Il protocollo qui descritto consente di identificare condizioni che possono avere un impatto significativo sulla persistenza batterica in modo ad alta produttività. Questo metodo è facilmente adattabile allo schermo per varie aree, come pannelli farmacologici, librerie geniche e altro ancora. Poiché il metodo comprende varie sottofase, che devono essere condotte simultaneamente, la dimostrazione visiva può aiutare i ricercatori a gestire i loro tempi per ottenere risultati precisi.
Inizia preparando le colture cellulari di microarray. Trasferire 250 microlitri di celle di fase esponenziali a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Quindi mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di microarray contenente varie sostanze chimiche. I microarray possono anche essere generati manualmente seguendo il metodo descritto nel manoscritto testuale.
Coprire la piastra di microarray con una membrana del soffitto permeabile al gas e incubarla in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 250 RPM per 24 ore. Per realizzare piastre di dosaggio più persistenti, preparare 25 millilitri di mezzo LB modificato contenente cinque microgrammi per millilitro di Ofloxacina in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e trasferire questo mezzo in un serbatoio sterile. Trasferire 190 microlitri del mezzo LB modificato in ogni pozzo di una piastra generica piatta inferiore di 96 poggiasto.
Dopo l'incubazione 24 ore su 24, rimuovere il microarray dallo shaker e trasferire 10 microlitri di colture cellulari dal microarray ai pozzi della piastra di dosaggio persister contenente mezzo LB modificato con Ofloxacina. Prendi 10 microlitri di sospensioni cellulari dalla piastra del saggio persister e diluila serialmente tre volte in 290 microlitri di soluzione PBS utilizzando una piastra rotonda inferiore di 96 pozza e una pipetta multicanale. Quindi individuare 10 microlitri di tutte le sospensioni cellulari diluite in serie su piastre di agar fresche senza antibiotici.
Coprire la piastra di dosaggio persister con una membrana del soffitto permeabile al gas e incubarla in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 250 RPM per sei ore. Dopo l'incubazione di sei ore, ripetere la diluizione seriale e l'avvistamento sulle piastre di agar. Incubare le piastre di agar per 16 ore a 37 gradi Celsius.
Quindi conta le unità di formazione della colonia o CNO. Utilizzare i livelli di CFU prima e sei ore dopo il trattamento antibiotico per calcolare la frazione più persistente in ogni pozzo. Il CFU conta prima del trattamento OFX aiuta anche a valutare gli effetti delle osmoliti sulla vitalità dell'e coli.
Trasferire 250 microlitri di cellule di fase esponenziale a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato contenente l'osmolite identificata dallo screening del microarray. Incubare il pallone in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il pallone dallo shaker e trasferire 250 microlitri della coltura cellulare a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 millilitri.
Aggiungere 25 microlitri di soluzione di stock di Ofloxacina alla sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del saggio. Incubare il pallone in uno shaker a 37 gradi Celsius e 250 giri/min. Ad ogni ora durante il trattamento, incluso un punto di tempo prima dell'aggiunta di Ofloxacina, trasferire un millilitro della coltura del saggio dal pallone a un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri e centrifugarlo a 17.000 volte G per tre minuti.
Rimuovere 950 microlitri di supernatante e lavare le cellule tre volte con 950 microlitri di PBS. Dopo il lavaggio finale, sospendere di nuovo il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione PBS. Prendi 10 microlitri della sospensione cellulare e diluila serialmente sei volte con 90 microlitri di PBS all'interno di una piastra inferiore ben rotonda da 96.
Individua 10 microlitri delle sospensioni cellulari diluite su una piastra di agar priva di antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 microlitri di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16 ore, quindi contare i CFC.
Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. La prima colonna è il gruppo di controlli. La seconda colonna ha cellule coltivate in nitrato di sodio millimolare da 100 millimolari e la terza colonna contiene cellule coltivate in nitrato di sodio millimolare da 60 millimolare.
Per semplicità, qui si concentrano solo due osmoliti. Qui viene mostrata una rappresentazione grafica dei dati CFU delle piastre e delle frazioni persistenti delle colture cellulari testate in 96 piastre di pozzo. Per calcolare le frazioni, i conteggi dei persistenti sono stati normalizzati al conteggio cellulare ottenuto prima del trattamento antibiotico.
Per generare curve di uccisione byfasica, le cellule sono state coltivate in 25 millilitri di mezzo LB modificato con le osmoliti indicate e i mastri sconcertati per 24 ore, quindi trasferite a mastri di dosaggio persistenti per l'enumerazione persister. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che individuare le celle sulla piastra di agar richiede un'intensa attività e richiede messa a fuoco. Un errore durante la fase può portare a contaminazione incrociata tra le condizioni in esame.
Quindi è importante esercitarsi a individuare più campioni contemporaneamente prima dell'esperimento. Seguendo questo protocollo, pannelli di farmaci e librerie cellulari mutanti possono essere schermati per studiare gli impatti sulla persistenza. Con questo screening, abbiamo identificato una serie di osmoliti e condizioni PS che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.
