Misurare il segnale di fluorescenza di GFP immediatamente su un lettore di piastre a fluorescenza dopo l&#39;aggiunta di CHX. NOTA: Le impostazioni di misura software sono riportate in Tabella 1. </li><li> Leggere la piastra ogni ora per un massimo di 8-10 ore. Dopo aver letto, riportare la piastra posteriore di coltura cellulare incubatore. </li><li> Esportare i dati come file di foglio di calcolo. Utilizzare valore medio di multi-letture per ciascun pozzetto come intensità di fluorescenza. Normalizzare i valori di ciascun punto di dati per i valori medi del Tempo 0 nei rispettivi gruppi. Tracciare l&#39;intensità di fluorescenza normalizzato nel tempo, come mostrato in Figura 4A e 4B, e la figura 5, pannelli a destra. </li><li> Effettuare analisi statistiche delle velocità di degradazione tra due condizioni utilizzando ANOVA a due vie con misure ripetute 23. NOTA: In questa analisi, &quot;intensità di fluorescenza&quot; è la variabile dipendente, mentre &quot;treatmcondizioni ENT &quot;e&quot; tempo &quot;sono i due fattori. Invece di confrontare dati a singoli punti di tempo, ANOVA a due vie con misure ripetute analizza la differenza tra i due gruppi di trattamento durante l&#39;intero corso del tempo. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

I meccanismi che regolano la degradazione delle proteine ​​misfolded sono essenziali per mantenere l&#39;omeostasi delle proteine ​​cellulari, e che probabilmente rappresentano bersagli farmacologici preziose per trattare malattie neurodegenerative e altre malattie proteine ​​misfolding. Qui, saggi che esaminano la degradazione delle proteine ​​misfolded sono descritti, utilizzando una proteina patogena ATXN1 (ATXN1 82Q) ed un mutante nucleare localizzata luciferasi (NLS-LucDM) come esempi. <p class=...

Le proteine ​​sono macromolecole più abbondanti nelle cellule, e svolgono un ruolo essenziale in quasi tutti i processi biologici. L&#39;attività biologica della maggior parte delle proteine ​​richiede la loro piegatura in, e mantenendo, i nativi strutture tridimensionali. Proteine ​​con conformazioni aberranti non solo perdono le loro normali funzioni, ma anche spesso formano specie oligomeriche solubili o aggregati che compromettono le funzioni di altre proteine ​​e sono tossici per le cellule 1,2. Per contrastare misfolding, le cellule utilizzano entrambe le chaperon molecolari, che assistono polipeptidi non piegati o parzialmente piegati per raggiungere la loro conformazione nativa, e vie di degradazione, che eliminano le proteine ​​mal ripiegate 3. Data la complessità e la natura stocastica del processo di piegatura, proteine ​​misfolding è inevitabile, e non può essere invertito nel caso di mutazioni, errori biosintetici e danni post-traduzionali 1. Quindi, in ultima analisi, le cellule si basano su degradatpercorsi di ioni per mantenere la qualità delle proteine. L&#39;importanza del controllo della qualità delle proteine ​​cellulari (PQC) sistemi è sottolineata dalla prevalenza di malattie proteine ​​misfolding, tra cui il cancro, il diabete, e molte malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Huntington (HD), e atassie spinocerebellari (SCA) 4,5. Ad esempio, le mutazioni nel p53 soppressore del tumore è la singola lesione più frequentemente genetico nei tumori, associata a ~ 50-70% di tutti i casi 6. Una frazione sostanziale di p53 mutazioni sono mutazioni missenso che alterano la conformazione di p53, che porta alla formazione di aggregati 7. Inoltre, le proteine ​​con tratti polyQ espanse sono geneticamente e patologicamente associati con HD e SCA. Queste malattie progressive e spesso fatali manifesta quando la lunghezza del tratto polyQ nelle proteine ​​coinvolte supera un certo THREStenere, e diventa sempre più gravi come la lunghezza del tratto polyQ prolunga 8. Un approccio interessante per il trattamento di queste malattie è quello di rafforzare i sistemi terapeuticamente PQC cellulari, in particolare le vie di degradazione. Tuttavia, i meccanismi coinvolti nella degradazione delle proteine ​​difettose, in particolare quelli in cellule di mammifero, rimangono poco conosciuti. Anche se è stato riconosciuto che il proteasoma è di fondamentale importanza per la degradazione di proteine ​​mal ripiegate, una questione vitale rimane indefinito: come proteine ​​mal ripiegate sono specificamente riconosciuti e mirati per la degradazione. Inoltre, anche se i sistemi PQC sono stati identificati in compartimenti cellulari compreso il citoplasma, il reticolo endoplasmatico, e il mitocondrio, i sistemi PQC nel nucleo rimangono poco chiari 2. Recenti studi nostro laboratorio hanno identificato un sistema che riconosce e degrada una varietà di proteine ​​mal ripiegate nel nucleocellule di mammiferi 9. Questo sistema è composto da proteine ​​promielocitica (PML), una proteina nucleare e un membro della famiglia di proteine ​​tripartita motivo contenenti (TRIM), e RNF4, un anello di dominio contenenti proteine. PML, e diverse altre proteine ​​TRIM, in possesso di SUMO (piccolo modificatore ubiquitina-simile) E3 ligasi attività, che facilita la specificità e l&#39;efficienza delle proteine ​​SUMOylation 10. RNF4 appartiene a un piccolo gruppo di ubiquitina ligases SUMO mirati (Stübl), che contengono uno o più motivi di sumo-interagenti (SIMS) in aggiunta al dominio anello che consente loro l&#39;attività ubiquitina ligasi 11. Abbiamo scoperto che PML riconosce specificamente proteine ​​mal ripiegate attraverso discrete siti di riconoscimento substrato che può discernere caratteristiche distinte sulle proteine ​​mal ripiegate. In seguito al legame, tag PML misfolded proteine ​​con poli-catene di Sumo2 / 3, due quasi identici proteine ​​SUMO mammiferi che possono formare poli-catene a causa dell&#39;esistenza di un sito SUMOylation interna. Sproteine ​​mal ripiegate UMOylated vengono poi riconosciuti da RNF4, che conduce alla loro degradazione ubiquitination e del proteasoma. Abbiamo inoltre dimostrato che il sistema di PML-RNF4 è importante per la protezione contro la neurodegenerazione, come carenza di PML aggrava i difetti comportamentali e neuropatologici di un modello murino di tipo SCA 1 (SCA1) 9. Per distinguere la degradazione delle proteine ​​da altri meccanismi cellulari che possono regolare i livelli di proteine, i tassi di turnover proteico è stato misurato 9. Tra i metodi più frequentemente utilizzati per determinare il ricambio proteico sono inseguimento del polso e cicloesimide Chase (CHX). Questi due metodi esaminano nel tempo, rispettivamente, le proteine ​​con radioisotopo di interesse in cellule di traduzione-abile e proteine ​​totali preesistenti di interesse in cellule di traduzione inibito. Tuttavia, una grande sfida per studiare proteine ​​patogeni e misfolding incline è che l&#39;emivita di queste proteine ​​può essere estremamente long. Ad esempio, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtina, α-sinucleina e TDP-43 tutti hanno tempi di dimezzamento di più di 12 a 24 ore 9,12-16. I tassi di turnover lente di queste proteine ​​precludono l&#39;uso dell&#39;analisi CHX chase perché le cellule che ospitano queste proteine ​​non possono sopravvivere inibizione traduzione prolungata, particolarmente perché le proteine ​​mal ripiegate stessi possono essere altamente tossici per le cellule. L&#39;analisi pulse-chase con etichettatura isotopica può anche essere difficile per le proteine ​​che sono altamente aggregazione-prona. La maggior parte dei saggi pulse-chase basano su immunoprecipitazione per separare la proteina di interesse da tutte le altre proteine ​​che sono anche marcato radioattivamente. Questa procedura normalmente include procedure di immunoprecipitazione e di lavaggio lunghi, durante i quali gli aggregati SDS-insolubili possono formare, rendendo l&#39;analisi con SDS-PAGE elettroforesi imprecisa. Qui un protocollo per analizzare le proteine ​​mal ripiegate nucleari con un tasso di turnover lento è descritto 9. Una forma patogena di Ataxin-1 (ATXN1) che contiene un tratto di 82 glutamines (ATXN1 82Q) viene utilizzato per questo scopo 8. Quando espresso in cellule, una maggiore green fluorescent protein (GFP) fusione di forme ATXN1 82Q microscopiche inclusioni visibili nel nucleo (Figura 1A). Analisi Pulse caccia rivela che il tempo di dimezzamento di Ataxn1 82Q è di oltre 18 ore 9. ATXN1 82Q è composta da specie con conformazioni mal ripiegate di caratteristiche diverse, nonché specie con conformazione nativa. È probabile che queste specie sono degradati a velocità diverse, e pertanto dovrebbe essere analizzato separatamente. Lisati da ATXN1 82Q-GFP-cellule che esprimono sono frazionati in NP-40-solubili (solubile o NS, probabilmente rappresentano proteine ​​native o mal ripiegate proteine ​​monomeriche / oligomerica) e (NI, aggregati / misfolded) porzioni NP-40-insolubile. Quest&#39;ultimo può essere ulteriormente suddiviso in SDS-solubili (SS; probabili aggregati disordinati) o SDS-resistente (SR; probabili fibrille amiloidi) Frazioni (Figura 1B). frazioni NS e SS possono essere analizzati mediante SDS-PAGE seguita da western blotting, mentre la frazione SR può essere rilevato tramite saggi filtro di ritardo seguiti da immunoblotting. CHX chase è combinato con il metodo di frazionamento del detersivo, e ha scoperto che l&#39;emivita di SS ATXN1 82Q è molto più breve di quella di NS ATXN1 82Q e totale ATXN1 82Q (Figura 2A), indicando che la frazione SS può essere facilmente riconosciuto e degradato nelle cellule 9. Così, questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la dinamica di proteine ​​mal ripiegate e per confrontare il loro modello di degrado. Noi descriviamo anche un metodo che è adatto per screening ad alta per identificare macromolecole o piccoli composti che possono modulare la degradazione delle proteine ​​mal ripiegate. Questo metodo si basa su un mutante conformazionalmente destabilizzata di lucciola luciferasi (LucDM) 17, un substrato modello di chaperone. Abbiamo fusibiled LucDM ad un segnale di localizzazione nucleare (NLS) per sondare il sistema PQC in questo compartimento cellulare, e GFP (NLS-LucDM-GFP) per comodità di rilevamento. Forme NLS-LucDM-GFP microscopicamente aggregati nucleari visibili in una piccola percentuale di cellule (Figura 3A). Simile a ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-ma non la sua wild-type omologo NLS-LucWT-GFP-viene modificato da Sumo2 / 3 e regolamentata dalla via PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP costituisce anche SS e le specie SR, anche se le quantità relative di SS e di specie SR sono minime rispetto a NS, utilizzando le condizioni di cui al protocollo 3. Per semplificare l&#39;analisi, abbiamo solo analizziamo SDS LucDM solubile (compresi sia gli NS e frazioni SS) per SDS-PAGE e Western Blot. Importante, assay chase CHX mostrato che l&#39;emivita di SDS-solubile NLS-LucDM-GFP è molto più breve di quella del suo wild-type controparte (Figura 3B), suggerendo che LucDM è un substrato specifico per il sistema che riconosce e si degradaproteine ​​mal ripiegate. La degradazione di LucDM-GFP provoca un calo significativo segnale complessivo di fluorescenza. Pertanto, abbiamo anche sviluppato un protocollo per la rilevazione in tempo reale di cellulari LucDM-GFP mediante test a base di fluorescenza micropiastre. Molti sistemi schermo high-throughput (HTS) sono sviluppati per i farmaci o geni modificatori aggregati cellulari e vitalità cellulare causate da proteine ​​aberranti 18-20. Tuttavia, molto pochi HTS sono specificamente progettati per il targeting degrado in cellule di mammifero. Questo protocollo serve come sistema robusto per analisi rapide e su larga scala degli effetti di espressione proteica, l&#39;abbattimento e trattamento farmacologico sulla degradazione di proteine ​​misfolded cellulare. Utilizzando cellule HeLa come ad esempio, di seguito descriviamo i protocolli per l&#39;analisi di queste due proteine ​​mal ripiegate. I saggi possono essere applicati anche ad altre linee cellulari, anche se può essere necessario ottimizzato per singole linee cellulari condizioni di trasfezione e decorso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11995-092</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NP-40</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NP40S-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">SDS</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MG132</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45000232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:175px;">Roche Boehringer Mannheim</td>
			<td style="width:119px;">4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Bio-Dot Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Living Colors GFP Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:175px;">Clonetech</td>
			<td style="width:119px;">632375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Anti-Actin mAb Rabbit, IgG</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A45060-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Amino acids</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Olympus IX-81&#160; Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Greiner</td>
			<td style="width:119px;">89135-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200&#174; PRO</td>
			<td style="width:175px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;">Infinite 200&#174; PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cellulose acetate membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:175px;">Sterlitech</td>
			<td style="width:119px;">CA023001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Prism 5</td>
			<td style="width:175px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the degradation of misfolded proteins in cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

In un&#39;analisi stato stazionario, microscopicamente visibili aggregati nucleari ATXN1 82Q-GFP possono essere osservati in 30 - 50% di cellule HeLa 20 ore dopo la trasfezione (Figura 1A). Analisi Western blot delle frazioni NS e SS con anticorpo anti-GFP mostra una banda distinta ATXN1 82Q-GFP tra 100 kDa e 150 kDa marcatori, corrispondente al peso molecolare della proteina (Figura 1B). ATXN1 82Q-GFP nella frazione SR può essere rilevata mediante sagg...

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Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Views.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening. 

Video: Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

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Biologia

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

I saggi di redditività per le cellule in coltura

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l&#39;Air Interface Liquid

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Confrontando l&#39;affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Saggi per la degradazione delle proteine nelle cellule mal ripiegate

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Cristallizzazione delle proteine di membrana lipidica in Mesophases

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine della cromatina in Living cellule staminali embrionali

I saggi di redditività per le cellule in coltura

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l'Air Interface Liquid

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine di membrana

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione

Confrontando l'affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Un'interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine in protrusioni cellulari dinamiche

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

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