Nella maggior parte dei casi, la mutagenesi tradizionale diretta al sito non è appropriata per studiare il ruolo funzionale delle proline nelle proteine. Qui, presentiamo un metodo per incorporare analoghi della prolina come amminoacidi non canonici in proteine sintetizzate ribosomalmente per studiare il ruolo dei residui di prolina sul ripiegamento e sulla funzione delle proteine. La sostituzione delle proline con aminoacidi standard è un approccio rischioso.
L'incorporazione di analoghi della prolina consente una sorta di chirurgia molecolare. In altre parole, introduce sottili cambiamenti molecolari per influenzare razionalmente e manipolare le proprietà delle proteine. Poiché i residui di prolina svolgono un ruolo essenziale nella stabilità degli scaffold proteici, la nostra tecnologia potrebbe essere utile per comprendere le ragioni alla base dei deficit di ripiegamento delle proteine, che sono alla base di alcuni stati patologici nell'uomo.
Le alterazioni proteiche indotte dalle sostituzioni della prolina hanno implicazioni per l'ingegneria biotecnologica degli enzimi e offrono opportunità di miglioramento della traduzione o del ripiegamento delle proteine ribosomiali. Questo metodo non richiede attrezzature speciali e strumentazione costosa. Particolare attenzione deve essere prestata con le fasi del protocollo, in cui la prolina nativa viene impoverita dalle colture di E.coli prima dell'aggiunta di analoghi della prolina.
Per iniziare la produzione delle proteine fluorescenti con prolina nativa, inoculare 200 millilitri di mezzo NMM fresco in un pallone Erlenmeyer da due litri con due millilitri della coltura notturna. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale a 220 RPM per circa 3,5 ore. Durante l'incubazione, misurare la densità ottica a 600 nanometri in uno spettrofotometro ogni 30 minuti.
Quando la densità ottica raggiunge 0,7, ruotare verso il basso la sospensione cellulare e decantare delicatamente il surnatante in rifiuti. Quindi, lavare le cellule risospendendo in 50 millilitri di NMM ghiacciato senza amminoacidi o NMM senza prolina. Ruotare di nuovo le cellule e decantare il surnatante in rifiuti.
Successivamente, risospese il pellet cellulare mediante un delicato pipettaggio in 200 millilitri di NMM senza prolina e integrato con ampicillina in un pallone Erlenmeyer da due litri e incubare le cellule in uno shaker orbitale per 30 minuti per consentire il completo esaurimento della prolina. Dopo l'incubazione, aggiungere un volume appropriato di L-prolina o degli analoghi della prolina dalle soluzioni stock da 50 millimolari per ottenere una concentrazione finale di un millimolare nella sospensione cellulare. Successivamente, indurre l'espressione proteica bersaglio aggiungendo IPTG 500 micromolari da una soluzione madre monomolare.
Esprimere la proteina bersaglio durante la notte a 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale e misurare la densità ottica il giorno successivo. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione e decantare il surnatante in rifiuti. Quindi, lavare le cellule con un attento pipettaggio in 50 millilitri di tampone legante contenente il 10% di glicerolo.
Ruotare nuovamente le cellule, decantare il surnatante e conservare il pellet cellulare in un tubo da 50 millilitri a meno 20 o 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Prima di valutare l'emissione di fluorescenza, eseguire una SDS-PAGE per assicurarsi che la purezza del campione sia superiore al 95%, quindi regolare i campioni di ciascuna variante proteica purificata a una concentrazione di 0,3 micromoli, prendendo come riferimento il valore di assorbanza calcolato alla lunghezza d'onda appropriata. Assicurarsi che il volume approssimativo del campione finale sia di 200 microlitri.
Lasciare che i campioni diluiti si equilibrino a temperatura ambiente. Dopo un'ora, trasferire i campioni in una cuvetta di quarzo di un centimetro e misurare lo spettro di emissione di fluorescenza dei campioni utilizzando uno spettrometro a fluorescenza. Per indurre la denaturazione, diluire i campioni di ciascuna variante proteica venti volte aggiungendo i due microlitri di campioni 300 micromolari a 18 microlitri di tampone PBS 1,11X contenente urea molare 8,89 e DTT 5,56 millimolare.
Incubare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, diluire i campioni di 100 volte aggiungendo 1.980 microlitri di PBS contenenti DTT a cinque millimolari per indurre la rinaturazione e trasferire immediatamente 200 microlitri dei campioni in una cuvetta di quarzo di un centimetro. Inserire la cuvetta di quarzo in un apposito spettrometro a fluorescenza e monitorare il ripiegamento delle proteine acquisendo uno spettro di fluorescenza ogni tre secondi nell'arco di 30 minuti.
Trasferire i campioni di ripiegamento in tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri, quindi chiudere il coperchio e conservare i campioni a temperatura ambiente al buio per consentire il ripiegamento completo delle varianti EGFP. Dopo 24 ore, misurare l'emissione di fluorescenza dei campioni proteici ripiegati utilizzando la stessa lunghezza d'onda di eccitazione di prima per catturare l'endpoint temporale del recupero della fluorescenza. I pellet di cellule che esprimono proteine native e varianti contenenti S-fluoroprolina e deidroprolina avevano un tipico colore brillante a causa del cromoforo intatto.
Al contrario, le varianti contenenti R-fluoroprolina e difluoroprolina sono rimaste incolori, indicando un misfolding e la deposizione di proteine dispiegate nei corpi di inclusione. L'analisi SDS-PAGE ha verificato la presenza di proteine insolubili contenenti R-fluoroprolina. Al contrario, proteine native e varianti portatrici di S-fluoroprolina e deidroprolina sono state trovate nelle frazioni solubili.
Nell'analisi di cromatografia liquida/spettrometria di massa, ogni sostituzione di prolina con S-fluoroprolina ha prodotto uno spostamento positivo di 18-dalton per residuo di prolina, mentre la sostituzione con deidroprolina ha prodotto uno spostamento negativo di due dalton per residuo. Negli spettri di assorbimento ed emissione della luce, l'assorbanza del cromoforo è stata trovata a 488 nanometri per EGFP e 493 nanometri per NowGFP. In KillerOrange, la regione di assorbanza del cromoforo comprendeva due bande corrispondenti a due possibili stati configurazionali e di carica del cromoforo complesso.
Inoltre, gli spettri di fluorescenza registrati dopo l'eccitazione alle corrispondenti lunghezze d'onda di assorbanza massima implicavano che gli analoghi non alteravano l'ambiente chimico dei cromofori. Negli esperimenti di ripiegamento, la fluorescenza nativa del cromoforo EGFP si è parzialmente recuperata, sebbene la fluorescenza specifica del triptofano fosse più grande dopo la rinaturazione. Un comportamento simile è stato osservato per la variante contenente deidroprolina.
Nella S-fluoroprolina contenente EGFP, un risultato simile è stato osservato con un'eccitazione di 295 nanometri, mentre la fluorescenza si è ripresa in misura molto maggiore a 488 nanometri. Solo le varianti EGFP hanno mostrato una cinetica di ripiegamento rapido con recupero delle emissioni di triptofano due volte più veloce rispetto all'emissione di cromoforo. Devono essere utilizzate colture batteriche fresche con mezzi di crescita adeguati.
Anche le tecniche sterili e il monitoraggio regolare della crescita della coltura sono prerequisiti importanti per il successo dell'esperimento. Questo metodo è applicabile all'ingegneria proteica, in quanto consente di studiare il ruolo di altri amminoacidi canonici. Per questo, sono necessari ceppi di E.coli auxotrofici adatti e analoghi di amminoacidi.
La spettrometria di massa di proteine intere è necessaria come prova analitica per confermare l'incorporazione di analoghi aminoacidici non canonici. Il metodo SPI per incorporare analoghi della prolina ci consente di manipolare direttamente la spina dorsale proteica e offre vantaggi per la progettazione razionale e la produzione facilitata di proteine attraverso la stabilizzazione globale e il miglioramento della traduzione o del ripiegamento ribosomiale.
